馬貝貝 王凡 林玲 朱濤 蔣中英?

1)(伊犁師范大學(xué)電子與工程學(xué)院,微納電傳感技術(shù)與仿生器械重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,伊寧 835000)

2)(南京大學(xué)物理學(xué)院,固體微結(jié)構(gòu)物理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210093)

3)(伊犁師范大學(xué)網(wǎng)絡(luò)安全與信息技術(shù)學(xué)院,伊寧 835000)

基于支撐磷脂雙層膜(SLB)的生物傳感器越來(lái)越多地被用于快速測(cè)定抗原、檢測(cè)細(xì)胞色素等.囊泡在襯底的吸附和自發(fā)破裂可形成SLB,最近的研究強(qiáng)調(diào)在此過(guò)程中考察個(gè)體囊泡吸附和破裂的重要性.本研究利用全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRFM)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光標(biāo)記的納米級(jí)個(gè)體囊泡的吸附、破裂,追蹤片層前沿成長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)過(guò)程.結(jié)合帶耗散的石英晶體微天平(QCM-D)的表征和分析,發(fā)現(xiàn)囊泡尺寸對(duì)片層前沿成長(zhǎng)有顯著影響.通過(guò)片層前沿平均成長(zhǎng)速度(vafv )定量分析片層成長(zhǎng),不同尺寸囊泡的 vafv存在 數(shù)量級(jí)差異.理論分析小囊泡具有較高的表面濃度(C)和擴(kuò)散性,加快了片層前沿成長(zhǎng),與實(shí)驗(yàn)值能夠較好地符合.此外,通過(guò)全局成長(zhǎng)理論模型,解釋了對(duì)于相同的片層,前沿加速成長(zhǎng)主要取決于C和囊泡破裂時(shí)的磷脂丟失率.計(jì)算的小囊泡成片層的磷脂丟失率略大于大囊泡,但更大差異的C是片層加速成長(zhǎng)程度不同的關(guān)鍵.囊泡供應(yīng)影響片層前沿成長(zhǎng)的機(jī)理詮釋深化了磷脂在界面再組裝的認(rèn)識(shí).

1 引言

生物膜與細(xì)胞的能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞以及物質(zhì)運(yùn)輸?shù)壬锘顒?dòng)密切相關(guān).為了簡(jiǎn)化生物膜體系,開發(fā)出多種仿生膜模型.其中磷脂支撐膜(SLB)具有與生物膜相近的生物物理性質(zhì)、極高的穩(wěn)定性,可通過(guò)多種表征手段研究其形成過(guò)程,應(yīng)用前景廣闊.文獻(xiàn)[1-5]基于SLB 等仿生膜體系,開展了一系列膜物理機(jī)理與傳感應(yīng)用研究.

SLB 的深入應(yīng)用要求研究者考察囊泡在襯底吸附、形變破裂等相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程,得到可控實(shí)驗(yàn)參數(shù)來(lái)制備高質(zhì)量仿生膜[6].有文獻(xiàn)報(bào)道了使用具有耗散監(jiān)測(cè)的石英晶體微天平(QCM-D)[7]、表面等離振子共振(SPR)[8]等群體表征手段來(lái)考察多種實(shí)驗(yàn)條件對(duì)SLB 形成的影響.如囊泡特性(磷脂組分[7]、囊泡大小[9,10])、環(huán)境條件(溫度[9,11]、離子類型[12,13]、溶液pH值[14]、鹽濃度[15])和襯底特性(原子組成[16]、表面處理方法[17]).研究者們普遍認(rèn)為囊泡可在襯底上形成完整的囊泡吸附層或破裂形成支撐膜.當(dāng)吸附囊泡密度超過(guò)臨界覆蓋密度時(shí)才會(huì)發(fā)生破裂[18,19].囊泡破裂的速度取決于吸附過(guò)程中囊泡的形變[20,21].一般來(lái)說(shuō),隨著囊泡尺寸的增大,其在表面形變?cè)酱?破裂率可能更高[22,23].然而小囊泡的膜曲率較大,這可能會(huì)促進(jìn)破裂[24,25].Reimhult等[9]發(fā)現(xiàn),減小囊泡尺寸可以加快囊泡向SLB 的轉(zhuǎn)變.不一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果增加了研究的不確定性.此外,由于很難捕捉單囊泡吸附和破裂的動(dòng)力學(xué)行為,囊泡在襯底破裂后形成完整支撐膜的中間步驟仍未得到清晰的理解.

