吳淑嫻，宣佳利

(安徽衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，安徽 池州 247099)

中國每年患有神經(jīng)管畸形的新生兒有8萬～10萬，是引起嬰兒死亡、死胎的重要因素[1]。研究顯示，多種出生缺陷的神經(jīng)管畸形同女性在懷孕早期機(jī)體缺乏葉酸存在一定的相關(guān)性[2-4]。葉酸為水溶性的一種B族維生素，機(jī)體自身不能合成，只能經(jīng)膳食攝入，在機(jī)體內(nèi)通過四氫葉酸使其生理功能得到有效發(fā)揮，在細(xì)胞的增殖分裂、合成核苷酸與氨基酸的過程中發(fā)揮重要作用，為人體生長發(fā)育必要的一種微量營養(yǎng)素[5-6]。在妊娠期，對葉酸需求量增加，尤其在妊娠早期，為了滿足胎兒快速生長發(fā)育的需求，需提供充足的葉酸，滿足細(xì)胞復(fù)制要求，進(jìn)而影響母體組織、胎盤、胎兒的生長，同時在合成蛋白質(zhì)、RNA、DNA期間起到關(guān)鍵的作用[7-8]。所以，妊娠期母體的葉酸狀況一方面同自身的健康狀況有關(guān)，另一方面缺乏葉酸也會對胎兒的正常發(fā)育產(chǎn)生影響，造成諸多不良結(jié)局，如神經(jīng)嵴疾病、神經(jīng)管畸形、低出生體重、胎兒發(fā)育遲緩等[9]。高同型半胱氨酸血癥與神經(jīng)管畸形關(guān)系密切，神經(jīng)管畸形新生兒的母親血清內(nèi)同型半胱氨酸(Hcy)水平顯著提高，Hcy的蓄積是造成神經(jīng)管畸形的一個危險因素[10-11]?；诖?，本研究對30只SD雌性大鼠進(jìn)行研究，探討葉酸對孕鼠子代生長發(fā)育及孕鼠血清葉酸、Hcy水平的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 SD大鼠，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，合格證批號為SCXK(京)2012-0001，體重 22～34 g，周齡6～8周，在我院動物中心的飼養(yǎng)室喂養(yǎng)，飼養(yǎng)室相對濕度45 %～55 %，溫度24～26 ℃，飲食、水分補(bǔ)充均自由。

1.2方法 (1)構(gòu)建動物模型：將30只SD雌性大鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為缺乏葉酸組與正常葉酸組，各15只。缺乏葉酸組使用缺乏葉酸飼料飼養(yǎng)，正常葉酸組使用正常葉酸飼料飼養(yǎng)，14 d后，同成年SD正常雄鼠按照1：1的比例合籠交配。每天下午6：00合籠，第二天上午8：00將雌鼠陰道分泌物抽取至載玻片中，于顯微鏡下發(fā)現(xiàn)精子當(dāng)天記為孕0 d，之后于普通飼養(yǎng)籠飼養(yǎng)，直到取材。(2)收集標(biāo)本：受孕3周后，按3.33 mL/kg的10 %水合氯醛腹腔注射實(shí)施麻醉，剖腹后取胎，兩組分別取40只胎鼠(雌雄各半)，測量體重、頭尾長度。(3)生長發(fā)育檢測：對40只胎鼠的毛發(fā)生長、門齒萌出、仔鼠耳廓分離、雙眼睜開等生長發(fā)育相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行觀察，記錄達(dá)標(biāo)天數(shù)。(4)葉酸檢測：剖腹取胎后，斷頭處死孕鼠，將0.10 g左右的皮層額葉與雙側(cè)海馬取出，然后將0.10 g左右的肝臟左葉取出，距離幽門1 cm左右取小腸5 cm，順著腸系膜裁剪，將表皮的黏膜組織(0.05～0.10 g)輕輕刮取。吸去小腸黏膜上皮、海馬、肝臟、皮層標(biāo)本的血跡置入勻漿器(包含醋酸0.2 mol/L)內(nèi)，制成1.5 mL勻漿，于4 ℃條件下，3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，選取上清液。將事先準(zhǔn)備好的試管內(nèi)置入質(zhì)控、校正或檢測樣本200 μL，各個試管內(nèi)均置入工作液1 000 μL，混勻。全部試管放置沸騰水浴中15～20 min，之后室溫水浴箱中放置5 min冷卻。取經(jīng)過處理的樣本380 μL至樣本杯中，使用電化學(xué)發(fā)光分析儀對其葉酸水平進(jìn)行檢測。(5)Hcy檢測：分娩前，眼眥取2 mL孕鼠血于毛細(xì)管中，分娩后采集4 mL股動脈血于EDTA抗凝管內(nèi)，于4 ℃條件下，2 500 rpm離心10 min，分離血清，置入EP管，保存于-80 ℃的環(huán)境中待檢，使用全自動生化分析儀檢測Hcy水平。

