王妍菲，楊慧娟，李杭霖，趙雯雯，王夢(mèng)慈，費(fèi)成璆，張繼強(qiáng)

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎病科，安徽 蚌埠 233099）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是最嚴(yán)重的糖尿病微血管并發(fā)癥之一，也是全球終末期腎臟病的主要病因［1］，其發(fā)病率高，危害性大，在全球范圍內(nèi)造成了沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。截至目前，針對(duì)DN 的防治手段仍舊停留在調(diào)節(jié)飲食，控制血糖，降低血壓及抑制腎素-醛固酮系統(tǒng)（RAS）的激活上，大多數(shù)DN 患者難逃終身透析的命運(yùn)［2］。DN 發(fā)病原因多樣，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚未明確，針對(duì)性治療手段缺乏，故探索DN 發(fā)病機(jī)制，研發(fā)新的治療藥物尤其重要。

小檗堿（又名黃連素）是從中草藥黃連中提取分離得到的一種具有抗菌作用的異喹啉生物堿，在降糖、調(diào)脂、改善胰島抵抗、增加胰島素敏感性、抗擊氧化損傷等方面具有良好生物效應(yīng)［3］，在治療糖尿病及糖尿病并發(fā)癥上的應(yīng)用機(jī)制尚未被完全闡明。研究報(bào)道，過(guò)度激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（ERS）可以啟動(dòng)細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑，參與多種類(lèi)型腎臟細(xì)胞損傷的過(guò)程。研究表明小檗堿可通過(guò)抑制過(guò)度激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來(lái)減輕ERS 啟動(dòng)的細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑，從而發(fā)揮對(duì)神經(jīng)［4］、心血管［5-7］、胃腸道［8］等的保護(hù)作用。本研究以小檗堿在DN 中的作用及機(jī)制為研究目標(biāo)，明確小檗堿是否能通過(guò)影響DN ERS 來(lái)減輕腎臟組織損傷，為小檗堿的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，并為早期DN 防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD 大鼠（8 周，180～200 g，購(gòu)于蚌埠醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及主要儀器

鹽酸小檗堿（純度≥97%，B832574，合肥睿捷生物科技有限公司）；鏈脲佐菌素（STZ，純度≥98%，S8050，購(gòu)于北京索萊寶公司）；尿蛋白定量試劑盒（C035-2-1，南京建成生物工程研究所）；兔抗大鼠轉(zhuǎn)錄因子6（DF6009）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）（DF6025）、肌醇需求酶1（IRE1）（DF7709）、蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激酶（PERK）（AF5304）、半 胱 天 冬 酶3（Caspase3）（AF6311）、Nephrin（DF7501），上述抗體均購(gòu)于Affinity；通用型二抗試劑盒（Zsbio）；DAB 顯色試劑盒（Zsbio）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)

24 只大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)取6 只做正常組（NC 組），予普通飼料喂養(yǎng)。余18 只予高糖高脂飼料（配方參考：10%豬油，20%白糖，2.5%膽固醇，0.5%膽酸鈉，67%基礎(chǔ)飼料）喂養(yǎng)4周后聯(lián)合腹腔注射STZ 45 mg/kg［9］進(jìn)行糖尿病大鼠造模，3 d 后尾靜脈采血測(cè)隨機(jī)血糖≥16.8 mmoL/L 的為糖尿病大鼠造模成功（本實(shí)驗(yàn)造模18只，成功16 只，成模率88.9%）。造模成功的16 只大鼠，繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)，2 周后測(cè)尿蛋白≥30 mg/24 h 為DN 大鼠造模成功。選取成模狀態(tài)良好的12 只，隨機(jī)分為模型組（DN 組）和小檗堿干預(yù)組（DN+BBR 組）（n=6）。其中DN+BBR 組予BBR 200 mg·kg-1·d-1［9］灌 胃 治 療，NC 組 及DN 組 予 以 同計(jì)量的羧甲基纖維素鈉，灌胃6 周。干預(yù)期間，每周稱(chēng)重大鼠并記錄數(shù)據(jù)，NC 組予普通飼料喂養(yǎng)，DN組及DN+BBR 組予高糖高脂飼料喂養(yǎng)。密切關(guān)注大鼠飲食水、精神及活動(dòng)狀態(tài)、毛發(fā)色澤等情況。實(shí)驗(yàn)室采取12 h 明暗交替，模擬日光照射。

1.4 生化指標(biāo)檢測(cè)

