李傲寒，齊亞銀

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000）

糞腸球菌為腸球菌屬的一個(gè)種，為球形或是卵圓形，屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，液體培養(yǎng)基中細(xì)胞呈短鏈狀排列，為兼性厭氧化能異氧菌（Carvalho等，2004）。糞腸球菌是一種重要的機(jī)會(huì)致病菌，可以感染各種組織（王俊書(shū)等，2019），可產(chǎn)生多種毒力因子，進(jìn)而感染人類和畜禽導(dǎo)致疾病。在養(yǎng)殖業(yè)上，糞腸球菌可引起雞胚死亡和弱雛、死雛、家兔腹瀉、鴕鳥(niǎo)肺部及胸腔化膿等（王蒙蒙等，2018；狄婷婷和高原，2012），尤其是引起動(dòng)物腦炎和腦膜炎的病例呈上升趨勢(shì)。齊亞銀等（2005）對(duì)北疆地區(qū)幾個(gè)不同規(guī)模羊場(chǎng)有神經(jīng)癥狀的病、死羔羊的病料進(jìn)行病原菌分離，成功從腦組織中分離出致病菌糞腸球菌，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明該菌可以穿過(guò)血腦屏障侵入腦組織，對(duì)腦組織產(chǎn)生破壞。血腦屏障作為控制腦內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)定的重要屏障之一，嚴(yán)格監(jiān)管進(jìn)出屏障的物質(zhì)。糞腸球菌對(duì)腦組織的破壞無(wú)疑會(huì)增加血腦屏障通透性。

因此，本試驗(yàn)通過(guò)擴(kuò)增出糞腸球菌的CylA毒力基因，利用基因重組技術(shù)和轉(zhuǎn)染技術(shù)將其導(dǎo)入到鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞中。從mRNA轉(zhuǎn)錄層面和蛋白質(zhì)表達(dá)層面分析糞腸球菌CylA基因的表達(dá)差異，以此來(lái)判斷該基因是否與血腦屏障通透性的變化有直接關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株來(lái)源 由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存于-80℃冰箱的羊源糞腸球菌。

1.1.2 試劑與儀器 LB肉湯培養(yǎng)基、LB肉湯瓊脂（均購(gòu)自生工生物公司）；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（均購(gòu)自天根生化公司）；2×Es Taq MsterMix（購(gòu)自索萊寶公司）；pMD@19-T Simple Vector、T4 DNA Ligase、10×T4 DNA Ligase buffer、BamhⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、PrimeScript@ RT reagent kit 反轉(zhuǎn)試劑盒（均購(gòu)自TAKARA公司）；大腸桿菌Dh5α感受態(tài)細(xì)胞（購(gòu)自全式金公司）；pcDNA3.1/Mychis（購(gòu)自 ThermoFisher公司）；LightCycler 480 SYBR Green I Master購(gòu) 自Invitrogen公 司；bEnd.3小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（購(gòu)自賽普諾有限公司）。

全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器（hIRAYAMA）、全自動(dòng)震動(dòng)培養(yǎng)箱（ZhWY-2102C）、電熱恒溫水浴鍋（DKB-501A）、光明隔水式恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9162）、超凈工作臺(tái)（AIR TECh）、PCR 儀（TC-4000）、振 蕩 器（G560E）、電 泳 儀（DYY-2C）、凝膠成像儀（Bio-Rad）、

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀（Roche LightCycler?96）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 糞腸球菌DNA提取及CylA基因的克隆參照天根公司的細(xì)菌基因組提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。根?jù) Creti R等（2004）設(shè)計(jì)的引物，并結(jié)質(zhì)粒上攜帶的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物，按照2×Es Taq MsterMix12 μL、ddH2O 9 μL、上下游引物各 1 μL、cDNA 模板2 μL的體系進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列信息如表1所示。

表1 引物序列信息

1.2.2 目的基因與克隆載體的連接及轉(zhuǎn)化 將擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，按照SolutionⅠ 5 μL、pMD@19-T Simple Vector 1 μL、回收產(chǎn)物4 μL的體系置于16℃過(guò)夜孵育，隨后從-80℃冰箱中取E·coli Dh5α感受態(tài)細(xì)胞放于冰盒上，加入7 μL連接產(chǎn)物，輕彈混勻，冰浴30 min。隨后42℃水浴90 s，再次冰浴2 min。加入LB培養(yǎng)基混勻，37℃、180 r/min振蕩1 h，復(fù)蘇菌體。取出離心管，8000 r/min離心2 min，棄上清，用剩余的上清將沉淀吹打混勻，全部吸涂在含氨芐抗性的LB瓊脂平板上，37℃溫箱中培養(yǎng)14～16 h。

1.2.3 重組質(zhì)粒的鑒定 挑取多個(gè)單個(gè)菌落接種至含Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3～4 h，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，出現(xiàn)特異性目的條帶的確定為陽(yáng)性。提取細(xì)菌質(zhì)粒，采用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件同1.2.1。將提取的質(zhì)粒用酶BamhⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 在PCR管中加入雙酶切后膠回收的目的基因6 μL、質(zhì)粒pcDNA3.1/Myc-his；2 μL ddH2O 1μL、質(zhì)粒 DNA ；2 μL、Buffer；1.5 μL、T4 DNA Ligase；1 μL 的體系進(jìn)行連接，連接后再一次進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。

1.2.5 鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng) 將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于含5%CO2的37℃的培養(yǎng)箱，每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，當(dāng)細(xì)胞的生長(zhǎng)密度達(dá)到或超過(guò)80%，則用胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來(lái)后獲取細(xì)胞沉淀后平均分在6孔板中培養(yǎng)。

