李 煜，黎小斌，曹曉靜

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510105）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）指女性在從初潮開始至40 歲之前出現(xiàn)閉經(jīng)3 個月或更長時間，促性腺激素水平升高（至少兩次間隔1 個月FSH＞40 IU/L）和E2水平降低（低于50 pg/mL）［1］。其病因復(fù)雜且尚未完全明確，現(xiàn)代研究提示常見病因包括染色體異常和基因變異、醫(yī)源性因素（包括手術(shù)及放化療［2］）、自身免疫因素、不良環(huán)境或不良生活方式等，是早發(fā)型卵巢功能不全的終末階段［3］。隨著現(xiàn)代女性生活節(jié)奏的加快及工作壓力的增大，近年來POF 的患病率呈上升趨勢且發(fā)病年齡呈年輕化發(fā)展，其帶來的并發(fā)癥如骨質(zhì)疏松、心血管疾病發(fā)生率增加、陰道干澀不適、泌尿系統(tǒng)癥狀等給現(xiàn)代女性的生理和心理都帶來了不容忽視的影響。早發(fā)現(xiàn)并對其進行治療，可以減緩甚至于逆轉(zhuǎn)POF的發(fā)生、發(fā)展。

祖國醫(yī)學(xué)中并無POF 這一病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)多歸屬于“血枯經(jīng)閉”、“月經(jīng)過少”、“不孕”等范疇。腎藏精，主生殖，卵泡的發(fā)育需要腎精的滋養(yǎng)，腎陽則是促卵排出的動力。故腎虛被認為是卵巢早衰的主要病機。二仙湯出于《中醫(yī)方劑臨床手冊》，是張伯訥教授為更年期綜合征、更年期高血壓而創(chuàng)制的經(jīng)方。方中有益腎壯陽，補益精血的仙茅、淫羊藿（仙靈脾）、巴戟天，有瀉腎火、滋腎陰的黃柏、知母，配合溫潤養(yǎng)血、調(diào)沖任的當歸。此方補陽藥和滋陰藥同用，共奏溫腎填精、調(diào)和沖任之效。近年來不乏對二仙湯治療卵巢早衰的臨床觀察及研究，均表示該方對卵巢早衰的療效確切［4］，并有助于改善患者性激素水平。但關(guān)于二仙湯藥理作用的研究相對較少，對POF 的有效成分、作用靶點和機制更是不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（network pharmacology，NP）由英國藥理學(xué)家Andrew L. Hopkins 在2007 年率先提出。NP 是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論體系，從生物網(wǎng)絡(luò)的角度闡明敘述疾病發(fā)生、發(fā)展的過程，通過選取特定信號節(jié)點對藥物進行多靶點藥物分析，從整體認識藥物與機體的相互作用，進而提高藥物療效、降低毒副作用以及指導(dǎo)新藥的發(fā)現(xiàn)。中藥復(fù)方指兩種或兩種以上的中藥混合制劑，是以中醫(yī)基礎(chǔ)理論為指導(dǎo)，根據(jù)復(fù)雜的配伍原則形成的，其中涉及多個藥效物質(zhì)的活性成分、靶點及通路等信息，故不能單憑方中的任一味藥效的強弱來判斷方劑的有效性。正因其整體性、系統(tǒng)性地構(gòu)建“藥物-靶點-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)體系來展示中藥復(fù)方的作用機制，與中醫(yī)從整體進行辨證施治的原則不謀而合，目前已被廣泛運用于方劑的研究中。因此，本研究擬從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接的角度闡釋二仙湯治療卵巢早衰的作用機制，并尋找可能的作用靶點，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 二仙湯藥物活性成分及靶點的篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP），以O(shè)B（oral bioavailability，OB）≥30%、DL（drug-likeness，DL）≥0.18 為篩選條件，對二仙湯中的6 味中藥的活性成分和靶點進行檢索。再通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Uniprot）將物種限定為人，進而對各個靶點對應(yīng)的基因進行校正并獲得標準化的名稱簡寫。