2 結(jié)果

2.1兩組孕鼠子代體重、頭尾長及相關(guān)生長發(fā)育指標(biāo)比較 正常葉酸組孕鼠子代體重、頭尾長度明顯高于缺乏葉酸組(P<0.05)；毛發(fā)生長、門齒萌出、耳廓分離、雙眼睜開與缺乏葉酸組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2兩組孕鼠不同時間點(diǎn)血清葉酸水平比較 懷孕7 d前，兩組葉酸水平無明顯差異(P>0.05)；合籠交配期、妊娠第10 天、分娩后，正常葉酸組葉酸水平明顯高于缺乏葉酸組(P<0.05)。見表2。

表1 兩組孕鼠子代體重、頭尾長及相關(guān)生長發(fā)育指標(biāo)比較

表2 兩組孕鼠不同時間點(diǎn)血清葉酸水平比較

2.3兩組孕鼠不同時間點(diǎn)血清Hcy水平比較 懷孕7 d前，兩組血清Hcy水平無明顯差異(P>0.05)；妊娠第10天、分娩后，正常葉酸組血清Hcy水平明顯低于缺乏葉酸組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組孕鼠不同時間點(diǎn)血清Hcy水平比較

3 討論

四氫葉酸為葉酸活性形式，屬于人體生化反應(yīng)內(nèi)如次甲基、亞甲基、甲基等一碳單位的傳遞體，能夠?qū)κ芑蛘{(diào)控代謝合成DNA 過程進(jìn)行干預(yù)[12]。人體發(fā)育、組織生長以及細(xì)胞增殖與代謝合成DNA息息相關(guān)[13]。20世紀(jì)90年代以來，葉酸被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)管畸形等出生缺陷疾病的預(yù)防中，我國目前圍妊娠期補(bǔ)充葉酸已經(jīng)在基層普及[14]。相關(guān)研究顯示，葉酸不足能夠?qū)铣珊塑账岙a(chǎn)生影響，可以對細(xì)胞的增殖、分裂、成熟產(chǎn)生抑制作用[15]。妊娠期，胎兒及孕體生長、發(fā)育旺盛，對葉酸的需求量增加，若在懷孕期間缺乏葉酸，就會導(dǎo)致一碳單位轉(zhuǎn)移出現(xiàn)障礙，降低核酸合成，進(jìn)而對細(xì)胞周期產(chǎn)生影響[16]。依據(jù)相關(guān)報道，整個妊娠期每天口服0.4 mg葉酸增補(bǔ)劑，能夠避免41 %～85 % 新生兒神經(jīng)管畸形的發(fā)生[17]。也有文獻(xiàn)顯示，于孕早期口服葉酸會使發(fā)生唇、腭裂、先天性心臟病等出生缺陷的風(fēng)險降低[18]。所以，葉酸屬于胚胎器官發(fā)育期間不可或缺的營養(yǎng)素。