1.2.6 轉(zhuǎn)染鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及收集細(xì)胞蛋白 設(shè)置 24、30、36、42、48 h 五個(gè)不同的轉(zhuǎn)染時(shí)間，參照Lip2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。待轉(zhuǎn)染結(jié)束后應(yīng)用Trizol法提取轉(zhuǎn)染后的細(xì)菌總RNA于-80℃中保存?zhèn)溆?。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用高效細(xì)胞裂解液裂解，參照其說(shuō)明書(shū)提取蛋白，用Western blot檢測(cè)CylA基因是否在鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) 用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，其上游為5′-CATGGRACACAAGTTGCTGGAG-3′，下 游 為5′-GCGACTCATTTCCTGCTGATG-3′，目 的 條 帶大小為280 bp，退火溫度為60℃。隨后將提取的RNA參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA并調(diào)整上樣量，反應(yīng)體系為 ：SYBR10 μL，ddH2O 7 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA1 μL。擴(kuò)增體系為：95℃預(yù)變性 5 min，95℃變性 10 s，60℃退火 20 s，72℃延伸 10s，共45個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增與鑒定以提取的糞腸球菌總DNA為模板，用特異性引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后得到如圖1中大小分別為707 bp的條帶，與預(yù)期的片段大小一致。

圖1 CylA基因的RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.2 CylA基因的測(cè)序結(jié)果將擴(kuò)增CylA測(cè)序所得序列與GenBank上已經(jīng)登錄的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示其同源性均在99%以上。

2.3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定提取重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Myc/his-CylA，用酶BamhⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后得到如圖2中大小分別為707、5500 bp的條帶，目的條帶與預(yù)期大小一致，質(zhì)粒大小也與預(yù)期一致。

圖2 CylA基因重組質(zhì)粒酶切瓊脂糖凝膠電泳

2.4 不同時(shí)間段CylA基因表達(dá)量的分析由表2可知，不同時(shí)間段CylAmRNA在細(xì)胞中表達(dá)量的變化。

表2 ylA在不同時(shí)間段mRNA的表達(dá)量

5個(gè)時(shí)間段CylAmRNA的表達(dá)量也總體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，與對(duì)照組24 h相比，42 h差異不顯著（P ＞ 0.05）；30、36、48 h差異顯著（P＜0.05），且36 h的表達(dá)量最低。

2.5 CylA基因的體內(nèi)表達(dá)驗(yàn)證由圖4可知，在細(xì)胞中能檢測(cè)到CylA基因表達(dá)的特異性蛋白。

圖4 CylA基因在微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)

3 討論

從上世紀(jì)開(kāi)始，關(guān)于糞腸球菌導(dǎo)致人和動(dòng)物發(fā)病的報(bào)道逐漸增加（Guerra等，2007），成為一種機(jī)會(huì)致病菌。其致病性與糞腸球菌所攜帶的多種毒力因子及其產(chǎn)生的耐藥性密不可分，糞腸球菌的Cyl基因是一種具有溶血性或溶細(xì)胞活性的性質(zhì)基因，稱之為溶血素，也被稱為溶細(xì)胞素，最早在1934年由Todd（1934）發(fā)現(xiàn)，Cyl基因由6部分組成，分別是激活基因CylA、結(jié)構(gòu)基因CylLL和CylLs、修飾基因CylM、轉(zhuǎn)運(yùn)基因CylB和免疫基因Cyll。CylA作為溶血素（Cyl）的激活基因，可激活Cyl產(chǎn)生溶細(xì)胞素，對(duì)體內(nèi)的一些細(xì)胞有破壞作用。若CylA基因不表達(dá)，則糞腸球菌不會(huì)產(chǎn)生溶細(xì)胞活性，本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，CylA能在鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中復(fù)制并表達(dá)。有研究表明，糞腸球菌在感染小鼠后可以對(duì)腦組織造成損傷（王蒙蒙等，2018）。而本次試驗(yàn)證明，糞腸球菌的CylA能在鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，可說(shuō)明CylA基因參與了糞腸球菌導(dǎo)致血腦屏障的損傷過(guò)程。

李慧（2019）給感染了致腦膜炎糞腸球菌的小鼠注射伊文思藍(lán)后發(fā)現(xiàn)，伊文思藍(lán)在腦組織中的量會(huì)在24 h和48 h出現(xiàn)峰值，且呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，說(shuō)明此時(shí)血腦屏障通透性變大。本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定不同時(shí)間段CylA在鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)量，以24 h各基因的相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組，利用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，CylA基因36、42、48 h的相對(duì)表達(dá)量同24 h相比差異不顯著（P＞0.05），30 h的相對(duì)表達(dá)量與24 h差異顯著（P＜0.05）。該基因的表達(dá)量在24～48 h范圍內(nèi)同樣呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)，所得結(jié)果與李慧分析腦損傷后腦部伊文思藍(lán)含量的變化基本相符。但由于mRNA水平的檢測(cè)在轉(zhuǎn)染24～48 h效果較好，因此，本試驗(yàn)選取的時(shí)間點(diǎn)相對(duì)較少，未檢測(cè)24 h之前和48 h之后的表達(dá)量，沒(méi)有十分精確的測(cè)量出表達(dá)量的具體變化。有研究報(bào)道，單層BEMEC相當(dāng)于體外血腦屏障，本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，糞腸球菌CylA基因在體外血腦屏障的表達(dá)趨勢(shì)與糞腸球菌感染體內(nèi)血腦屏障的表達(dá)趨勢(shì)一致，足以說(shuō)明CylA基因在糞腸球菌突破血腦屏障的過(guò)程中起到極其重要的作用。