周立花，胡 英，鄒 暉

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院生殖科,?？?570311)

滋養(yǎng)細(xì)胞增殖與侵襲功能障礙是多種妊娠并發(fā)癥，如子癇前期、胎兒生長受限及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)的重要發(fā)病機(jī)制[1]。RSA是指與同一配偶在妊娠28周前連續(xù)發(fā)生2次或2次以上原因不明的胎兒丟失，影響約1%～3%的育齡女性[2]。RSA不僅給家庭與社會造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還嚴(yán)重影響患者的心理健康。因此，持續(xù)深入研究其相關(guān)發(fā)病機(jī)制，以充分了解致病因素并探究相關(guān)治療策略具有重要意義。維生素D(Vitamin D,VD)是一種脂溶性維生素，其主要通過皮膚在270～300nm的紫外線照射下合成，極少能通過食物中獲取[3]。光照時間、暴露的身體面積不足，環(huán)境污染及生活方式的改變，可導(dǎo)致皮膚來源的VD顯著降低。機(jī)體內(nèi)活性形式的1,25二羥維生素D3[1,25(OH)2D3]與組織細(xì)胞中廣泛存在的維生素D受體(Vitamin D receptor,VDR)相互作用后，可通過胞內(nèi)的25-羥基維生素D3-1α-羥化酶(25-hydroxyvitamin D3-1α-hydroxylase，CYP27B1)進(jìn)行代謝，以發(fā)揮維持骨骼代謝與礦物質(zhì)平衡的作用[4]。近年大量數(shù)據(jù)表明，VD除了具有上述作用外，還能通過調(diào)節(jié)自噬影響細(xì)胞的增殖與遷移等生物學(xué)功能[5-6]。自噬在卵母細(xì)胞分裂、胚胎形成與植入等多個事件中發(fā)揮重要功能[7]。最新研究表明，RSA患者的胎盤絨毛組織中VD、VDR表達(dá)與自噬水平均較正常妊娠婦女明顯降低，而自噬水平缺陷的滋養(yǎng)細(xì)胞與胎盤功能異常密切相關(guān)[8-10]。有研究證實(shí)，補(bǔ)充VD可減輕育齡女性罹患RSA的風(fēng)險(xiǎn)，這可能與其能降低母胎間的免疫排斥相關(guān)[9,11-12]。但VD能否通過調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的自噬水平改善其功能，鮮有研究報(bào)道。本研究通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究VD改善RSA的相關(guān)作用與機(jī)制，以期為VD的作用機(jī)理提供更為全面與充分的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2019年1月至2020年5月于海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院就診且在妊娠前3個月連續(xù)發(fā)生兩次或兩次以上自然流產(chǎn)的20例患者(RSA組)和自愿行人工流產(chǎn)的20例早期妊娠婦女(對照組)。兩組的一般臨床資料，見表1。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)RSA診斷參考2020年版關(guān)于RAS的專家共識相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，且排除伴有自身免疫、解剖、感染、遺傳異?；騼?nèi)分泌紊亂的患者；(2)對照組婦女至少有一次成功妊娠史，且既往無流產(chǎn)史；(3)月經(jīng)規(guī)律，且在本次妊娠7～9周時經(jīng)超聲診斷為活胎；(4)妊娠前3個月內(nèi)均未服用維生素D或其他維生素補(bǔ)充劑。術(shù)前3h內(nèi)采肘靜脈血，離心，酶聯(lián)免疫法檢測血清中總25OHD(包括25OHD2與25OHD3)水平；負(fù)壓吸引法在人工流產(chǎn)術(shù)中收集絨毛組織，無菌生理鹽水充分洗滌，用液氮運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存?zhèn)溆?。本研究?jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署書面知情同意書。

