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銀杏葉提取物對小鼠氣管平滑肌舒張作用研究

2022-08-06 10:05于孟飛
亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥 2022年7期
關(guān)鍵詞:離子通道陽離子平滑肌

高 云,廖 燦,于孟飛*,黃 露

(1.中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,湖北 武漢 430074;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院 藥劑科,湖北 武漢 430077)

目前,醫(yī)學(xué)界主要以β2受體激動劑與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合使用來緩解哮喘癥狀[1-2],但應(yīng)用中草藥等補(bǔ)充和替代藥物治療哮喘依然廣泛。銀杏葉提取物(EGB)中含有銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯、多糖、蒽醌等化合物,其主要成分為24%的黃酮苷和6%的內(nèi)酯。研究證實(shí),銀杏葉提取物具有抗氧化、擴(kuò)張血管、降血壓、輔助降血脂等功效,并可降低氣道重塑重要調(diào)節(jié)因子MMP-9的表達(dá)[3-5]。因此,銀杏葉提取物具備成為一種新型支氣管擴(kuò)張劑的潛力。本研究旨在探究銀杏葉提取物對于預(yù)收縮的氣管平滑肌的舒張作用,研究引起其舒張的作用機(jī)制,以期為銀杏葉藥物開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性小鼠,平均年齡6~8周,體質(zhì)量(22.1±2.2)g,購自湖北省疾病預(yù)防控制中心(合格證號:42000600036099)。雄鼠飼養(yǎng)于室溫約25 ℃、濕度約50%和12 h光暗循環(huán)中的適宜條件。該實(shí)驗(yàn)已獲得中南民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理道德委員會批準(zhǔn)(許可證號:2019YMF06)。實(shí)驗(yàn)動物從業(yè)人員上崗證號:TY2018716。雄性小鼠每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次,以正常小鼠初始張力為對照。

1.2 試劑

銀杏葉提取物粉末(西安天一生物技術(shù)公司提供);吡唑3(批號:083113)、硝苯地平(批號:MKCB9232)、乙酰膽堿(批號:BCBV3168)均購自美國Sigma公司。

1.3 儀器

JH-2型張力換能器(購自中國北京航天醫(yī)學(xué)工程研究所);生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(BL-420S),HV-4型離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)和超級恒溫水浴(HW-1000)(均購自成都泰盟科技有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)藥物制備

精密稱取700 mg的銀杏葉提取物粉末,加入2 mL DMSO混勻,得到濃度為350 g·L-1的銀杏葉藥液,調(diào)節(jié)pH值至7.4。Nifedipine用DMSO溶解,配成母液濃度為10 μmol/L;Pyr3用DMSO溶解,配成母液濃度為30 μmol/L;Ach用高鈣溶液溶解,配成母液濃度為100 μmol/L。

1.5 方法

1.5.1 實(shí)驗(yàn)預(yù)處理 調(diào)節(jié)HV-4離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)至37 ℃,調(diào)節(jié)通氧量適量,向每個浴槽中加入6 mL的高鈣溶液,最后設(shè)置生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(BL-420S)的參數(shù)。

1.5.2 氣管制備 剪取處死后昆明鼠長度約為5 mm左右的氣管環(huán),將氣管環(huán)通過掛鉤掛在張力換能系統(tǒng)上,置于含有6 mL高鈣液并持續(xù)通氧的37 ℃恒溫水浴槽內(nèi)。調(diào)節(jié)張力為300 mg進(jìn)行平衡,每15 min換液1次,共換4次高鈣液,平衡1 h后開始正式實(shí)驗(yàn)。

1.5.3 銀杏葉提取物濃度梯度對Ach預(yù)收縮的舒張作用實(shí)驗(yàn) 氣管環(huán)經(jīng)過高鈣液平衡4次后,加入6 μL 100 μmol/L的Ach,等待氣管環(huán)收縮達(dá)最大值且穩(wěn)定后,依次加入適當(dāng)體積的350 g·L-1的銀杏葉藥液,使其濃度梯度依次為10-2,10-1.5,10-1,10-0.5,100,100.5,100.75,101g·L-1,加入的銀杏葉藥液體積分別為0.17 μL、0.37 μL、1.16 μL、3.72 μL、11.8 μL、37.5 μL、43.3 μL、78.4 μL,每個濃度進(jìn)行12 min的實(shí)驗(yàn),并觀察不同濃度所能引起的最大舒張值。每個濃度在6個氣管環(huán)上重復(fù)。

