繆培，張通，米海霞，張偉東

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院，北京市 101199；2.中國康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院，北京市 100068；3.首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，北京市 100068；4.國家衛(wèi)生健康委員會(huì)保健局，北京市 100044

0 引言

腦卒中是最常見的嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)疾病，約88%是缺血性腦卒中。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型為研究缺血性腦卒中的病理生理過程提供了重要手段[1]。

大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlu‐sion,MCAO)模型是目前最常用的模擬人類腦梗死的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。制備MCAO模型的方法很多，如光化學(xué)法、三氯化鐵法、線栓法、自體血栓法、電流損傷法、自發(fā)性MCAO 等[2]。Zea Longa 線栓法[3]具有不開顱、效果肯定、可準(zhǔn)確控制缺血時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最廣泛的方法。根據(jù)線栓保留時(shí)間，可分為永久性腦缺血模型和腦缺血再灌注模型，分別模擬沒有再灌注的腦梗死和血管再通的腦梗死[4]。探討不同模型大鼠功能預(yù)后，對(duì)選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型十分重要。

既往比較不同MCAO大鼠模型間差異的研究主要集中于急性期，觀察指標(biāo)局限在梗死體積和病理生理方面[5-9]。腦梗死會(huì)出現(xiàn)長期感覺運(yùn)動(dòng)功能和認(rèn)知功能障礙，慢性期的研究也非常重要；對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死動(dòng)物模型長期預(yù)后的研究主要集中于感覺運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能方面[10]。也有學(xué)者探討不同MCAO 模型間恢復(fù)期差異，主要集中于行為學(xué)方面，且均非線栓法[11-12]。

局灶性腦缺血大鼠存在自發(fā)恢復(fù)[13]，探討腦梗死動(dòng)物模型在自發(fā)恢復(fù)過程中的認(rèn)知功能變化，對(duì)評(píng)估藥物或康復(fù)策略的長期效果很有必要。

彌散張量成像(diffusion tensor imaging,DTI)利用水分子在不均質(zhì)組織中的擴(kuò)散具有各向異性特征進(jìn)行成像，最常用的參數(shù)是各向異性分?jǐn)?shù)(fractional anisot‐ropy,FA)[14]。

本研究比較永久性缺血和缺血再灌注大鼠模型在自然恢復(fù)狀態(tài)下認(rèn)知功能恢復(fù)的差異，并分析DTI 相應(yīng)感興趣腦區(qū)的FA，為選取理想的局灶性腦缺血大鼠模型進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供參考；同時(shí)探討功能恢復(fù)與腦結(jié)構(gòu)變化的關(guān)系，為預(yù)測(cè)腦梗死功能恢復(fù)提供臨床參考。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性Sprague-Dawley 大鼠21 只，體質(zhì)量250～280 g，SPF 級(jí)，飼養(yǎng)于北京友誼醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部動(dòng)物屏障實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)SYXK(京)2012-0023。

本研究已經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)倫理審核(No.AEEI-2014-132)。

1.2 模型制備

將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=7)、永久性缺血組(n=7)和缺血再灌注組(n=7)。禁食水12 h。

永久性缺血組以10%水合氯醛3 mL/kg 腹腔注射麻醉，仰臥位固定于操作臺(tái)上，頸部正中切口，鈍性分離暴露左頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈分岔處，結(jié)扎頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈近心端，動(dòng)脈夾臨時(shí)夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，于頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端做一切口，插入相應(yīng)直徑的硅膠頭線栓，使其沿頸總動(dòng)脈進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始部，有輕微阻力感時(shí)停止，深約1.8～2.0 cm。固定線栓，檢查無出血后縫合切口。每天皮下注射生理鹽水5 mL補(bǔ)液，連續(xù)3 d。

缺血再灌注組基本操作同永久性缺血組，插入線栓后開始計(jì)時(shí)；固定線栓，縫合頸部皮膚，使栓線尾端暴露于皮膚外；90 min 后再次麻醉大鼠，拆除頸部皮膚縫合線，拔出栓線；縫合頸部皮膚。

假手術(shù)組僅暴露左頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈分岔處后，縫合切口。

手術(shù)過程中保持室溫＞25 ℃。術(shù)后予電熱毯保暖，維持肛溫(37±0.5)℃。予充足的食物和水。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

造模后參照Longa 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[3]評(píng)分：0 分，無神經(jīng)功能損傷癥狀；1分，不能伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3 分，向?qū)?cè)傾倒；4 分，不能自發(fā)行走；5分，意識(shí)喪失。1～3分納入實(shí)驗(yàn)。所有大鼠均納入。