表1 兩組患者的一般臨床資料

1.2 細(xì)胞系與主要試劑 人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo(美國ATCC)；RPMI 1640(美國Hyclone公司);胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(美國Gibco公司)；靶向沉默VDR表達(dá)的siRNA(si-VDR)與陰性對照siRNA(si-NC)由廣州吉瑪生物制藥有限公司設(shè)計(jì)與合成；TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR green PCR mix(日本Takara公司)；SYBR green PCR mix(美國Appiled Biosystems公司)；25OHD的酶聯(lián)免疫試劑盒(美國BD公司)；大鼠抗CYP27B1、VDR多克隆抗體、抗AMPK、p-AMPK單克隆抗體，DAB顯色試劑盒(美國Abcam公司)；兔抗LC3B、p62、GAPDH單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；兔抗p-mTOR、mTOR多克隆抗體(美國Pierce公司)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔或大鼠IgG二抗(武漢博士德);MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒，自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)(美國Sigam公司)；EdU試劑盒(廣州銳博)；RT-PCR引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測VDR與CYP27B1表達(dá)水平 使用TRIzol試劑提取絨毛組織與待測細(xì)胞中總RNA含量，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒取約1μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用SYBR green PCR mix進(jìn)行對上述cDNA進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)條件：95℃預(yù)熱35s,40個循環(huán)的95℃變性5s，60℃退火30s，72℃延伸60s。RT-PCR引物：VDR-F:5'-AAGGGGCACTGAGGTTTGAG-3',VDR-R:5'-AAGGTTACACACCCTCCACTC-3';CYP27B1-F:5'-TCTGGACGCCTGGAAGAGTA-3',CYP27B1-R:5'-TTTACAGCTTAGCCCCTGCC-3';GAPDH-F：5'-TCACCATCTTCCAGGAGCGA-3'，GAPDH-R,5'-TGGACTCCACGACGTACTCA-3'。以GAPDH為內(nèi)參，按2-ΔΔCt法計(jì)算樣品中CYP27B1與VDR表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.3.2 免疫組化法檢測絨毛組織中VDR與CYP27B1表達(dá)[13]取前述收集的胎盤絨毛組織，10%福爾馬林固定，石蠟包埋，5μm切片，在梯度酒精與二甲苯中脫蠟水化，置于檸檬酸鈉緩沖液中加壓處理進(jìn)行抗原提取。3%過氧化氫猝滅內(nèi)源性過氧化物酶活性，3%山羊血清進(jìn)行抗體封閉，加稀釋后一抗，VDR(1∶50)，CYP27B1(1∶100),4℃孵育過夜。加HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1h，DAB試劑盒顯色，使用蘇木精染色復(fù)染，顯微鏡下拍照觀察，Image-pro Plus軟件進(jìn)行分析。以累計(jì)吸光度值(IA)比較絨毛組織中VDR與CYP27B1表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.3.3 細(xì)胞的培養(yǎng)與處理、分組 HTR-8/SVneo細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI 1640中，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞生長融合至80%～90%時，應(yīng)用含EDTA的0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代。取處于對數(shù)生長期的滋養(yǎng)細(xì)胞，消化并計(jì)數(shù)，按5×105細(xì)胞/孔接種至6孔板，待細(xì)胞生長融合至60%～70%時，按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書方法將si-VDR與si-NC分別轉(zhuǎn)染入滋養(yǎng)細(xì)胞。48h后收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，RT-PCR與Western blot法檢測VDR表達(dá)。按實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶⒓?xì)胞分為4組：si-NC組，100nmol/L VD處理轉(zhuǎn)染24h后si-NC或si-VDR的si-NC+VD組與si-VDR+VD組[14]，100nmol/L的VD與2nmol/L的3-MA聯(lián)合處理轉(zhuǎn)染24h后si-NC的si-NC+VD+3-MA組。如無特殊說明，上述各組細(xì)胞置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，用于后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 MTT與EdU法檢測滋養(yǎng)細(xì)胞增殖能力 (1)MTT法：將滋養(yǎng)細(xì)胞接種至96孔板，按1.3.3分組處理滋養(yǎng)細(xì)胞，用含10%FBS的RPMI 1640新鮮培養(yǎng)基更換原培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)12、24、36、48h，每孔加20μL MTT試劑，繼續(xù)孵育4h，每孔加100μL二甲基亞砜，震蕩10min，使用酶標(biāo)儀在490nm處檢測每孔吸光度值。每組每個時間點(diǎn)設(shè)置6個復(fù)孔；(2)EdU法：按1.3.3分組處理滋養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)48h，參考文獻(xiàn)[5]使用1mL終濃度為50μmol/L的EdU試劑處理各組細(xì)胞2h,室溫下4%多聚甲醛固定細(xì)胞，Triton X-100進(jìn)行透化，使用200μL的1×Hochest33342室溫避光染核10min，加防熒光猝滅劑，封片后熒光顯微鏡下觀察拍照。上述實(shí)驗(yàn)均單獨(dú)重復(fù)3次。

