周俊英，常 蕾，張偉衛(wèi)，董世亮，秦 波

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 a.婦產(chǎn)科;b.放射治療部;c.醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化中心，鄭州 450052)

卵巢癌是威脅全球女性健康的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，具有很高的死亡率和復(fù)發(fā)率[1]。卵巢癌引起的死亡占女性癌癥死亡人數(shù)的5%[2]。手術(shù)和化療等治療手段可提高患者的生存率，但其5年生存率仍保持在45%[3]。由于缺乏有效的檢測和治療策略，卵巢癌患者通常在晚期被診斷出，并常出現(xiàn)預(yù)后不良相關(guān)的轉(zhuǎn)移[4-5]。因此，探究卵巢癌轉(zhuǎn)移的機制及相關(guān)靶點，對卵巢癌患者的早期診斷和治療具有重要的意義[6]。近年來，細胞外囊泡(extracellular vesicle,EV)在卵巢癌中的研究得到廣泛關(guān)注。研究報道，間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)在卵巢癌的侵襲中發(fā)揮抑制作用[7]。有研究表明，MSC能產(chǎn)生EVs，通過旁分泌活動修復(fù)受損組織[8]。此外，MSC可作為腫瘤靶向治療的基因遞送載體，這種修飾的MSC已用于不同的腫瘤類型模型，如乳腺癌[9]。外泌體是納米大小的細胞外囊泡，可被大多數(shù)細胞分泌[10]。外泌體含各種功能性小RNA、mRNA和功能蛋白，可傳遞特定的分子信息，改變受體細胞的生物學(xué)功能[11]。研究表明，乳腺癌血清中外泌體miR-4488可促進其轉(zhuǎn)移[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，含α/β-水解酶結(jié)構(gòu)域8(α/β-hydrolase domain-containing 8,ABHD8)是miR-4488的下游靶標。既往有研究表明，卵巢癌中ABHD8表達升高[13]，但具體作用機制尚不清楚。本研究深入探究了MSCs-EVs通過分泌miR-4488下調(diào)ABHD8調(diào)控卵巢癌細胞的作用機制，為卵巢癌的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 資料來源 選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科于2015至2016年間存檔的石蠟樣本，其中60例卵巢癌組織，40例正常卵巢組織(來源于靠近卵巢囊腫或漿液性囊腺瘤的正常卵巢組織)。卵巢癌患者嚴格按美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)卵巢癌指南進行手術(shù)治療?；颊咝g(shù)前均未接受化療或放療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，獲得了患者的書面知情同意書。動物實驗按《實驗動物護理和使用指南》中的建議進行，動物實驗方案經(jīng)醫(yī)院機構(gòu)動物護理和使用委員會批準。

1.2 生物信息學(xué)分析 ABHD8的正向miRNA由TargetScan數(shù)據(jù)庫(http://www.targetscan.org/vert_71/)、miRDB數(shù)據(jù)庫(http://mirdb.org/index.html)和miRSearch數(shù)據(jù)庫(https://www.exiqon.com/miRSearch)預(yù)測。來自間充質(zhì)干細胞的細胞外囊泡中miRNA的信息通過EV miRNA數(shù)據(jù)庫(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/EVmiRNA#!/)獲得。

1.3 實驗材料 人卵巢癌相關(guān)細胞系Caov-3、SKOV3、OVCAR-3和人卵巢表面上皮細胞系IOSE-80購自American Type Culture Collection Cell Bank(美國)。6～8周齡健康雌性裸鼠購自維通利華(中國，武漢)。RPMI 1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清購自Gibco公司(美國，紐約)。質(zhì)粒(pcDNA3.1-ABHD8、pLKO.1-shABHD8、pX459-ABHD8-sgRNA)來自美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)。MTT Kit購自Sigma(美國，舊金山),Matrige購自上海翊圣生物科技有限公司(中國，上海)。Trizol購自賽默飛公司(美國，加利福尼亞)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國，加利福尼亞)。實時熒光定量試劑盒購自Takara公司(中國，遼寧)。ABHD8抗體(HPA037658，瑞士),Bax抗體(ab32503，Abcam，美國),B-cell lymphoma 2抗體(ab32124，Abcam，美國),Cleaved-caspase 3(ab4051，Abcam，美國),CyclinD1(ab134175，Abcam，美國)和GADPH(ab3716，Abcam，美國)。山羊抗兔IgG抗體二抗(SA00001-2，中國，武漢)。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞轉(zhuǎn)染 應(yīng)用美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的ABHD8和miR-4488序列構(gòu)建過表達質(zhì)粒(pcDNA3.1-ABHD8)、敲低質(zhì)粒(pLKO.1-shABHD8)和敲除質(zhì)粒(pX459-ABHD8-sgRNA)。分別用shRNA陰性對照(NC)、pLKO.1-shABHD8,NC-mimic、miR-4488模擬物、NC-抑制劑、miR-4488抑制劑,pcDNA 3.1-NC、pcDNA3.1-ABHD8、pLKO.1-shABHD8、pX459-ABHD8-sgRNA,EVs-miR-4488、EVs-NC模擬物、二甲基亞砜(DMSO)和GW4869抑制劑(EVs抑制)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞。