1.5.4 銀杏葉提取物對預(yù)收縮后Nifedipine阻斷后的舒張作用實(shí)驗(yàn) 氣管環(huán)經(jīng)過高鈣液平衡1 h后,向灌流槽中加入6 μL 100 μmol/L的Ach,待氣管環(huán)達(dá)到平臺期后,向恒溫通氧的水浴槽中加入6 μL 10 μmol/L的L型鈣離子通道抑制劑Nifedipine,待其舒張達(dá)到最大值且穩(wěn)定后,加入濃度350 g·L-1的銀杏葉藥液43.3 μL,觀察肌張力曲線變化。該實(shí)驗(yàn)在6個氣管環(huán)上重復(fù)。

1.5.5 銀杏葉提取物對預(yù)收縮后Pyr3阻斷后的舒張作用實(shí)驗(yàn) 氣管環(huán)經(jīng)高鈣液平衡1 h后,向灌流槽中加入6 μL 100 μmol/L的Ach,待氣管環(huán)達(dá)到平臺期后,向恒溫通氧的水浴槽中加入6 μL 30 μmol/L的非選擇性陽離子通道抑制劑Pyr3,待其舒張達(dá)到最大值且穩(wěn)定后,加入濃度350 g·L-1的銀杏葉藥液43.3 μL,觀察肌張力曲線變化,該實(shí)驗(yàn)在6個氣管環(huán)上重復(fù)。

1.5.6 銀杏葉提取物對高K+誘導(dǎo)的預(yù)收縮舒張作用實(shí)驗(yàn) 氣管環(huán)經(jīng)過平衡和預(yù)刺激操作后,向灌流槽中加入120 μL高鉀溶液,刺激氣管環(huán)并使小鼠氣管收縮達(dá)到最佳狀態(tài),等待肌張力曲線進(jìn)入平臺期,記錄肌張力曲線顯示數(shù)值。然后加入濃度350 g·L-1的銀杏葉藥液98 μL,觀察肌張力曲線變化情況。該實(shí)驗(yàn)在6個氣管環(huán)上重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 銀杏葉提取物對Ach誘導(dǎo)的預(yù)收縮舒張作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,銀杏葉提取物(EGB)能夠誘導(dǎo)Ach預(yù)收縮的氣管環(huán)舒張,且這種舒張呈現(xiàn)濃度依賴性,當(dāng)銀杏葉提取物濃度達(dá)到5.62 mg/mL時,舒張作用達(dá)到最大。將引起氣管環(huán)最大收縮的最低濃度5.62 mg/mL作為本次實(shí)驗(yàn)的最佳藥物濃度。圖1A為不同濃度銀杏葉提取物對Ach預(yù)收縮的氣管環(huán)舒張作用,圖1B為不同濃度銀杏葉提取物對Ach預(yù)收縮的氣管環(huán)舒張的劑量曲線。

圖1 銀杏葉提取物對Ach預(yù)收縮的氣管環(huán)的舒張作用

2.2 Nifedipine對銀杏葉提取物舒張氣管平滑肌的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,10 μmol/L的Nifedipine能夠部分阻斷Ach誘導(dǎo)的收縮,5.62 mg/mL的銀杏葉提取物又部分阻斷了Ach誘導(dǎo)的收縮。Nifedipine是一種L型鈣離子通道特異性阻斷劑,具有抑制鈣離子內(nèi)流的作用,能松弛血管平滑肌。Ach同時激活非選擇性陽離子通道和L型鈣離子通道,從而導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流和胞質(zhì)內(nèi)鈣離子增加進(jìn)而觸發(fā)氣管平滑肌收縮。這些結(jié)果表明,銀杏葉提取物可能通過抑制L型鈣離子通道和非L型鈣離子通道來參與Ach誘導(dǎo)的氣管平滑肌的舒張,隨后驗(yàn)證銀杏葉提取物是否可能通過抑制非選擇性的陽離子通道來參與Ach誘導(dǎo)的氣管平滑肌舒張。圖2表示銀杏葉提取物在Nifedipine存在的條件下對Ach預(yù)收縮的氣管環(huán)的舒張作用。