1.3.5 侵襲實(shí)驗(yàn) 預(yù)先使用40μL的Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell小室，37℃培養(yǎng)箱孵育2h待基質(zhì)膠固化后使用。按1.3.3處理細(xì)胞24h，按2×104細(xì)胞/孔接種于上室，并予以200μL含3%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，下室加800μL含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。取出上室，4%多聚甲醛室溫固定25min，0.4%結(jié)晶紫溶液進(jìn)行染色，顯微鏡×200倍下觀察拍照，分析各組穿出細(xì)胞數(shù)。

1.3.6 透射電鏡觀察滋養(yǎng)細(xì)胞中的自噬囊泡 取1.3.3中的各組細(xì)胞，更換培養(yǎng)無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞3h，參考文獻(xiàn)[9]收集細(xì)胞，預(yù)冷的2.5%戊二醛室溫固定2h，1%四氧化鋨中固定1h,梯度酒精脫水，環(huán)氧樹脂包埋，制成超薄切片(60nm)，使用醋酸軸與檸檬酸鈉雙染，透射電鏡觀察拍照。

1.3.7 免疫熒光檢測LC3B表達(dá) 取1.3.3中的各組滋養(yǎng)細(xì)胞，4%多聚甲醛室溫固定20min，0.1% Triton X-100在PBS中預(yù)孵育30min，充分洗滌，3%山羊血清進(jìn)行抗體封閉，加稀釋后的兔抗LC3B(1∶200)抗體，4℃孵育過夜，次日加FITC熒光標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫下繼續(xù)孵育2h。細(xì)胞核使用DAPI試劑在避光下反應(yīng)5min，最后使用熒光顯微鏡觀察LC3B的分布及表達(dá)，Image J軟件在各組滋養(yǎng)細(xì)胞玻片中選擇3個不重疊的區(qū)域進(jìn)行圖片分析。

1.3.8 Western blot實(shí)驗(yàn) 取1.3.3中的各組待測滋養(yǎng)細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌，應(yīng)用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，4℃、22000r/min離心15min，取底層蛋白沉淀，使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，加熱變性，取40μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉進(jìn)行抗體封閉，加一抗：LC3B(1∶500)，p62(1∶800)、VDR(1∶800)、CYP27B1(1∶1000)、p-AMPK(1∶800)、AMPK(1∶800)、p-mTOR(1∶1000)、mTOR(1∶1000)、GAPDH(1∶2000)，4℃下孵育過夜，加相應(yīng)的二抗(1∶3000)室溫2h，加化學(xué)發(fā)光試劑在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行條帶可視化檢測。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 CYP27B1與VDR在胎盤絨毛組織中的表達(dá) IHC染色結(jié)果顯示，CYP27B1主要表達(dá)于滋養(yǎng)細(xì)胞胞漿與胞核，而VDR主要表達(dá)于滋養(yǎng)細(xì)胞胞漿。與對照組相比，RSA組胎盤絨毛組織中CYP27B1與VDR表達(dá)均顯著降低(P<0.01)。見圖1、2。RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，RSA組胎盤絨毛組織中CYP27B1與VDR mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)，見圖2。

圖1 IHC檢測CYP27B1與VDR在胎盤絨毛組織中的表達(dá)(×400)A、B：分別為CYP27B1在對照組和RSA組胎盤絨毛組織中的表達(dá)；C、D：分別為VDR在對照組和RSA組胎盤絨毛組織中的表達(dá)