1.4 Morris水迷宮

Morris 水迷宮(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)直徑170 cm，高50 cm，水池內(nèi)壁漆為黑色，水溫(23±1)℃。室內(nèi)光照恒定，無光線反射在池內(nèi)。將水池分為四個(gè)象限，第一象限正中距離池壁35 cm 處放直徑9 cm、高35 cm 的圓形平臺(tái)，平臺(tái)頂?shù)陀谒? cm，水池中倒入墨水掩蓋平臺(tái)。水迷宮上方攝像機(jī)同步記錄大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡。訓(xùn)練期間，水迷宮外參照物保持不變。

1.4.1 定位航行實(shí)驗(yàn)

大鼠從術(shù)后16 d 開始，于每天上午8:00～11:00 訓(xùn)練4 次，共6 d。依次選擇4 個(gè)象限作為入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水池，同一次訓(xùn)練所有大鼠入水點(diǎn)相同。如大鼠在水中游泳一段時(shí)間后爬上站臺(tái)，并在站臺(tái)上停留時(shí)間超過3 s，認(rèn)為大鼠找到站臺(tái)，系統(tǒng)記錄大鼠在水中游泳時(shí)間，為逃避潛伏期。如大鼠90 s 內(nèi)未找到平臺(tái)，人為將其引導(dǎo)上平臺(tái)，潛伏期記為90 s；大鼠爬上平臺(tái)或被引導(dǎo)上平臺(tái)后，讓其在平臺(tái)上休息10 s。取四次訓(xùn)練的平均值。第1 天訓(xùn)練為適應(yīng)性訓(xùn)練，不計(jì)入統(tǒng)計(jì)。

1.4.2 空間探索實(shí)驗(yàn)

訓(xùn)練第7天(術(shù)后22 d)撤除平臺(tái)，將大鼠從第三象限面向池壁放入水中120 s。記錄其第一次到達(dá)平臺(tái)所在位置時(shí)間(潛伏期)，在各象限的游泳路程、時(shí)間、速度，以及大鼠在站臺(tái)周圍活動(dòng)路程、時(shí)間、游泳路徑。計(jì)算平臺(tái)象限與邊界游泳路程比和時(shí)間比。

1.5 DTI

術(shù)后22 d，各組選Longa 評(píng)分相近的4 只大鼠，采用PharmaScan 7.0 T MRI 掃描儀(德國BRUKER BIOSPIN 公司)進(jìn)行掃描，包括定位圖、T2WI、T2map及DTI。定位圖采用RARE序列，層厚1 mm，掃描層數(shù)8 層，TR 2000 ms，TE 32.2 ms，偏轉(zhuǎn)角180°，視野330×330 mm，矩陣256×256；T2WI 采用RARE 序列，層厚0.7 mm，掃描層數(shù)30 層，TR 5000 ms，TE 36 ms，偏轉(zhuǎn)角180°，視野330×330 mm，矩陣256×256；DTI 采用SE-EPI 序列，彌散敏感梯度為非共線且非共面的30 個(gè)梯度方向，b=1000 s/mm2，同時(shí)包括5 個(gè)b=0 s/mm2的DTI 圖像，層厚0.7 mm，掃描層數(shù)30 層，TR 7500 ms，TE 25 ms，偏轉(zhuǎn)角90°，視野330×330 mm，矩陣256×256，相位編碼方向?yàn)閺淖蟮接?，平均激?lì)次數(shù)4次。

數(shù)據(jù)由同一實(shí)驗(yàn)人員在工作站采集，選T2WI 顯示缺血灶面積最大的層面，在病灶側(cè)選缺血皮質(zhì)區(qū)和紋狀體區(qū)面積1 mm2的感興趣區(qū)；以冠狀位為軸，在對(duì)側(cè)相應(yīng)位置取相同面積感興趣區(qū)。測(cè)定感興趣區(qū)FA，計(jì)算病灶側(cè)與對(duì)側(cè)比值(rFA)。

選T2WI海馬層面，選取病灶側(cè)海馬區(qū)面積1 mm2感興趣區(qū)，以冠狀位為軸，在對(duì)側(cè)相應(yīng)位置取相同面積感興趣區(qū)。測(cè)定感興趣區(qū)FA，計(jì)算rFA。

采用Image J 軟件分別劃取大鼠各層面腦梗死區(qū)域，計(jì)算腦梗死體積和梗死體積比。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以()表示，若符合正態(tài)分布且方差齊，則采用單因素方差分析或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；若不符合正態(tài)分布，則采用秩和檢驗(yàn)；多組重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析。大鼠感興趣區(qū)有顯著性差異的DTI參數(shù)與有顯著性差異的認(rèn)知功能相關(guān)指標(biāo)行Spearman相關(guān)分析。顯著性水平，秩和檢驗(yàn)采用校正α=0.017，其余檢驗(yàn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮

2.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn)

三組逃避潛伏期均隨訓(xùn)練時(shí)間增加呈下降趨勢(shì)，永久性缺血組無顯著性差異(P＞0.05)，但永久性缺血組第3天、第5天時(shí)潛伏期小于第1天(P＜0.05)。

組間比較，永久性缺血組各時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期均大于假手術(shù)組和缺血再灌注組(P＜0.05)。缺血再灌注組與假手術(shù)組相比無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較 單位：s

2.1.2 空間探索實(shí)驗(yàn)

三組平臺(tái)象限時(shí)間比、距離比無顯著性差異(P＞0.017)；永久性缺血組和缺血再灌注組邊界時(shí)間比和距離比大于假手術(shù)組(P＜0.017)，永久性缺血組潛伏期大于假手術(shù)組(P＜0.017)。三組平均速度值無顯著性差異(P＞0.017)。見表2。

2.1.3 游泳路徑

假手術(shù)組和缺血再灌注組探索軌跡趨向性、目的性更強(qiáng)，主要集中于水池內(nèi)部，永久性缺血組路徑集中于周邊。見圖1。

圖1 三組游泳路徑

2.2 DTI

2.2.1 皮質(zhì)

皮質(zhì)左側(cè)(患側(cè))FA 和rFA 由小到大依次為永久性缺血組＜缺血再灌注組＜假手術(shù)組(P＜0.05)。三組間右側(cè)FA無顯著性差異(P＞0.05)。見表3。

表3 三組皮質(zhì)感興趣區(qū)FA及rFA值比較

2.2.2 紋狀體

紋狀體左側(cè)FA 由小到大依次為永久性缺血組＜缺血再灌注組＜假手術(shù)組(P＜0.05)。rFA 由小到大依次為永久性缺血組=缺血再灌注組＜假手術(shù)組(P＜0.05)。三組間右側(cè)FA無顯著性差異(P＞0.05)。見表4。

2.2.3 海馬

三組間海馬左側(cè)、右側(cè)FA和rFA均無顯著性差異(P＞0.05)。見表5。

表5 三組海馬感興趣區(qū)FA及rFA值比較

2.2.4 梗死體積

永久性缺血組梗死體積和梗死體積比明顯大于缺血再灌注組(P＜0.01)。見表6。

表6 兩組梗死體積比較

2.3 相關(guān)性分析

逃避潛伏期、邊界時(shí)間比和距離比與皮質(zhì)和紋狀體左側(cè)FA、rFA 均相關(guān)(P＜0.05)。水迷宮測(cè)試的潛伏期和邊界時(shí)間比與梗死體積和梗死體積比均相關(guān)(P＜0.05)。見表7。

表7 DTI參數(shù)與Morris水迷宮相關(guān)參數(shù)的相關(guān)性分析

3 討論

Morris 水迷宮是用來評(píng)定局灶性腦缺血大鼠空間學(xué)習(xí)能力和記憶能力的常用方法[15-17]，逃避潛伏期代表動(dòng)物空間學(xué)習(xí)能力。本研究顯示，永久性缺血模型和缺血再灌注模型大鼠學(xué)習(xí)能力均有損傷，缺血再灌注大鼠損傷較輕。

空間探索實(shí)驗(yàn)中，大鼠尋找平臺(tái)所在位置的游泳策略是衡量動(dòng)物分析判斷能力和解決問題能力的指標(biāo)。正常大鼠隨著訓(xùn)練次數(shù)增加，游泳軌跡更有趨向性和直線性，目的性較強(qiáng)，而癡呆大鼠可能更趨向于邊緣性和隨機(jī)性。本研究顯示，永久性缺血模型大鼠游泳路徑屬典型的邊緣式，提示認(rèn)知損傷較重。三組大鼠平均速度基本相同，可排除速度對(duì)結(jié)果的影響。與Roof等[11]的結(jié)果一致，永久性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力損傷持久而嚴(yán)重。

DTI 通過改變擴(kuò)散敏感梯度方向，測(cè)量體素內(nèi)水分子在各個(gè)方向上的擴(kuò)散強(qiáng)度[14]，F(xiàn)A指各向異性部分與總擴(kuò)散張量之比[18]，主要反映腦組織神經(jīng)纖維的多少、排列方向的一致性及纖維束完整性，可用于評(píng)價(jià)組織結(jié)構(gòu)完整性、病理改變及組織結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系[19],臨床應(yīng)用最為廣泛。