1.4.2 雙熒光素酶報告分析 利用生物信息學(xué)預(yù)測網(wǎng)站(http://www.rna-society.org/raid/index.html和http://www.microrna.org/microrna/home)對ABHD8和miR-4488的靶基因進行預(yù)測分析。

1.4.3 3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide(MTT)測定 收集轉(zhuǎn)染后呈對數(shù)生長的卵巢癌細胞，分離成細胞懸液，調(diào)整至4×103細胞/孔。將各實驗組的預(yù)混細胞(50μL)接種至96孔板，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)購買說明書，使用MTT連續(xù)2天測量細胞增殖情況。

1.4.4 Transwell試驗 轉(zhuǎn)染后細胞在無血清培養(yǎng)基中饑餓24h后分離，用1×PBS洗滌3次，用含10g/L牛血清白蛋白的Opti-MEM重懸，將細胞密度調(diào)整為2.5×104細胞/mL。將Transwell小室置于24孔板，Transwell小室底膜的上室表面加1∶8稀釋的Matrigel(0111ES08,Yeasen Biotech Co.,Ltd,Shanghai,China)，孵育1h使其凝固。常規(guī)消化后，細胞用1×PBS洗滌兩次，重懸于RPMI 1640培養(yǎng)基中并調(diào)整細胞密度為1×105細胞/mL。將細胞懸液(100μL)加入帶有Matrigel凝膠的Transwell小室的上室，同時下室中加600μL含20%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。取出Transwell小室，用棉簽擦拭上室內(nèi)側(cè)的細胞，用4%多聚甲醛固定15min，用甲醇制成配制的0.5%結(jié)晶紫溶液染色15min，用PBS洗滌3次。倒置顯微鏡下隨機選擇5個視野進行拍攝。計數(shù)跨膜細胞，重復(fù)3次取平均值。

1.4.5 劃痕實驗 收集轉(zhuǎn)染后的卵巢癌細胞和人卵巢表面上皮細胞，按1×105細胞/孔接種于6孔板。當細胞匯合度達到90%時，使用200μL無菌槍頭在每孔底部均勻劃4道橫豎劃痕。除去原培養(yǎng)液，每孔加2mL含10%血清的培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱。倒置顯微鏡下，于0h和24h拍攝照片。每個樣品取5個視野中細胞計數(shù)的平均值，并測量多個劃痕點的寬度，計算各組的劃痕愈合率[(0h處的劃痕寬度-24h處的劃痕寬度)/0h處的劃痕寬度×100%]。重復(fù)3次取平均值，比較各組細胞遷移能力。

1.4.6 流式細胞術(shù) 轉(zhuǎn)染48h后用2mL PBS溶液輕輕沖洗培養(yǎng)皿中的細胞，并用0.5mL 0.25%胰蛋白酶消化，直至在顯微鏡下觀察到細胞開始從培養(yǎng)皿壁上脫落。連續(xù)吹打至細胞完全脫落。將細胞輕輕重懸于培養(yǎng)基，調(diào)整細胞密度約為1×106細胞/mL。將細胞懸液(0.5mL)轉(zhuǎn)移至干凈的離心管。將細胞染色，用0.5mL預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液重新懸浮，加5μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(FITC)和10μL碘化丙啶(PI)，避光條件下孵育15min。隨后，通過流式細胞儀對細胞進行測定和分析。