1.2 卵巢早衰疾病靶點的篩選

以“Premature ovarian failure”為關(guān)鍵詞，在基因名片數(shù)據(jù)庫（GeneCards）、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）、藥物基因組學(xué)知識庫（PharmGkb）、Drug-Bank 數(shù)據(jù)庫等相關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，去除重復(fù)及假陽性的靶點后取并集，得到疾病靶點基因的數(shù)據(jù)集合。

1.3 二仙湯對卵巢早衰作用靶點的預(yù)測

將卵巢早衰疾病基因與二仙湯藥物共同靶點用Venn R 進行對比分析，將疾病與藥物的交集靶點用Venn 圖展現(xiàn)出來，以交集靶點作為橋梁構(gòu)建中藥復(fù)方的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.4 二仙湯“活性成分-靶點”中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藥物活性成分信息、交集靶點基因以及POF靶點基因?qū)隒ytoscape 3.8.0 軟件，構(gòu)建繪制“活性成分-靶點”的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，展示二仙湯中活性成分與POF 疾病基因的相關(guān)性大小。

1.5 卵巢早衰疾病基因與二仙湯藥物共同靶點的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI）的構(gòu)建

將1.3 中獲得的交集靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，建立PPI 網(wǎng)絡(luò)。再將所獲取的信息以tsv 形式導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件中根據(jù)度值（Degree）進行精簡分析，構(gòu)建PPI 核心網(wǎng)絡(luò)。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析

將基因簡寫（symbol）轉(zhuǎn)化為基因ID（EntrezID），再運用R 軟件對“藥物-疾病”基因進行GO 富集和KEGG 通路富集分析，并繪制相關(guān)的作用通路圖。

1.7 活性成分與靶點基因的分子對接驗證

在有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（PubChem）中獲得二仙湯對卵巢早衰相關(guān)靶點活性成分2D 結(jié)構(gòu)，運用ChemOffice 轉(zhuǎn)化為3D 結(jié)構(gòu)。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（PDB）中獲得靶點的3D 結(jié)構(gòu)。運用Py-MOL 軟件完成對蛋白受體結(jié)構(gòu)去水分子及無效小分子配體等處理。最后運用Vina 進行分子對接，獲得二仙湯中活性分子與受體蛋白的結(jié)合關(guān)系和結(jié)合位置。

2 結(jié)果

2.1 二仙湯有效活性成分的篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索出二仙湯中所有藥物共728 個化合物，其中巴戟天174 種，當歸125 種，黃柏140 種，仙 茅78 種，淫 羊 藿130 種，知 母81 種，經(jīng)OB、DL 值篩選得到104 個有效化學(xué)成分，其中巴戟天20 種，當歸2 種，黃柏37 種，仙茅7 種，淫羊藿23種，知母15 種。經(jīng)過刪除無作用靶點的化合物及重復(fù)靶點后，共獲得91 個有效活性成分，見表1。

表1 二仙湯中藥物活性成分Tab 1 Active ingredients in Erxian Decoction

續(xù)表

2.2 卵巢早衰疾病基因的篩選

在GeneCards、OMIM、PharmGkb、DrugBank 等數(shù)據(jù)庫中以“premature ovarian failure”為關(guān)鍵詞進行查找，其中GeneCards 數(shù)據(jù)庫檢索的基因以relevance score＞1.0 過濾。將4 個數(shù)據(jù)庫查找檢索到的基因經(jīng)過取并集去重復(fù)等處理后，共得到3 882 個POF 的基因靶點，繪制Venn 圖，見圖1。

圖1 卵巢早衰疾病基因Fig 1 Premature ovarian failure disease genes

2.3 “藥物靶點-疾病基因”交集作用靶點的預(yù)測

通過Rx64 4.0.4 對二仙湯有效活性成分對應(yīng)的基因靶點以及卵巢早衰疾病基因靶點進行Venn 分析，最終得到184 個直接或間接的顯效靶點基因交集，見圖2，包括NR3C1、JUN、RB1、TP53、FOS、CDKN1A、TNF 等靶點。對圖2 進行分析計算后得到二仙湯治療POF 的靶點基因映射率為85.91%，表明其具有明顯特異性。

圖2 二仙湯與卵巢早衰的184 個交集靶點Venn 圖Fig 2 Venn diagram of 184 intersection targets between Erxian Decoction and premature ovarian failure