大鼠MCAO模型造成紋狀體及額頂顳葉、部分枕葉等區(qū)域損傷，丘腦、下丘腦、黑質(zhì)等部位也會(huì)出現(xiàn)不同程度損傷[20-21]。腦梗死后，由于梗死區(qū)白質(zhì)和灰質(zhì)結(jié)構(gòu)小梁破壞，急性期和亞急性期FA 減小[22]。慢性期，F(xiàn)A 可能增加，可能與運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)功能恢復(fù)有關(guān)；也可能隨著缺血持續(xù)，血管源性水腫、細(xì)胞膜碎裂、細(xì)胞壞死，結(jié)構(gòu)小梁破壞，導(dǎo)致FA 持續(xù)降低[23]。本實(shí)驗(yàn)中模型大鼠患側(cè)皮質(zhì)、紋狀體區(qū)FA和rFA均明顯下降，可能反映皮質(zhì)、紋狀體區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和髓鞘結(jié)構(gòu)的破壞，神經(jīng)纖維完整性降低；缺血再灌注大鼠患側(cè)皮質(zhì)、紋狀體區(qū)FA、rFA 較永久性缺血大鼠增高，可能與再灌注大鼠早期恢復(fù)血流，半暗帶血供改善，細(xì)胞壞死減輕有關(guān)[24]。右側(cè)皮質(zhì)、紋狀體區(qū)FA 和rFA均無顯著性差異，提示對(duì)側(cè)皮質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)無明顯損傷。

本實(shí)驗(yàn)中，三組大鼠雙側(cè)海馬區(qū)FA、rFA 均無顯著性差異，主要由于海馬的血供主要是由大腦后動(dòng)脈分支供應(yīng)，少部分由頸內(nèi)動(dòng)脈發(fā)出的脈絡(luò)膜前動(dòng)脈供應(yīng)，因此MCAO 并不會(huì)引起海馬缺血改變[25]。有研究顯示[26]，海馬改變可能與腦梗死后，周圍皮質(zhì)形成的擴(kuò)散性抑制波有關(guān)：擴(kuò)散性抑制波會(huì)引起皮質(zhì)釋放過量谷氨酸，過量的谷氨酸順突觸傳遞到同側(cè)海馬，引起同側(cè)海馬神經(jīng)元興奮性中毒和環(huán)氧化酶2 升高，進(jìn)而引起海馬炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡。海馬與學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)[27]。兩種模型大鼠均出現(xiàn)與海馬相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶能力受損，可能與海馬區(qū)炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡有關(guān)，也可能與皮質(zhì)、紋狀體區(qū)與海馬區(qū)之間的神經(jīng)通路受損有關(guān)[28]。有研究顯示[29]，皮質(zhì)或紋狀體損傷與Morris 水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力受損有關(guān)，與本研究一致。

缺血側(cè)大腦半球距嗅球尖端7～11 mm 矢狀裂至外側(cè)裂下2/3 皮質(zhì)組織僅由大腦中動(dòng)脈供血，大鼠MCAO 模型時(shí)梗死出現(xiàn)早而完全，可代表缺血中心區(qū)；上1/3 皮質(zhì)組織由大腦前動(dòng)脈和中動(dòng)脈雙重供血，缺血較輕，表現(xiàn)為半暗帶變化[30]；缺血再灌注后主要恢復(fù)半暗帶區(qū)血流，在灌注時(shí)間窗內(nèi)恢復(fù)血流可減少梗死體積。缺血后恢復(fù)再灌注時(shí)間越長，梗死體積越大[31]。本研究顯示，缺血再灌注大鼠梗死體積較永久性腦缺血大鼠縮小，與既往研究結(jié)果一致[31-32]。

相關(guān)性分析顯示，學(xué)習(xí)記憶能力與腦梗死大鼠患側(cè)皮質(zhì)、紋狀體區(qū)FA、rFA 相關(guān)，這與湯翔宇等[33]的研究一致。有學(xué)者認(rèn)為，腦梗死體積與大鼠神經(jīng)功能缺損有一定相關(guān)性，可將梗死體積變化作為評(píng)估大鼠預(yù)后的指標(biāo)[24,32]。

綜上所述，永久性腦缺血和缺血再灌注模型大鼠均會(huì)出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能障礙，可能與缺血區(qū)神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)破壞、缺血區(qū)血管源性水腫，以及皮質(zhì)、紋狀體區(qū)與海馬未缺血區(qū)纖維聯(lián)系斷裂等相關(guān)。嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙只出現(xiàn)在永久性腦缺血大鼠模型中，缺血再灌注大鼠認(rèn)知功能損傷較輕，可能與缺血皮質(zhì)、紋狀體區(qū)神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)更加完整、梗死體積更小有關(guān)。恢復(fù)期腦損傷區(qū)域FA 增加、梗死體積變小，可能為功能恢復(fù)良好的有效預(yù)測(cè)指標(biāo)。

本研究樣本量偏小，還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。