徐 輝，焦響樂，鄭玉寬，楊 靜，郭 慧，李曉天

(1.鄭州大學第五附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052；2.鄭州大學藥學院，河南 鄭州 450066)

穿心蓮內(nèi)酯屬于二萜內(nèi)酯類化合物，是穿心蓮的主要效用成分之一，味苦性寒，主要功效是清熱解毒消腫。一般將穿心蓮干燥的地上部分作為藥用，并在采摘后曬干[1]?，F(xiàn)有研究表明,已從穿心蓮中分離出的有效化合物主要是二萜內(nèi)酯類和黃酮類，其中的代表物質(zhì)就是穿心蓮內(nèi)酯[2]。臨床已將其用于炎癥和病毒性疾病的治療，常與抗生素聯(lián)用[3-4]。近幾年,還發(fā)現(xiàn)了其更多的功效，如解熱、抗心腦血管疾病、免疫調(diào)節(jié)作用、保肝、降血糖、保護神經(jīng)等[5-9]，但是關于其抗肝癌的作用研究較少。中醫(yī)治療肝癌的藥物有丹參、藏紅花，藥物成分有姜黃素、大果山楂總黃酮、銀杏葉提取物、苦參素、甘草甜素、茶多酚，復方制劑有柴胡湯、棗杞湯、解毒膠囊等。這些藥物通過抑制腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移、調(diào)控肝細胞自噬、防止肝細胞變性壞死、減少膠原纖維產(chǎn)生、增強膠原酶的活性、改善肝臟微循環(huán)等途徑對肝癌進行防治[10-14]。也有學者認為肝癌發(fā)病與氣滯、血瘀、濕熱等病理因素瘀滯肝絡所形成的癌毒有關?，F(xiàn)代藥理學研究表明，清熱解毒中藥治療肝癌能改善患者臨床癥狀及體征,其機制與抑制腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移、聯(lián)合化療藥物增強療效、減輕化療藥物不良反應等有關[15-17]。本文研究穿心蓮內(nèi)酯對人肝癌HepG2細胞增殖、凋亡和遷移的影響，以期為穿心蓮內(nèi)酯應用于肝癌治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人肝癌細胞HepG2購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥品、試劑與儀器

穿心蓮內(nèi)酯，大連美侖生物技術有限公司產(chǎn)品，批號D1225A。DMEM培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，批號12100-500；胎牛血清，北京賽默飛世爾生物化學制品有限公司產(chǎn)品，批號SV30087.01；無血清細胞凍存液，蘇州新賽美生物科技有限公司產(chǎn)品，批號C40010；胰蛋白酶消化液，上海碧云天生物科技有限公司產(chǎn)品，批號C020；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒，江蘇凱基生物技術股份有限公司產(chǎn)品，批號KGA107。Cell Counting Kit-8(CCK-8)，美國安諾倫生物公司產(chǎn)品，批號K1018；結晶紫染色溶液，北京雷根生物技術有限公司產(chǎn)品，批號1109A20；多聚甲醛溶液，北京蘭杰柯科技有限公司產(chǎn)品，批號70071800。微量移液槍，德國艾本德公司產(chǎn)品；MiLLiPORE超純水機，上海樂楓生物科技有限公司產(chǎn)品；Spectra Mr型全波長酶標儀，美國丹耐克斯公司產(chǎn)品；TS2-S-SM型光學電子顯微鏡，日本尼康公司產(chǎn)品；HH-4恒溫水浴鍋，江蘇金壇市環(huán)宇科學儀器廠產(chǎn)品;88600V63型-80 ℃冰箱;318564-4236型細胞CO2培養(yǎng)箱，美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。

1.3 細胞培養(yǎng)與處理

HepG2細胞株采用含有100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃、50 mL/L CO2恒溫培養(yǎng)箱中。當細胞融合達到75%～85%，用胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.4 檢測指標

1.4.1 HepG2肝癌細胞增殖活性

采用CCK-8法檢測穿心蓮內(nèi)酯對HepG2肝癌細胞增殖活性的抑制作用。實驗原理：電子載體1-Methoxy PMS存在時，CCK-8中的WST-8被還原為橙黃色甲瓚產(chǎn)物，440 nm波長處用酶標儀測定吸光度(OD)值，活細胞的數(shù)量與OD值成正線性關系。在96孔板的實驗孔中滴加100 μL(約5×103個)細胞懸液，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實驗孔加入不同質(zhì)量分數(shù)(0、5、10、20、30、40、50、60 mg/L)的穿心蓮內(nèi)酯溶液，每個質(zhì)量分數(shù)設置3個復孔，放置于培養(yǎng)箱中孵育24、48、72 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，在培養(yǎng)箱中孵育1～4 h，取出在440 nm用酶標儀測量吸光度。細胞抑制率(%)=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100