圖2 對照組和RSA組胎盤絨毛組織中VDR與CYP27B1的累積吸光度值及mRNA表達(dá)水平A、B:對照組和RSA組胎盤絨毛組織中VDR與CYP27B1的累積吸光度值;C、D：RT-PCR檢測胎盤絨毛組織中CYP27B1與VDR的mRNA表達(dá)水平;**P<0.01 vs 對照組

2.2 胎盤絨毛組織中自噬水平檢測 Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，RSA組胎盤絨毛組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著降低，p62蛋白表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

2.3 轉(zhuǎn)染siRNA后滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞中VDR表達(dá)顯著降低 RT-PCR與Western blot檢測結(jié)果示，與轉(zhuǎn)染si-NC組相比，轉(zhuǎn)染si-VDR組滋養(yǎng)細(xì)胞中VDR mRNA與蛋白表達(dá)均顯著降低(均P<0.01)，見圖4。

圖3 Western blot法檢測胎盤絨毛組織中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ與p62蛋白表達(dá)*P<0.05 vs 對照組

圖4 RT-PCR與Western blot檢測轉(zhuǎn)染siRNA后滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞中VDR表達(dá)A：RT-PCR檢測;B:Western blot檢測。**P<0.01 vs 轉(zhuǎn)染si-NC的滋養(yǎng)細(xì)胞

2.4 VD通過VDR介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖 MTT與EdU檢測結(jié)果表明，與si-NC組相比，si-NC+VD組的細(xì)胞增殖能力顯著增加(P<0.05)，si-VDR+VD無明顯改變(P>0.05)，si-NC+VD+3-MA組明顯降低(P<0.05)；與si-NC+VD組相比，si-VDR+VD與si-NC+VD+3-MA組的增殖能力均明顯降低(P<0.05)，見圖5A、B。

2.5 VD通過VDR介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-NC+VD組的細(xì)胞侵襲功能顯著增加(P<0.05)，si-VDR+VD無明顯改變(P>0.05)，si-NC+VD+3-MA組的細(xì)胞侵襲功能明顯降低(P<0.05)；與si-NC+VD組相比，si-VDR+VD與si-NC+VD+3-MA組的細(xì)胞侵襲功能均明顯降低(P<0.05),見圖5C。

圖5 MTT與EdU法檢測各組滋養(yǎng)細(xì)胞增殖能力改變及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)A：MTT法檢測；B：EdU法檢測;C:Transwell實(shí)驗(yàn)檢測;1:si-NC組;2:si-NC+VD組;3:si-VDR+VD組;4:si-NC+VD+3-MA組

2.6 VD通過VDR介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞的自噬 TEM觀察各組滋養(yǎng)細(xì)胞中自噬囊泡的形成結(jié)果顯示，自噬囊泡呈雙層膜包裹胞質(zhì)成分的液泡狀結(jié)構(gòu)；與si-NC組相比，si-NC+VD組的細(xì)胞中自噬囊泡數(shù)明顯增加(P<0.05)，si-VDR+VD組無明顯改變(P>0.05)，而si-NC+VD+3-MA組顯著減少(P<0.05)；但與si-NC+VD組相比，si-VDR+VD組與si-NC+VD+3-MA組細(xì)胞中自噬囊泡數(shù)均明顯減少(P<0.05)。免疫熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-NC+VD組細(xì)胞LC3B的熒光斑點(diǎn)數(shù)顯著增加(P<0.05)，si-VDR+VD組無顯著差異(P>0.05)，而si-NC+VD+3-MA組LC3B的熒光斑點(diǎn)數(shù)明顯減少(P<0.05)，且si-NC+VD組較si-VDR+VD組與si-NC+VD+3-MA組明顯增加(P<0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-NC+VD組中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高(P<0.05)，p62蛋白明顯降低(P<0.05)，si-VDR+VD組的上述自噬相關(guān)蛋白均無明顯變化(P>0.05)，si-NC+VD+3-MA組中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯降低(P<0.05)，p62蛋白明顯降低(P<0.05)；與si-NC+VD組相比,si-VDR+VD組與si-NC+VD+3-MA組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與p62蛋白變化趨勢均明顯增加(P<0.05)，見圖6。