最后一次灌胃干預(yù)后，稱(chēng)量大鼠體重并記錄數(shù)據(jù)。禁食不禁水，代謝籠收集大鼠24 h 尿液，根據(jù)尿蛋白定量試劑盒（CBB 法）檢測(cè)并按公式計(jì)算各大鼠24 h 尿蛋白（24 h Upro）。腹腔注射10%水合氯醛（0.5 mL/100 g）麻醉大鼠并將其固定于手術(shù)臺(tái)，腹主動(dòng)脈采血，全自動(dòng)生化分析儀分析并記錄各組大鼠空腹血糖（FBG）、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）等。

1.5 組織染色

留取大鼠雙側(cè)腎臟組織，去除表面包膜，取部分腎臟組織，用2.5% 戊二醛固定，備用于透射電子顯微鏡檢測(cè)。其余腎臟組織采用4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，而后依次將各切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各20 min，無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ、75%酒精各5 min，流水緩慢沖洗幾遍，脫蠟至水。進(jìn)行HE、PAS、Masson 染色，光鏡下觀察各大鼠腎組織病理改變，采集圖像并進(jìn)行分析。

1.6 透射電子顯微鏡

新鮮組織快速取樣2～3 mm2，PBS 漂洗表面血跡污漬，投入2.5%戊二醛（電鏡專(zhuān)用固定液）中，室溫固定2 h 后轉(zhuǎn)至4 ℃保存。0.1 mol/L 磷酸緩沖液PB（pH7.4）配制1%鋨酸進(jìn)行后固定（室溫避光1～2 h）。 梯度脫水處理。乙酸異戊酯置換100%乙醇，提高干燥效率。 臨界點(diǎn)干燥儀干燥樣本。離子濺射儀樣品臺(tái)上噴金鍍膜，顯微鏡下采集圖像并進(jìn)行分析。

1.7 免疫組織化學(xué)染色

依次過(guò)3 道二甲苯，3 道乙醇，切片沖洗干凈透明后，進(jìn)行抗原高壓修復(fù)，免疫組化筆圈定組織并滴加3% H2O2，室溫孵育20 min，37℃，孵育一抗1 h（CHOP：1：100、PERK：1：100、IRE1：1：300、ATF6：1：100、Nephrin：1：200、Caspase-3：1：100），37 ℃孵育二抗20 min，DAB 顯色，襯染，分化，水洗，藍(lán)化，脫水、透明、封片。顯微鏡下采集圖像并進(jìn)行分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小檗堿對(duì)DN 大鼠一般狀況及腎功能的影響

與NC 組相比，DN 組大鼠精神倦怠，活動(dòng)度低，毛發(fā)黯淡無(wú)光，體重不增甚或減輕，飲食水量明顯增加，尿量增加，偶有稀便，血清及尿液生化檢測(cè)顯示Scr、BUN、24 h Upro 顯著升高（P＜0.05），大鼠腎指數(shù)KI 明顯增高（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與DN 組相比，經(jīng)小檗堿干預(yù)后，DN+BBR 組大鼠精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，活動(dòng)度增加，毛發(fā)色澤如常，體重較前者有所改善。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠生化指標(biāo)結(jié)果對(duì)比（n=6，±s）Tab 1 Comparison of biochemical index of all rat groups（n=6，±s）

表1 各組大鼠生化指標(biāo)結(jié)果對(duì)比（n=6，±s）Tab 1 Comparison of biochemical index of all rat groups（n=6，±s）

注：與NC 組比,*P＜0.05；與DN 組比,#P＜0.05。

BUN(mmol/L)8.77±0.61 13.47±2.19*6.16±2.41#22.509 0.000組別GLU(mmol/L)KI(‰)Scr（μmol/L)NC 組DN 組DN+BBR 組F P 9.87±1.12 26.84±3.57*14.45±3.01#60.114 0.000 8.08±0.31 11.37±1.18*8.93±1.37#15.543 0.000 24 h Upro(mg/24 h)3.13±0.31 39.71±3.35*6.71±0.74#615.949 0.000 25.17±1.17 43.17±3.54*30.83±2.93#67.763 0.000

2.2 小檗堿對(duì)DN 大鼠腎臟組織病理形態(tài)的影響

HE 染色及PAS 染色顯示，DN 組腎小球形態(tài)不規(guī)則，體積增大，腎小球囊腔縮窄，彌漫性系膜基質(zhì)增多，基底膜不均勻增厚，腎小管水腫，腎間質(zhì)紫紅色糖原沉積物增多，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)小檗堿干預(yù)處理后，DN+BBR 組腎小球狀況明顯改善，腎小管水腫減輕，糖原沉積減少（圖1A、B）。Masson 染色顯示，DN 組藍(lán)染的膠原纖維堆積，NC 組及DN+BBR 組膠原纖維堆積相對(duì)較少，三者基底膜增厚均不明顯（圖1C）。