其中As為實驗組吸光度，Ab為空白組(含有CCK-8和培養(yǎng)基)吸光度，Ac為對照組(含有細胞、培養(yǎng)基和CCK-8)吸光度。

1.4.2 HepG2肝癌細胞凋亡

采用Annexin V-碘化丙啶(PI)雙染法。被FITC標記的Annexin V可與凋亡細胞結合，用于區(qū)分正常細胞與凋亡細胞；PI是能區(qū)分死細胞和凋亡晚期細胞的核酸染料。故Annexin V-FITC和PI聯(lián)用可將凋亡早期與凋亡晚期細胞區(qū)分。收集HepG2細胞并接種于6孔板中，24 h后棄去培養(yǎng)基，換用不同質(zhì)量分數(shù)(0、5、10、25 mg/L)含藥穿心蓮內(nèi)酯培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后,胰酶消化細胞并加入完全培養(yǎng)基，混勻后轉(zhuǎn)移至離心管中；以105 mm為離心半徑，以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min；吸除離心管內(nèi)的上清；用1 mL 4 ℃預冷的PBS溶液輕輕地重懸細胞，并計數(shù)；按以上條件再次離心并吸除上清，重懸細胞，離心，吸除管內(nèi)上清。用 250 μL 稀釋過的結合緩沖液重新懸浮細胞，調(diào)節(jié)其濃度為 1×106/mL；取5 mL流式細胞管，將細胞懸液100 μL和Annexin V-FITC溶液5 μL加入其中，混合均勻；置室溫(20～25 ℃)避光孵育 10 min；向流式管中加入10 μL PI溶液，并輕輕混勻；重懸細胞,在避光環(huán)境中保存，用流式細胞儀立即檢測細胞凋亡率。顯示為綠色熒光的是Annexin V-FITC，顯示為紅色熒光的是PI。

1.4.3 HepG2肝癌細胞遷移能力

采用Transwell細胞遷移實驗。先將小室活化,向24孔板中加入200 μL的含100 mL/L血清的DMEM培養(yǎng)基；再將Transwell皿放入24孔板中,浸透小室的底部；并將24孔板置于37 ℃環(huán)境中孵育1 h；分別取200 μL 質(zhì)量分數(shù)為0、4、8、10 mg/L的細胞懸液鋪于上室,置于適宜環(huán)境的培養(yǎng)箱中,孵育48 h；取400 μL質(zhì)量分數(shù)為40 g/L的多聚甲醛固定細胞30 min，用PBS溶液清洗3遍；取1個24孔板，滴加400 μL質(zhì)量分數(shù)為1g/L的結晶紫染色液，染色10 min；將上室中的細胞用潔凈的棉簽擦凈，于電子顯微鏡下拍照。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 穿心蓮內(nèi)酯對HepG2肝癌細胞增殖活性的影響

隨著穿心蓮內(nèi)酯質(zhì)量分數(shù)的增加及作用時間的延長，HepG2肝癌細胞活性逐漸下降。與0 mg/L穿心蓮內(nèi)酯對比，各穿心蓮內(nèi)酯組的吸光度降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果表明，穿心蓮內(nèi)酯能抑制HepG2肝癌細胞的增殖活性，且具有時間和濃度依賴性。見表1。

表1 兩組不同質(zhì)量分數(shù)的穿心蓮內(nèi)酯對HepG2肝癌細胞增殖活性的影響

2.2 穿心蓮內(nèi)酯對HepG2肝癌細胞凋亡的影響

在穿心蓮內(nèi)酯質(zhì)量分數(shù)0～25 mg/L范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量分數(shù)增加，HepG2肝癌細胞凋亡率(Q2+Q3)不斷增加。在穿心蓮內(nèi)酯質(zhì)量分數(shù)為 25 mg/L時，凋亡率達到(12.70±1.78)%。見圖1。結果表明，穿心蓮內(nèi)酯可以促進HepG2肝癌細胞的凋亡。

2.3 穿心蓮內(nèi)酯對HepG2肝癌細胞遷移的影響

經(jīng)過穿心蓮內(nèi)酯作用48 h，0 mg/L穿心蓮內(nèi)酯組的HepG2肝癌細胞穿過半透膜進入下室的細胞數(shù)量明顯多于其他各給藥組。與低劑量組對比，高劑量組HepG2肝癌細胞穿過半透膜進入下室的數(shù)量明顯減少。結果表明，隨著穿心蓮內(nèi)酯質(zhì)量分數(shù)的增高，穿心蓮內(nèi)酯抑制HepG2肝癌細胞遷移的能力增強。見圖2。