在孕期，機(jī)體的營養(yǎng)素被優(yōu)先用于胎兒生長發(fā)育的維持，若出現(xiàn)營養(yǎng)不良就會造成胎兒發(fā)育遲緩，發(fā)生新生兒低體重、宮內(nèi)生長受限等狀況[19]。體重能夠?qū)ψ哟律蟮陌l(fā)育狀況進(jìn)行客觀的反映，一般評價子代新生鼠生長發(fā)育的相關(guān)指標(biāo)還包括毛發(fā)生長、門齒萌出、仔鼠耳廓分離、雙眼睜開，上述幾項指標(biāo)均為生長發(fā)育期間的敏感點(diǎn)。本次研究選擇飼料干預(yù)的手段，按照飼料內(nèi)是否含有葉酸對雌鼠實(shí)施葉酸干預(yù)，結(jié)果顯示，飼以缺乏葉酸飼料的子代新生鼠的毛發(fā)生長、門齒萌出、仔鼠耳廓分離、雙眼睜開的達(dá)標(biāo)天數(shù)都長于飼以正常葉酸含量飼料的子代新生鼠，然而差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。首先，這可能是由于葉酸屬于微量營養(yǎng)素的一種，機(jī)體需要葉酸的數(shù)量比較低，同時葉酸的生理功能主要是參與胎兒神經(jīng)管閉合，避免出現(xiàn)神經(jīng)管畸形，所以，葉酸影響子代鼠的有關(guān)生理發(fā)育指標(biāo)可能不明顯[20]。其次，所有雌鼠都喂養(yǎng)繁殖飼料，子代鼠可以經(jīng)由母乳得到充足的營養(yǎng)素，補(bǔ)充了葉酸，跟隨日齡的不斷增加子代鼠毛發(fā)生長、門齒萌出、仔鼠耳廓分離、雙眼睜開的達(dá)標(biāo)天數(shù)的差異縮小[21]。

同型半胱氨酸(Hcy)屬于人體必要氨基酸之蛋氨酸脫甲基后出現(xiàn)的含硫氨基酸之一，為代謝半胱氨酸與蛋氨酸的中間產(chǎn)物[22]。腺苷轉(zhuǎn)移酶在催化過程中，蛋氨酸會產(chǎn)生S-腺苷蛋氨酸，同時，轉(zhuǎn)甲基酶在催化過程中，S-腺苷蛋氨酸會轉(zhuǎn)移分子內(nèi)的甲基，自身會演變?yōu)镾-腺苷同型半胱氨酸，于S-腺苷同型半胱氨酸裂解酶發(fā)揮作用的過程中將腺苷脫去，最終形成Hcy[23]。有動物實(shí)驗(yàn)顯示，通過Hcy對雞胚進(jìn)行誘導(dǎo)，Hcy能夠?qū)е律窠?jīng)管畸形及心臟畸形[24]。通過進(jìn)一步研究顯示，Hcy造成出生缺陷疾病的原理為其能夠發(fā)揮基因毒性與細(xì)胞毒性的作用，在代謝期間氧化巰基，使氧自由基大量出現(xiàn)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[25]。代謝Hcy的一個途徑是再甲基化成蛋氨酸，再甲基化需要甲基，而甲基主要由葉酸提供，所以葉酸是對血清Hcy水平產(chǎn)生影響的重要因素[26]。此外，代謝Hcy的另一個途徑為胱硫醚- β -合成酶發(fā)揮催化作用，絲氨酸同Hcy縮合為胱硫醚。如果上述途徑均出現(xiàn)代謝障礙，就會造成Hcy在體內(nèi)蓄積，積累至一定水平時就會出現(xiàn)高Hcy血癥。近幾年相關(guān)文獻(xiàn)顯示，在妊娠期，孕體蛋氨酸水平輕度減少或血清Hcy水平輕度提升能夠?qū)﹂]合神經(jīng)管產(chǎn)生影響[27]。本次研究選擇全自動生化分析儀檢測了孕鼠血清中Hcy與葉酸的含量，初步探討它們之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)隨著孕鼠血清葉酸水平的增加，飼以缺乏葉酸飼料的孕鼠的Hcy水平較正常葉酸含量飼料的孕鼠高，也就是說血清中葉酸與Hcy水平的關(guān)系表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)關(guān)系。

綜上所述，葉酸的缺乏會對孕鼠子代體重及頭尾長度產(chǎn)生影響，通過葉酸干預(yù)可以使孕鼠血清葉酸水平升高，Hcy水平降低，進(jìn)而使神經(jīng)管畸形的相關(guān)危險因素弱化。