圖1 各組大鼠病理組織染色結(jié)果（×400）Fig 1 Staining results of pathological tissue in all rat groups（×400）

2.3 小檗堿對(duì)DN 大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)的影響

與NC 組相比，DN 組足突細(xì)胞不規(guī)則排列合并融合、斷裂，基底膜不均勻增厚，經(jīng)小檗堿干預(yù)處理后，DN+BBR 組足突斷裂改善，基底膜增厚減輕。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠透射電子顯微鏡結(jié)果Fig 2 Transmission electron microscopy results of all rat groups

2.4 小檗堿對(duì)DN 大鼠ERS 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與NC 組相比，DN 組ERS 相關(guān)蛋白即UPR 三條主通路蛋白PERK、ATF6、IRE1 及共同下游因子CHOP 的表達(dá)量在腎臟組織中彌漫性增加，ERS 凋亡相關(guān)蛋白Caspase3 表達(dá)量也有所升高；經(jīng)小檗堿干預(yù)治療后，相關(guān)蛋白表達(dá)量均顯著下降（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2 及圖3。

圖3 各組大鼠免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×400）Fig 3 Immunohistochemical staining results of all rat groups（×400）

表2 各組大鼠免疫組織化學(xué)染色光密度值結(jié)果對(duì)比（n=6，±s）Tab 2 Comparison of immunohistochemical staining optical density values of rats in each group（n=6，±s）

表2 各組大鼠免疫組織化學(xué)染色光密度值結(jié)果對(duì)比（n=6，±s）Tab 2 Comparison of immunohistochemical staining optical density values of rats in each group（n=6，±s）

注：與NC 組比,*P＜0.05；與DN 組比,#P＜0.05。

Caspase3 0.17±0.01 0.34±0.01*0.27±0.02#292.060 0.000組別NC 組DN 組DN+BBR 組FP ATF6 0.24±0.01 0.34±0.01*0.28±0.01#100.392 0.000 PERK 0.15±0.01 0.30±0.01*0.24±0.01#344.165 0.000 IRE1 0.22±0.01 0.37±0.01*0.28±0.01#307.074 0.000 CHOP 0.16±0.01 0.35±0.01*0.27±0.01#451.950 0.000

3 討論

DN 是目前最普遍的慢性腎臟疾病，也是成人終末期腎臟疾病的主要原因，占需要腎臟替代治療患者的40%［10，11］。持續(xù)性蛋白尿和（或）腎小球?yàn)V過(guò)功能減退是DN 的主要臨床特征。本實(shí)驗(yàn)以大鼠尾靜脈血糖≥16.8 mmoL/L +24 h 尿蛋白定量≥30 mg 為DN 造模成功指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，組織病理結(jié)果顯示DN 組大鼠腎小球形態(tài)不規(guī)則，體積增大，腎小球囊腔縮窄，彌漫性系膜基質(zhì)增多，基底膜不均勻增厚，腎小管水腫，腎間質(zhì)紫紅色糖原沉積物增多，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。透射電子顯微鏡可觀察到DN 組足細(xì)胞排列紊亂，斷裂、融合嚴(yán)重，基底膜不均勻增厚，符合糖尿病腎病病理表現(xiàn)。

DN 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明腎小球高血壓、腎血流動(dòng)力學(xué)改變、缺血和缺氧、氧化應(yīng)激以及RAS 上調(diào)在DN 的發(fā)病中扮演著重要的角色［12］。近期研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在維持腎臟組織蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。長(zhǎng)時(shí)期的糖代謝紊亂可刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，引發(fā)腎臟固有細(xì)胞如腎小管細(xì)胞、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)、足細(xì)胞等損傷甚至凋亡，損害腎臟組織。ERS 已成為DN 發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)。本研究以ERS 為切入點(diǎn)，探討ERS 是否參與糖尿病腎病的發(fā)病，為DN 提供新的治療思路。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核生物重要的細(xì)胞器，參與蛋白質(zhì)的折疊，加工和運(yùn)輸，并在炎癥調(diào)節(jié)及細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要作用［13，14］。各種病理、生理因素均可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生異常，導(dǎo)致蛋白質(zhì)異常折疊或錯(cuò)誤折疊，從而激發(fā)ERS［15］。ERS 或未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）可通過(guò)發(fā)揮減少異常蛋白質(zhì)的聚集、增加錯(cuò)誤蛋白質(zhì)的降解等作用，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。當(dāng)外界刺激持續(xù)時(shí)間久、刺激強(qiáng)度過(guò)高時(shí)，ERS 過(guò)度激活，穩(wěn)態(tài) 失 衡，UPR 則 通 過(guò) 激 活A(yù)TF6、IRE1、PERK3 條路徑啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)。本實(shí)驗(yàn)研究，在高糖、高脂飲食聯(lián)合STZ 腹腔注射下，成功造模DN 大鼠，在對(duì)腎臟組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色時(shí)，觀察到DN 組大鼠ERS 相關(guān)蛋白ATF6、IRE1、PERK 表達(dá)較正常組顯著增多，ERS 被激活，表明DN 與ERS相互促進(jìn)并相互影響。