1.4.7 逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR) 轉(zhuǎn)染24h后，用Trizol提取總RNA。ABHD8和miR-4488引物由Invitrogen公司設(shè)計合成。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH和U6為內(nèi)參，使用qPCR試劑盒檢測。最終數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進行分析。

1.4.8 細胞外囊泡的制備與鑒定 卵巢癌細胞Caov-3培養(yǎng)后，用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞并用無血清培養(yǎng)基孵育24h。在去除培養(yǎng)基的同時，通過四次離心(360g 10min，2000g 10min，10000g 30min和1000000g 70min)培養(yǎng)上清。將分離出的細胞外囊泡用50μL PBS重懸，-80℃保存。二辛可寧酸(BCA)方法用于測量細胞外囊泡的蛋白質(zhì)含量,在10%十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠上分離10μg EV蛋白質(zhì)。蛋白印記分析方法驗證CD63蛋白表達。按制造商的說明制備EV透射電子顯微鏡(TEM)樣品并觀察。

1.4.9 蛋白印跡分析 提取細胞總蛋白并用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。共用40μg蛋白上樣量，用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，室溫下用含5% BSA的Tween 20(TBST)溶液封閉。分別用稀釋的抗體ABHD8(1∶200),Bax(1∶2000),B-cell lymphoma 2(Bcl-2)(1∶2000),Cleaved-caspase 3(1∶100),CyclinD1(1∶2000)和GADPH(1∶3000)在4℃孵育過夜。用山羊抗兔IgG抗體二抗(1∶5000)在室溫下重新孵育2h，用TBST洗滌三次后，通過增強化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影。

1.4.10 RNA pull down實驗 用生物素標記的miR-4488(每個50nmol/L)處理野生型(WT)-ABHD8和突變型(MUT)-ABHD8轉(zhuǎn)染的卵巢癌細胞。轉(zhuǎn)染48h后，收集的細胞用PBS洗滌并用特定的細胞裂解液裂解10min。共分裝50mL樣品細胞裂解液。將殘留的裂解物與M-280鏈霉親和素磁珠預(yù)包被的無RNase和酵母tRNA在4℃下孵育3h，用冷裂解液洗滌兩次，用低鹽緩沖液洗滌3次，用高鹽緩沖液洗滌一次。以拮抗劑ABHD8探針為陰性對照組。Trizol提取總RNA，RT-qPCR檢測miR-4488表達。

1.4.11 裸鼠異種移植瘤 共使用24只6～8周齡健康雌性裸鼠分別飼養(yǎng)在無特定病原體(SPF)動物實驗室的籠子中(濕度60%～65%，溫度22～25℃)。在12h光照和12h黑暗循環(huán)下為裸鼠提供食物和水。實驗在適應(yīng)性喂養(yǎng)后1周開始。實驗前觀察裸鼠健康狀況。裸鼠皮下注射構(gòu)建的載體-NC、ABHD8-載體、sh-ABHD8和sh-NC(1×109pfu/100μL)質(zhì)粒。為了研究MSC-EV-miR-4488對裸鼠腫瘤形成的影響，皮下注射EV-NC模擬物和EV-miR-4488模擬物。喂養(yǎng)6周后，將小鼠安樂死，并測量腫瘤的大小和重量。

2 結(jié) 果

2.1 ABHD8、miR-4488在卵巢癌組織和細胞中的表達 免疫組化檢測結(jié)果表明，卵巢癌組織中ABHD8陽性表達率高于正常卵巢組織(圖1A、B)(P<0.05)。RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與正常卵巢組織相比，卵巢癌組織中ABHD8呈高表達，而miR-4488呈低表達(圖1C)(P<0.05)。RT-qPCR測定結(jié)果顯示，人正常卵巢上皮細胞IOSE-80及卵巢癌細胞系Caov-3、SKOV3和OVCAR-3中，ABHD8表達上調(diào)，miR-4488表達下調(diào)(圖1D)。

圖1 ABHD8、miR-4488在卵巢癌組織和細胞中的表達A、B：ABHD8在卵巢癌和正常卵巢組織中的表達(400×)；C：RT-qPCR檢測ABHD8和miR-4488在卵巢癌和正常卵巢組織中的相對表達；D：RT-qPCR檢測ABHD8和miR-4488在卵巢癌細胞系Caov-3、SKOV3和OVCAR-3以及人卵巢表面上皮細胞IOSE-80中的相對表達。*P<0.05