2.4 “活性成分-靶點基因”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運用Cytoscape 軟件構(gòu)建“二仙湯各藥物-卵巢早衰疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。度值（degree）越大，其在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用越大。由圖3 可見該網(wǎng)絡(luò)由182 個潛在靶點基因和68 個活性成分組成，其中紅色為巴戟天中活性成分，淺綠色為黃柏中活性成分，紫色為仙茅中活性成分，藍色為淫羊藿中活性成分，深綠色為知母中活性成分。每個潛在的靶點基因都與多個活性成分相互作用，體現(xiàn)了二仙湯是通過多途徑、多成分、多靶點來干預(yù)治療卵巢早衰。

圖3 二仙湯治療卵巢早衰“藥物-成分-靶點-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Visual network diagram of"drug-ingredient-target-disease" for treating premature ovarian failure with Erxian Decoction

2.5 二仙湯與POF 交集靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將通過Venn R 分析后的184 個交集基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫，將物種設(shè)置為Homo sapiens，并設(shè)置medium confidence 提高至0.900，去除游離節(jié)點，得到“二仙湯-卵巢早衰”的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。該網(wǎng)絡(luò)由164 個節(jié)點（node）、753 條邊（edge）構(gòu)成，平均節(jié)點度值為9.19。PPI 網(wǎng)絡(luò)圖再一次表明二仙湯的治療是通過多途徑、多成分、多靶點作用于POF 的。

圖4 “藥物-疾病”交集靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig 4 Protein interaction network diagram of"drug-disease" intersection targets

將所獲取的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖以tsv 的形式導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件中，利用CytoNCA 對節(jié)點進行中心性（betweenness centralities，BC）、接 近 中 心 性（closeness centralities，CC）、度中心性（degree centralities，DC）、特征向量中心性（eigenvector centralities，EC） 、局 部 邊 連 通 性（local average connectivity-based centralities，LAC）、網(wǎng) 絡(luò) 中 心 性（network centralities，AC）數(shù)值計算兩次，選擇數(shù)值大于中位值的節(jié)點構(gòu)建PPI 核心圖，見圖5。最終的核心PPI 由15 個節(jié)點、73 條邊構(gòu)成，平均節(jié)點度值為9.73，根據(jù)度值由大到小排列：NR3C1、JUN、RB1、TP53、FOS、CDKN1A、ESR1、AKT1、MAPK1、TNF、CCND1、RELA、MAPK14、MYC、MAPK8，以上核心靶點被認為在治療卵巢早衰是發(fā)揮著主要作用。

圖5 經(jīng)Cytoscape 軟件可視化的蛋白互作核心圖Fig 5 Core map of protein interaction visualized by Cytoscape software

2.6 GO 富集注釋

先運用R 軟件將靶點基因名稱轉(zhuǎn)換為靶點基因ID。對二仙湯治療POF 的核心靶點基因進行GO 富集分析并繪制氣泡圖，橫坐標為基因比例，縱坐標為富集在每個GO 上的基因數(shù)目，富集結(jié)果的-log10（Q value）值以顏色表示，氣泡大小表示基因的Count 值，見圖6。

圖6 二仙湯治療卵巢早衰GO 富集氣泡圖Fig 6 GO enrichment bubble chart of Erxian Decoction in the treatment of premature ovarian failure

生物過程（biological process，BP）的富集結(jié)果提示交集基因主要參與對藥物的反應(yīng)、對金屬離子的反應(yīng)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、細胞對化學(xué)應(yīng)力的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)等生物反應(yīng)。

細胞定位（cellular component，CC）的富集結(jié)果提示交集基因主要分布在細胞膜筏、細胞膜微結(jié)構(gòu)域、細胞膜區(qū)域、細胞外膜、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物等細胞部位。

分子功能（molecular function，MF）的富集結(jié)果提示交集基因主要通過與DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、RNA 聚合酶Ⅱ-特異性DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、泛素蛋白連接酶、核受體的結(jié)合發(fā)揮其作用。