注:與Ach組比較,*P<0.05;與ACH+Nifedipine組相比較,

2.3 Pyr3對銀杏葉提取物舒張氣管平滑肌的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,30 μmol/L的Pyr3能夠部分地阻斷Ach誘導(dǎo)的收縮,5.62 mg/mL的銀杏葉提取物又部分地阻斷了Ach誘導(dǎo)的收縮。Pyr3是陽離子通道TRPC3和Orai1的非選擇性抑制劑,能夠部分抑制Ach誘導(dǎo)的收縮。這些結(jié)果表明,非選擇性陽離子通道可能參與了銀杏葉提取物誘導(dǎo)的氣管環(huán)舒張。圖3表示銀杏葉提取物在Pyr3存在的條件下對Ach預(yù)收縮的氣管環(huán)的舒張作用。

注:與Ach組比較,*P<0.05;與ACH+Pyr3組相比較,#P<0.05。

2.4 銀杏葉提取物對高K+誘導(dǎo)的預(yù)收縮的舒張作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,濃度為5.62 mg/mL的銀杏葉提取物能完全舒張高鉀誘導(dǎo)的收縮。高鉀離子溶液通過去極化激活L型鈣離子通道,進(jìn)而引起氣管平滑肌收縮。這些結(jié)果表明,銀杏葉提取物可通過抑制高鉀溶液激活的L型鈣離子通道舒張氣管平滑肌。圖4為銀杏葉提取物對高鉀預(yù)收縮的舒張作用。

注:與K+組比較,*P<0.05。

3 討論

銀杏葉提取物是一種前景較好的可用于治療氣道炎癥的生物資源[6-8]。據(jù)研究報道,銀杏葉提取物中含有豐富的黃酮,而黃酮是一類具有極佳抗炎效果的物質(zhì)。此外,在銀杏葉提取物中存在一類特有的萜類物質(zhì)銀杏內(nèi)酯,被公認(rèn)是一種天然的PAF拮抗劑,而PAF在氣道炎癥中至關(guān)重要,可導(dǎo)致肺氣道炎癥加重[9-12]。銀杏葉提取物對氣管平滑肌是否具有舒張作用,其相應(yīng)的作用機(jī)理如何,值得進(jìn)行深入研究。

為了解銀杏葉提取物舒張氣管平滑肌的機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)研究了L型鈣離子通道阻斷劑對于銀杏葉提取物舒張氣管的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,L型鈣離子通道阻斷劑Nifedipine可部分舒張已收縮的氣管,而銀杏葉提取物可持續(xù)引起氣管舒張,但舒張作用較對照情況下(圖2)顯著變小。這表明銀杏葉提取物可通過阻斷L型鈣離子通道來實(shí)現(xiàn)對氣管平滑肌的舒張作用。本實(shí)驗(yàn)還研究非選擇性的陽離子阻斷劑對于銀杏葉提取物舒張氣管的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,非選擇性的陽離子阻斷劑Pyr3可部分舒張已收縮的氣管,而銀杏葉提取物可持續(xù)有效舒張氣管平滑肌,但舒張作用較對照情況下(圖3)顯著變小。這表明銀杏葉提取物可通過阻斷鈣敏感通路實(shí)現(xiàn)對氣管平滑肌的舒張作用。為深入研究銀杏葉舒張氣管平滑肌的機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)探討了銀杏葉提取物對于高K+收縮的氣管平滑肌的舒張作用。由圖4可見,銀杏葉可強(qiáng)烈舒張高K+引起的氣管平滑肌收縮。這可能是因?yàn)殂y杏葉可通過阻斷L型鈣離子通道,從而發(fā)揮舒張氣管平滑肌的作用。

銀杏葉對于氣管平滑肌具有強(qiáng)烈的舒張作用,其舒張作用主要通過L型鈣離子通道和鈣敏感通道發(fā)揮作用。因此,將銀杏葉開發(fā)為治療慢性支氣管炎、哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的藥物具備潛在可能性。

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