2.2 MSC-EV-miR-4488與ABHD8在卵巢癌中的潛在靶向關(guān)系 通過TargetScan等數(shù)據(jù)庫預(yù)測調(diào)節(jié)ABHD8的正向miRNA(圖2A)。同時通過EV-miRNA數(shù)據(jù)庫獲取MSC-EVs的miRNA信息，由EV-miRNA和預(yù)測結(jié)果引起的交集只有miR-4488(圖2B)。因此，推測MSC-EVs中miR-4488可能參與ABHD8對卵巢癌進展的調(diào)控。

2.3 ABHD8對卵巢癌增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移功能的影響 流式細胞術(shù)和MTT結(jié)果表明，過表達ABHD8導(dǎo)致Caov-3細胞凋亡降低且增殖能力增強，而敲低ABHD8則出現(xiàn)了相反的趨勢(圖3A、C)(P<0.05)。Western blot法檢測結(jié)果顯示，過表達ABHD8導(dǎo)致Bax和Cleaved-caspase 3蛋白表達降低，但Bcl-2和Cyclin D1蛋白表達升高，敲低ABHD8則出現(xiàn)了相反的趨勢(圖3B)(P<0.05)。劃痕實驗和Transwell實驗表明，過表達ABHD8使Caov-3細胞的遷移和侵襲能力增強，而敲低ABHD8質(zhì)粒則出現(xiàn)相反的趨勢(圖3D、E)(P<0.05)。表明ABHD8高表達顯著增強卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并抑制細胞凋亡，進而促進了卵巢癌的進展。

2.4 MSC-EV-miR-4488靶向ABHD8并抑制其表達 通過軟件分析，ABHD8基因與miR-4488序列之間存在特異性結(jié)合區(qū)，即ABHD8是miR-4488的靶向RNA(圖4B)。TEM檢測表明，球形EVs是從MSC-EVs中分離出來的，并且蛋白質(zhì)印跡分析證實了MSC-EVs中存在跨膜蛋白(CD63)，且不表達Calnexin，表明EV被成功提取出(圖4A)。同時轉(zhuǎn)染miR-4488模擬物的Caov-3細胞較對照(轉(zhuǎn)染了NC模擬質(zhì)粒)細胞，miR-4488表達顯著升高而ABHD8表達顯著降低(P<0.01)(圖4C)，進一步表明miR-4488可調(diào)控ABHD8在卵巢癌細胞上的表達。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測發(fā)現(xiàn)，MSC-EV-miR-4488能與ABHD8結(jié)合，但不能與ABHD8-MUT結(jié)合(圖4D)。以上結(jié)果表明MSC-EV-miR-4488可能通過競爭性地與ABDH8結(jié)合，調(diào)控其表達。

圖2 MSC-EV-miR-4488特異性靶向卵巢癌中的ABHD8A：ABHD8和miR-4488的結(jié)合位點；B：數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果與EV-miRNA的交集(橢圓：一個數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果；中間部分：四組數(shù)據(jù)的交集)

圖3 ABHD8下調(diào)抑制卵巢癌細胞增殖、侵襲和遷移，促進其凋亡A:MTT法檢測Caov-3細胞0、24h和48h OD值；B：Western blot法檢測Bax,Cleaved-caspase 3,Bcl-2和Cyclin D1表達；C：流式細胞術(shù)檢測不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Caov-3細胞的凋亡情況；D、E：Transwell實驗檢測Caov-3細胞遷移和侵襲情況(400×);1:control;2:Vector;3:ABHD8;4:sh-NC;5:sh-ABHD8;*P<0.05