體現(xiàn)了二仙湯可能是通過調(diào)控多個GO 功能來治療卵巢早衰。

2.7 KEGG 通路富集分析

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示共獲得174 條信號通路，在所富集的通路中查找與POF 相關(guān)通路卵巢類固醇生成繪制通路圖，見圖7。設(shè)置具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，若不符合用Q value 校正）篩選出前29 條信號通路，繪制氣泡圖進行可視化分析。氣泡大小代表富集的基因個數(shù)；氣泡顏色代表-log10（Q value）值，見圖8。圖中提示主要涉及的信號通路有人巨細胞病毒感染通路、皰疹病毒感染通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE 信號通路、液體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化通路、乙型肝炎通路等?？梢员砻鞫蓽ㄟ^多通路協(xié)同作用于卵巢早衰。選取圖中相關(guān)性較大的糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE 信號通路繪制通路圖，見圖9。

圖7 二仙湯Ovarian Steroidogenesis 信號通路潛在靶基因KEGG 分析圖Fig 7 KEGG analysis of potential target genes of ovarian steroidogenesis signaling pathway in Erxian Decoction

圖8 二仙湯治療卵巢早衰的KEGG 信號通路氣泡圖Fig 8 Bubble diagram of KEGG signaling pathway in the treatment of premature ovarian failure with Erxian Decoction

圖9 二仙湯AGE-RAGE 信號通路潛在靶基因的KEGG 通路分析Fig 9 KEGG pathway analysis of potential target genes of Erxian Decoction AGE-RAGE signaling pathway

2.8 活性成分與靶點基因的分子對接模擬

根據(jù)度值及查詢POF 基因研究相關(guān)文獻，篩選出PPI 核心網(wǎng)絡(luò)中的4 個核心靶點基因，通過二仙湯“活性成分-靶點基因”網(wǎng)絡(luò)選取其4 個主要活性成分和進行分子對接驗證，對接結(jié)果見表2。表中結(jié)合能（affinity）越小，配體與受體的結(jié)合越牢固。一般認為當Affinity＜—4.25 kcal/mol 時說明配體與受體有一定的結(jié)合活性，Affinity＜—5.0 kcal/mol時有較好的結(jié)合活性，Affinity＜—7.0 kcal/mol 時有強烈的結(jié)合活性。分析結(jié)果顯示，二仙湯中主要活性成分與疾病核心靶點的結(jié)合能介于—5.3 kcal/mol 至—9.8 kcal/mol 之間，說明方中主要的活性成分與疾病的核心基因靶點具有較好的結(jié)合活性，本次預(yù)測的結(jié)果較可靠。

表2 主要活性成分核心靶點和分子對接結(jié)果Tab 2 Core targets and molecular docking results of main active ingredients

運用PyMOL 軟件對靶點基因結(jié)合活性最強有效成分對接結(jié)果進行可視化，結(jié)果見圖10。

圖10 主要活性成分與核心靶點的對接模式圖Fig 10 The docking mode of the main active ingredients and the core targets

3 討論

卵巢作為產(chǎn)生并排出卵泡、分泌甾體激素的生殖器官，在女性生殖及內(nèi)分泌系統(tǒng)中均扮演著重要角色。而POF 是臨床上常見的生殖內(nèi)分泌疾病，在我國的發(fā)病率為1%～3%［5］，并且隨著現(xiàn)代生活壓力增大和生活節(jié)奏增快，其發(fā)病率呈上升趨勢。POF 遠期對心血管、骨骼、免疫及心理等多個系統(tǒng)的影響不容小覷［6］。POF 病因和發(fā)病機制至今仍無法完全明確。近年來研究表明POF 發(fā)生、發(fā)展的病因主要與遺傳因素、免疫、醫(yī)源性和生活方式相關(guān)。其中遺傳學(xué)因素和免疫因素起著重要作用，基因異常表達或信號通路異常與POF 的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)首選激素替代療法治療POF，雖然見效快，但會增加子宮內(nèi)膜癌［7］、乳腺癌［8］等激素依賴型疾病的發(fā)生風(fēng)險。而且停藥后癥狀容易反復(fù)，無法從根本上解決內(nèi)分泌紊亂的情況。研究分析［9］，中醫(yī)藥治療可以通過調(diào)控相關(guān)基因表達改善免疫狀態(tài)，干預(yù)生殖內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)整性激素水平，改善卵巢形態(tài)及血液循環(huán)進而恢復(fù)部分功能，配合激素治療還可減輕其不良反應(yīng)。二仙湯全方共奏滋腎陰、降相火、調(diào)沖任、平陰陽之效，無論是在臨床或是實驗研究方面都取得了一定的成果。陶仕英等［10］發(fā)現(xiàn)二仙湯能夠上調(diào)卵巢中卵泡顆粒細胞ERβ 的表達，改善卵巢功能及內(nèi)分泌狀態(tài)，促使卵泡發(fā)育排出。還能參與整個女性的生殖周期，主要是通過作用于下丘腦-垂體-卵巢軸，對下丘腦促性腺激素的合成分泌進行反饋調(diào)節(jié)實現(xiàn)的［11］。本研究通過數(shù)據(jù)庫及軟件，從活性成分、靶點基因以及信號通路的角度對二仙湯治療卵巢早衰的作用機制進行分析闡述。