圖6 各組滋養(yǎng)細(xì)胞中自噬水平的檢測A：TEM觀察各組組滋養(yǎng)細(xì)胞中自噬囊泡(紅色箭頭指示自噬囊泡，bar=500nm)；B：免疫熒光顯微鏡觀察各組滋養(yǎng)細(xì)胞中LC3B在細(xì)胞中的熒光斑點(diǎn)量(×200)；C：Western blot檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與p63蛋白表達(dá)水平；1:si-NC;2:si-NC+VD;3:si-VDR+VD;4:si-NC+VD+3-MA;*P<0.05 vs si-NC組；#P<0.05 vs si-NC+VD組

2.7 VD通過VDR對滋養(yǎng)細(xì)胞AMPK/mTOR信號通路表達(dá)的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-NC+VD組細(xì)胞中CYP27B1蛋白表達(dá)，p-AMPK/AMPK比值均顯著增加(P<0.05)，但p-mTOR/mTOR比值明顯降低(P<0.05)，si-VDR+VD組上述相關(guān)蛋白指標(biāo)均無明顯變化(P>0.05)，而si-NC+VD+3-MA組中CYP27B1蛋白與p-mTOR/mTOR比值明顯增加(P<0.05)、但p-AMPK/AMPK比值顯著降低(P<0.05)；同時與si-VDR+VD組相比，si-VDR+VD組與si-NC+VD+3-MA組中p-AMPK/AMPK比值顯著降低(P<0.05)，但p-mTOR/mTOR比值明顯增加(P<0.05)，見圖7。

圖7 Western blot檢測各組滋養(yǎng)細(xì)胞中CYP27B1蛋白表達(dá)及AMPK和mTOR磷酸化水平表達(dá)1:si-NC組;2:si-NC+VD組;3:si-VDR+VD組;4:si-NC+VD+3-MA組;*P<0.05 vs si-NC組；#P<0.05 vs si-NC+VD組

3 討 論

研究表明，活性形式的VD能改善胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的功能障礙。Westwood等[15]發(fā)現(xiàn)，子癇前期中VD能降低抑制鞘氨醇-1-磷酸表達(dá)來改善滋養(yǎng)細(xì)胞遷移功能的損傷。本研究證實(shí)，VD能上調(diào)滋養(yǎng)細(xì)胞的自噬水平，顯著促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖與侵襲功能。表明VD可能是改善滋養(yǎng)細(xì)胞功能損傷的有效藥物。

大量數(shù)據(jù)證實(shí)，RSA患者胎盤組織中VDR表達(dá)與VD代謝較正常妊娠女性明顯降低[8,11]。表明VD及其相關(guān)代謝可能與RSA的病因與發(fā)病機(jī)制有關(guān)。既往關(guān)于VD在RSA中的作用多集中在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)方面。Ji等[16]結(jié)果顯示，RSA患者外周血中VD含量與較低的Treg/Th17比值呈正相關(guān)，補(bǔ)充VD能明顯增加RSA患者外周Treg/Th17的比值。但由于1,25(OH2)D3在機(jī)體中被迅速代謝，臨床常用血清25OHD水平來指示VD的狀態(tài)。同時，催化活性VD代謝的CYP27B1在母胎界面分布廣泛，且最新的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)其具有類似VD的功能，能參與妊娠建立或維持的某些機(jī)制[17]。本研究結(jié)果顯示，與正常妊娠女性比較，RSA患者胎盤絨毛組織中VDR與CYP27B1表達(dá)均顯著降低，這與上述研究結(jié)論一致；兩組妊娠女性外周血中25OHD含量無明顯差異，均存在VD含量的不足現(xiàn)象(<50nmol/L),這與Hou等[18]結(jié)論一致，可能與體內(nèi)25OHD廣泛的生物作用與代謝相關(guān)。