3 討 論

肝癌分為原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌，較為常見的是原發(fā)性肝癌。因肝臟富含血管等原因，肝癌的惡性化程度極高。手術治療、放射治療、化學藥物治療、肝臟切除或肝臟移植治療是治療肝癌的主要方式。肝癌的早期確診比較困難，晚期時的手術治療僅對符合身體條件的少數(shù)人適用；放射治療易對正常肝細胞造成較大損傷從而影響其正常功能[18]；而化學藥物治療常伴隨耐藥性等相關問題。目前，已明確的水源污染、食物中的毒素、吸煙酗酒，甚至肥胖和糖尿病等均為誘發(fā)肝癌的重要因素[19]。從細胞增殖、細胞凋亡、細胞侵襲遷移或分子水平探討肝癌的發(fā)生機制是當今肝癌研究的熱點、重點和難點。

穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物對腫瘤具有一定治療作用，其機制可能是使淋巴細胞抗癌活性提高，對腫瘤細胞增殖進行抑制，誘導了腫瘤細胞凋亡等，可用于各種腫瘤的治療。李曙光等[20]的研究表明，穿心蓮內(nèi)酯對BGC-823細胞的增殖具有明顯的抑制作用，可以使細胞分裂停滯在G0/G1期，并能促進該細胞的凋亡過程，具有極強的抗癌作用。許洪彬等[21]為了探究穿心蓮內(nèi)酯潛在的作用機制，利用反向分子對接技術和網(wǎng)絡藥理學分析方法，創(chuàng)建穿心蓮內(nèi)酯抗腫瘤作用的靶標-通路網(wǎng)絡，經(jīng)PharmMapper預測和篩選、KEGG富集析等分析得知，穿心蓮內(nèi)酯主要作用于肝細胞癌、前列腺癌、非小細胞癌等癌癥，其通路主要有PIK3R1、SRC、BRAF、EGFR、MMP2、CASP3等靶蛋白，尤其對肝細胞癌專一性高、作用最強。有學者[22]也證明了穿心蓮內(nèi)酯有促進細胞凋亡的作用，可用于治療肝癌。

人HepG2肝癌細胞是研究體外外源性物質(zhì)代謝和肝臟惡性腫瘤的良好模型，因為HepG2肝癌細胞所含的生物轉(zhuǎn)化酶與人正常肝實質(zhì)細胞具有同源性，分化程度較高，并且保留了較完整且活性穩(wěn)定的生物轉(zhuǎn)化代謝酶[23]。

細胞增殖與凋亡過程的紊亂與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有一定關系。凋亡最開始的表現(xiàn)是細胞皺縮，又稱凋亡性細胞容積減少，是細胞凋亡過程中的重要環(huán)節(jié)[19，24]。在生物機體細胞的生長和繁殖過程中，細胞凋亡具有十分重要的作用，體現(xiàn)了組織修復的重要功能。細胞凋亡是細胞自主性程序死亡，是細胞的主要死亡方式之一，其受多基因嚴格調(diào)控。誘導肝癌細胞凋亡在肝癌治療中十分重要[25]。誘導細胞凋亡不會對機體正常細胞造成損害，也不會導致炎癥的發(fā)生，是一種不同于細胞壞死的良性自殺行為[26]。因此，通過細胞凋亡的途徑來判斷藥物對肝癌細胞凋亡的影響是篩選抗肝癌藥物的一個重要方法。此外，肝癌的難以治愈不僅表現(xiàn)在癌細胞的無限制生長，容易躲避免疫細胞的殺傷；也表現(xiàn)在可能轉(zhuǎn)移到身體其他部位定位生長而生成轉(zhuǎn)移瘤；因此，在抑制腫瘤生長、促使癌細胞凋亡的同時，限制癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移顯得格外的重要。

本課題以人HepG2肝癌細胞株為主要研究對象，初步研究了穿心蓮內(nèi)酯對其增殖、凋亡和遷移的影響。研究結果表明，穿心蓮內(nèi)酯能抑制HepG2肝癌細胞的增殖活性，且對藥物質(zhì)量分數(shù)和作用時間有依賴性；對HepG2肝癌細胞的凋亡有促進作用；能抑制HepG2肝癌細胞的遷移。此為穿心蓮內(nèi)酯治療肝癌的機制研究提供了新思路、新方法，同時也為后續(xù)的作用機制研究提供更可靠的依據(jù)。