根據(jù)“活性成分-靶點基因”網(wǎng)絡(luò)圖中可見，二仙湯中起作用的主要活性成分共68 個，其中槲皮素是存在于人類飲食中有生物活性的一種多黃酮類化合物，可調(diào)節(jié)許多與疾病進展相關(guān)的細胞內(nèi)外信號通路［12］，是流行病學(xué)家認為的最有望應(yīng)用于預(yù)防和治療疾病的天然化合物［13，14］。黃長盛等［15］實驗發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠促進各級卵泡的發(fā)育，其通過促進顆粒細胞增殖，增加顆粒細胞中雌激素的分泌來改善卵巢功能。槲皮素還能夠抑制TLR/NF-κB 信號通路，降低血胰島素水平和白介素-6、腫瘤壞死因子等炎性因子水平，改善胰島素抵抗和炎癥狀態(tài)［16］。木犀草素、山柰酚均為黃酮類化合物，能夠通過抑制肝臟、脂肪組織中的11β-HSD 酶，避免胰島素抵抗的發(fā)生［17］。卵巢上分布著胰島素受體，胰島素抵抗狀態(tài)能夠進一步影響卵巢功能。山柰酚可通過激活A(yù)MPK/Nrf2/HO-1 信號通路，降低氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)［18］。豆甾醇作為植物甾醇，與雌激素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有相似之處，而卵巢早衰患者體內(nèi)的雌激素水平較正常女性低，推斷可能是通過類雌激素作用改善POF 患者的卵巢功能。另外，度值較高的活性成分還有脫水淫羊藿素、谷固醇、異延胡索單酚堿、豆甾醇、薯蕷皂苷配基等，表明這些物質(zhì)在改善卵巢功能中起主要作用，可能是二仙湯治療POF 的有效成分，但由于對這幾種成分的研究較少，故作用機制尚不明確。

通過PPI 核心圖得到RB1、TP53、CDKN1A、ESR1、AKT1、MAPK1、TNF 等15 個與卵巢早衰疾病關(guān)系較為密切的靶點基因。

CDKN1A基因參與細胞周期調(diào)控，Geng 等［19］認為CDKN1A基因的異常轉(zhuǎn)錄使卵巢顆粒細胞被抑制，導(dǎo)致卵泡成熟異常，進而影響卵巢功能。ESR1，即雌激素受體alpha 基因，能夠介導(dǎo)雌激素發(fā)揮生物學(xué)作用。有研究提出ESR1 因其中的相rs2234693 與POF 相關(guān)性大，所以相較于其他基因更 應(yīng) 被 關(guān) 注［20］。一 項 對155 例 中 國POF 患 者 的 研究發(fā)現(xiàn)患病組ESR1 基因中的PvuⅡ位和XbaⅠ位多態(tài)性的發(fā)生率明顯高于對照組，是POF 潛在的危險因素［21］。卵巢早衰患者存在免疫功能異常，相關(guān)調(diào)控因子水平下降，卵巢組織萎縮，顆粒細胞分泌受到抑制，功能下降［22］。熊鹿等［23］觀察研究表示POF 患者的TNF-α 水平較正常女性低。王雪金等［24］提 出POF 的 發(fā) 生 可 能 與TNF-a-308G/A 基 因多態(tài)性有關(guān)，是發(fā)病易感基因。TP53表達的轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)節(jié)多個基因的表達，進而調(diào)控細胞周期、維持基因組穩(wěn)定性、誘導(dǎo)細胞分化和凋亡［25］。AKT基因是調(diào)控細胞周期和凋亡的重要基因，胰島素等因子可以激活A(yù)KT信號通路。研究表明，卵巢中PI3K/AKT/mTOR 信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常與胰島素水平缺陷及胰島素抵抗狀態(tài)相關(guān)，該通路參與細胞增殖和炎癥反應(yīng)發(fā)生，AKT 基因是通路中的關(guān)鍵靶點［26］。此 外，本 研 究 分 析 中 提 示NR3C1、JUN、FOS、CCND1、RELA、MAPK14、MYC、MAPK8等基因與POF 相關(guān)性亦較密切，其作用有待更加深入的研究以明確其作用機理，為預(yù)防及治療POF 提供新思路。