2.5 MSC-EV-miR-4488通過靶向ABHD8來抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲 流式細胞術(shù)和MTT試驗表明，Caov-3細胞中高表達miR-4488(轉(zhuǎn)染miR-4488 mimic或miR-4488-EVs)或敲低ABHD8(轉(zhuǎn)染sh-ABHD8)，細胞凋亡增加，細胞增殖降低。相反，使用miR-4488抑制劑或外泌體抑制劑(GW4869)則導(dǎo)致相反的趨勢(P<0.05)(圖5A、C)。蛋白印記實驗也表明，miR-4488過表達或敲低ABHD8調(diào)控了凋亡相關(guān)的蛋白表達水平(圖5B)。劃痕試驗和Transwell表明，Caov-3細胞中高表達miR-4488或敲低ABHD8降低細胞遷移和侵襲能力(圖5D、E)。MSC-EV-miR-4488靶向ABHD8，介導(dǎo)的卵巢癌增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移功能。

圖4 MSC-EV-miR-4488與ABHD8相互作用A:由TEM確定球形EV與MSC-EV的分離以及通過蛋白質(zhì)印跡分析測試的MSC-EV中CD63和Calnexin的存在；B：在線軟件預(yù)測的ABHD8和miR-4488的結(jié)合位點；C:轉(zhuǎn)染miR-4488-mimic后Caov-3細胞中miR-4488和ABHD8表達；D:雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測到EVs-miR-4488與ABHD8、ABHD8-MUT的結(jié)合;1:NC mimic;2:miR-4488 mimic;**P<0.01

圖5 MSC-EV-miR-4488通過特異性靶向卵巢癌中的ABHD8抑制癌細胞增殖并促進細胞凋亡、抑制細胞侵襲和遷移A：MTT法測量Caov-3細胞在0h、24h和48h時的OD值；B:Western blot檢測不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Caov-3細胞中Bcl-2、Cyclin D1、Cleaved-caspase 3和Bax蛋白表達；C：流式細胞術(shù)檢測不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Caov-3細胞的凋亡情況；D:劃痕愈合試驗檢測轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的Caov-3細胞的遷移；E:Transwell實驗檢測不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Caov-3細胞的侵襲。*P<0.05，實驗重復(fù)3次

2.6 MSC-EV-miR-4488通過下調(diào)ABHD8抑制體內(nèi)卵巢癌細胞的腫瘤進展 與sh-NC組相比，敲低ABHD8組小鼠腫瘤生長速度和腫瘤重量均有所下降，但miR-4488表達無變化(圖6)；與vector對照組相比，過表達ABHD8的小鼠皮下腫瘤生長速度加快，腫瘤重量增加；對小鼠進行EVs注射處理后，與注射EV-NC對照質(zhì)粒的裸鼠相比，注射EV-miR-4488模擬質(zhì)粒的裸鼠中miR-4488表達增加而ABHD8表達降低，小鼠的體積和重量均降低(圖6)。這些結(jié)果表明，降低ABHD8表達可抑制小鼠卵巢癌腫瘤形成，并且MSC-EVs中的miR-4488下調(diào)ABHD8表達。

圖6 MSC-EV-miR-4488通過下調(diào)ABHD8抑制卵巢癌細胞的腫瘤發(fā)生A：ABHD8表達和MSC-EV-miR-4488處理后腫瘤的生長曲線；B、C：用ABHD8過表達和MSC-EV-miR-4488治療后的腫瘤重量；*P<0.05

3 討 論

EVs作為細胞間通訊的工具，在癌癥的進展中發(fā)揮著重要作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾種EVs分泌的非編碼RNA參與卵巢癌的調(diào)節(jié)。如外泌體衍生的miR-205通過促進血管生成來增強卵巢癌細胞的轉(zhuǎn)移[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常卵巢組織相比，miR-4488在卵巢癌細胞和組織中顯著下調(diào)；ABHD8是miR-4488的下游靶標，且ABHD8在卵巢癌中表達上調(diào)。本研究結(jié)果顯示，通過體內(nèi)體外的實驗證明，MSC分泌的EVs-miR-4488通過下調(diào)抑制ABHD8表達來抑制卵巢癌細胞的增殖、侵襲和遷移，進而影響到卵巢癌的進展。本研究揭示了MSC-EV-miR-4488與ABHD8在卵巢癌中的聯(lián)合調(diào)控作用機制。

本研究為EVs在卵巢癌治療中的應(yīng)用提供了新的思路，但miR-4488能否成為潛在的治療靶點還需進一步研究。目前EVs的檢測分析技術(shù)尚未成熟，其應(yīng)用于卵巢癌的臨床診斷和治療還存在著許多挑戰(zhàn)。