當(dāng)異常折疊蛋白蓄積時(shí)，ATF6、IRE1、PERK三種跨膜蛋白與GRP78 解離，處于激活狀態(tài)，進(jìn)而促進(jìn)Caspase12、Caspase9、Caspase3 級(jí)聯(lián)促凋亡反應(yīng)及CHOP 依賴性凋亡途徑的發(fā)生，促進(jìn)細(xì)胞死亡，參與疾病的發(fā)生［16］。CHOP 是UPR 3 種途徑共同的下游因子，過(guò)度激活狀態(tài)下的UPR 促發(fā)CHOP基因轉(zhuǎn)錄，CHOP 過(guò)量表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)BCL-2（凋亡抑制因子，可促進(jìn)細(xì)胞存活），上調(diào)促凋亡蛋白BIM，誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑的發(fā)生［17］。本研究在檢測(cè)UPR 3 種跨膜蛋白的基礎(chǔ)上，檢測(cè)共同下游因子CHOP 及凋亡蛋白Caspase3，意圖探索ERS 損傷DN 腎臟細(xì)胞的機(jī)制是否通過(guò)促進(jìn)凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DN 組大鼠ERS 相關(guān)蛋白表達(dá)增多的同時(shí)，CHOP 及Caspase3 表達(dá)亦增加，DN 的發(fā)病機(jī)制可能與RES 促腎臟細(xì)胞凋亡相關(guān)。Ju 等［18］通過(guò)黃芪甲苷對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行干預(yù)，提示下調(diào)p-PERK、ATF4 和CHOP 的表達(dá)可抑制ERS 誘導(dǎo)的腎臟細(xì)胞凋亡。因此推測(cè)抑制ERS 的過(guò)度激活，可減少細(xì)胞損傷及凋亡的發(fā)生。

小檗堿是傳統(tǒng)中藥黃連的主要藥效成分，Yan等［19］在對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的研究中，證明BBR 可通過(guò)抑制ERS 有效降低潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸黏膜中IEC 的凋亡率；Wu 等［4］在對(duì)阿爾茨海默病的研究中發(fā)現(xiàn)小檗堿可通過(guò)抑制ERS，發(fā)揮對(duì)阿爾茨海默癥的保護(hù)作用。雖然已有大量研究表明小檗堿具有抑制ERS 的作用，但其在糖尿病腎病方面的相關(guān)報(bào)道尚少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)生化、組織病理、透射電鏡及免疫組織化學(xué)結(jié)果證實(shí)ERS 參與DN 的發(fā)生、發(fā)展，并通過(guò)設(shè)置小檗堿干預(yù)組，對(duì)比檢測(cè)各組大鼠腎臟組織內(nèi)ERS 相關(guān)蛋白：PERK、ATF6、IRE1、CHOP、Caspase3 的表達(dá)水平，總結(jié)出小檗堿可減輕ERS 發(fā)揮對(duì)腎臟組織的保護(hù)作用。

綜上所述，小檗堿可能通過(guò)調(diào)控ERS 相關(guān)蛋白的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞凋亡，發(fā)揮對(duì)DN 大鼠腎臟保護(hù)作用，為小檗堿臨床治療DN 提供了一定依據(jù)。但本研究未設(shè)置小檗堿濃度梯度，也未設(shè)置藥物對(duì)照組例如：ERS 抑制劑—四苯基丁酸（4-PBA），同時(shí)本實(shí)驗(yàn)對(duì)于凋亡蛋白的檢測(cè)尚少，在后續(xù)研究中，將繼續(xù)完善相關(guān)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)，設(shè)定藥物陽(yáng)性對(duì)照組及藥物濃度梯度，進(jìn)一步探討小檗堿對(duì)DN 的治療作用及相關(guān)的其他分子機(jī)制。