基于KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，二仙湯治療POF 的潛在作用機制處理直接作用于卵巢類固醇生成通路外，還包括PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE 信號通路等與卵巢早衰的發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號通路。PI3K-Akt 信號通路是細胞中經(jīng)典的信號通路，該通路可通過調(diào)控下游分子的活性對細胞周期進行中心調(diào)控作用。作為POF 的重要通路之一，PI3K-Akt通路參與原始卵泡的發(fā)育、顆粒細胞的增殖凋亡以及卵母細胞的生長過程［27］。PI3K-Akt 下游通路中的Fox、mTOR 表達異?？蛇^早、過度激活原始卵泡，導(dǎo)致卵泡池過度消耗，從而降低卵巢儲備，加速POF［28，29］。所以該信號轉(zhuǎn)錄過程異常會導(dǎo)致原始卵泡生長發(fā)育出現(xiàn)缺陷，顆粒細胞分化異常，進而造成卵巢功能下降的病理狀態(tài)［30］。MAPK 信號通路介導(dǎo)細胞外信號到細胞內(nèi)的反應(yīng)，在卵泡生長發(fā)育的過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。研究分析［31］MAPK信號通路與顆粒細胞膜上的特異性受體結(jié)合后，能夠調(diào)節(jié)女性性激素的合成分泌，調(diào)控卵母細胞的增殖、凋亡，進而抑制POF。晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）及其受體協(xié)同的AGEs-RAGE 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是近年的研究熱點之一，該通路通過激活其下游信號通路，表達并釋放大量生長因子、炎性因子等，誘發(fā)氧化反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，最終引起細胞及組織的損傷［32］。另外有研究發(fā)現(xiàn)在肝癌、胃癌、肺癌等惡性腫瘤患者中，RAGE 異常表達有所增加，這提示該通路可能與腫瘤細胞的增殖、凋亡、遠處轉(zhuǎn)移及腫瘤分期密切相關(guān)［33］。流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化通路是通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞中基因和蛋白的表達［34］，改變血管內(nèi)皮細胞的分化、形態(tài)以及血管壁通透性，進而影響血流動力學(xué)。由此推斷該通路可能是通過影響卵巢局部血供情況，導(dǎo)致卵巢功能異常，進而發(fā)展為POF。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度，將生物信息學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)中醫(yī)理論結(jié)合，分析二仙湯復(fù)方中藥的化學(xué)成分、有效活性成分及靶點，疾病的靶點基因，并且運用相關(guān)軟件分析與構(gòu)建作用網(wǎng)絡(luò)及通路。篩選出的活性成分主要有槲皮素、木犀草素、山柰酚、脫水淫羊藿素、谷固醇等，其中TP53、ESR1、AKT1、MAPK1、TNF、CDKN1A等靶點基因通過PI3K-Akt、MAPK 等信號通路對原始卵泡的發(fā)育和卵母細胞的生長進行調(diào)控，以及通過體內(nèi)炎癥因子的表達，調(diào)整卵巢局部炎癥反應(yīng)等。綜上，可以得到二仙湯通過多成分、多靶點及多通路的協(xié)同作用治療POF，為臨床上對二仙湯治療卵巢早衰的進一步深入研究提供一定的思路及依據(jù)。