自噬作為真核細(xì)胞中維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一種重要代謝過程，其功能障礙能通過影響細(xì)胞的功能直接參與多種疾病，如心肌梗死、腫瘤、糖尿病和RSA等的發(fā)生發(fā)展[19]。而在生殖領(lǐng)域，有研究表明，抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的自噬水平能降低父系表達(dá)基因10的水平，進(jìn)而導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力減弱，同時自噬受到抑制的滋養(yǎng)細(xì)胞能減弱蛻膜自然殺傷細(xì)胞的分泌功能，進(jìn)一步降低其增殖與侵襲能力[9]。在滋養(yǎng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激模型中發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能通過其抗氧化與促自噬作用顯著改善過氧化氫誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞功能損傷，降低其凋亡率[20]。這表明自噬在滋養(yǎng)功能的維持中具有關(guān)鍵地位。此外，有研究通過對比健康孕婦與RSA患者的滋養(yǎng)層細(xì)胞中的自噬水平發(fā)現(xiàn)，RSA患者的絨毛中自噬囊泡數(shù)顯著減少，且分布紊亂，提示RSA患者滋養(yǎng)層細(xì)胞的自噬活性明顯降低[9]。同時，國內(nèi)外大量學(xué)者研究證實(shí)，VD在多種疾病中能通過調(diào)節(jié)自噬水平發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞與組織正常功能的作用。肖超等[21]發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病中VD能通過逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的自噬水平的下調(diào)，保護(hù)足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能損傷，改善疾病的進(jìn)展。在幽門螺桿菌感染的胃黏膜上皮細(xì)胞中，補(bǔ)充VD可恢復(fù)溶酶體的降解功能，上調(diào)細(xì)胞的自噬水平促使幽門螺桿菌的清除[22]。上述文獻(xiàn)表明，VD可通過促進(jìn)多種組織細(xì)胞的自噬水平維持其正常功能。眾所周知，LC3是檢測自噬的常用指標(biāo)。在自噬過程中，胞質(zhì)可溶形式的LC3-Ⅰ與親脂性磷脂酰乙醇胺結(jié)合轉(zhuǎn)換為自噬囊泡相關(guān)形式的LC3-Ⅱ，而p62作為最為著名的自噬底物，它能與泛素化蛋白進(jìn)行結(jié)合，并在自噬體的降解過程中被消耗。Li等[23]研究表明，VD可提高高脂喂養(yǎng)小鼠肝臟中LC3-Ⅱ的表達(dá)，從而誘導(dǎo)自噬能力的增強(qiáng)促進(jìn)肝臟脂質(zhì)的清除。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)，RSA患者胎盤絨毛組織中的自噬水平較正常對照組顯著降低，而外源性予以滋養(yǎng)細(xì)胞活性VD可促進(jìn)細(xì)胞的增殖與侵襲功能，并提高LC3-Ⅱ表達(dá)，降低p62含量，上調(diào)細(xì)胞的自噬水平，而上述作用能被沉默VDR的siRNA與自噬抑制劑3-MA所抵消，表明VD發(fā)揮促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞功能的作用與VDR和細(xì)胞自噬水平的提高相關(guān)。

調(diào)控細(xì)胞自噬的信號通路眾多，但多項(xiàng)研究證實(shí)AMPK/mTOR信號通路是自噬的重要調(diào)控因子，且該通路也是參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、侵襲與凋亡等行為的重要信號級聯(lián)途徑[24-25]。同時，既往有文獻(xiàn)報(bào)道，VD能通過激活A(yù)MPK，下調(diào)mTOR誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞和單核細(xì)胞的自噬抑制[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，VD可上調(diào)AMPK途徑而抑制mTOR信號的傳導(dǎo)，這與其在2型糖尿病中的對肝臟脂質(zhì)失調(diào)的改善機(jī)制一致[27]。

綜上所述，RSA患者胎盤絨毛組織中VD、VDR和自噬水平表達(dá)較正常妊娠女性顯著降低，而外源性予以VD能顯著促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖與侵襲功能，并上調(diào)其自噬水平，而這可能通過AMPK/mTOR信號通路發(fā)揮作用。本研究為VD/VDR在RSA患者中的潛在應(yīng)用價值提供了新的見解與思路，有望為VD在臨床實(shí)踐中的研究提供依據(jù)。