為了進(jìn)一步研究囊泡向支撐膜轉(zhuǎn)變中重要的階段,使用熒光顯微鏡、原子力顯微鏡(AFM)[7]、干涉散射顯微鏡技術(shù)(iSCAT)[26]等個(gè)體表征手段考察囊泡在襯底表面的組裝.AFM 研究表明,單個(gè)的囊泡可以破裂形成片層結(jié)構(gòu)[7],該結(jié)構(gòu)的邊界存在磷脂排布缺陷;之后實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)片層邊緣增強(qiáng)了囊泡與表面的黏附性并誘導(dǎo)囊泡破裂,從而催化了SLB 的形成[27];Andrecka等[26]研究表明,只有在多個(gè)囊泡緊密接觸條件下,片層結(jié)構(gòu)才能發(fā)生波狀推進(jìn)形成完整的SLB;Hook 課題組[28]最近報(bào)道了片層前沿加速成長(zhǎng).所有研究均表明,片層結(jié)構(gòu)在形成支撐膜過(guò)程中的重要性,但片層加速成長(zhǎng)本質(zhì)尚不清楚.不同因素譬如磷脂組分、囊泡尺寸等如何調(diào)控片層的前沿成長(zhǎng)仍需探究.

本文在個(gè)體囊泡水平上重點(diǎn)考察了囊泡向支撐膜轉(zhuǎn)變過(guò)程中片層的前沿成長(zhǎng).全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRFM)可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光標(biāo)記的單納米囊泡在襯底的再組裝,捕獲囊泡破裂后形成片層結(jié)構(gòu)的過(guò)程,追蹤片層前沿成長(zhǎng)動(dòng)力學(xué).通過(guò)片層前沿平均成長(zhǎng)速度(vafv)定量描述不同尺寸囊泡破裂產(chǎn)生的片層前沿成長(zhǎng).此外,使用全局成長(zhǎng)模型理解了片層前沿成長(zhǎng)的關(guān)鍵調(diào)控物理參量.研究為SLB的可控制備與應(yīng)用提供了參考[5,29].

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 磷脂囊泡的制備

囊泡通過(guò)擠出法制備[30].將DOPC 中摻雜1%的DiI 熒光染料,氯仿溶劑通過(guò)真空干燥箱除去.在搖床中水化得到多層磷脂囊泡,分別使用100和30 nm 孔徑的聚碳酸酯膜擠出器(Avanti Polar Lipids)制備單層囊泡(補(bǔ)充信息中動(dòng)態(tài)光散射表征后對(duì)應(yīng)尺寸為112和40 nm).

2.2 全內(nèi)反射熒光顯微鏡觀察

基于OlympusIX-81 TIRFM 采集了囊泡在玻璃表面的沉積過(guò)程.將硅膠片黏貼在干凈硼硅酸鹽玻璃上形成艙室,在靜置條件下觀測(cè)囊泡向支撐膜的轉(zhuǎn)變.溫度通過(guò)InstecHCS60 冷熱臺(tái)控制在25 ℃.使用ImageJ 軟件統(tǒng)計(jì)片層數(shù)量、面積和囊泡數(shù)量.誤差棒表示三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果.

2.3 片層前沿成長(zhǎng)速度計(jì)算

片層前沿成長(zhǎng)速度是基于顯微鏡前后圖像中邊界間的最短距離lmin確定的.ImageJ 軟件標(biāo)定片層邊緣所有像素點(diǎn)的坐標(biāo),使用自編的Python 代碼計(jì)算出lmin.拍照時(shí)間間隔為 Δt,利用(1)式計(jì)算片層前沿成長(zhǎng)速度vfv:

定義片層前沿平均成長(zhǎng)速度為單個(gè)片層結(jié)構(gòu)前沿成長(zhǎng)速度的平均值:

3 結(jié)果與討論

使用TIRFM 在硼硅酸鹽玻璃上觀察單囊泡形成SLB 的動(dòng)力學(xué)過(guò)程.采用漸消逝波激發(fā)玻璃-水界面處的熒光樣品,該顯微技術(shù)能夠快速獲取低背景熒光的信息.混摻標(biāo)記和未標(biāo)記的囊泡混合物,提高了單個(gè)磷脂組裝結(jié)構(gòu)(囊泡/片層)的辨識(shí)度.通過(guò)這種方式,能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)并追蹤吸附囊泡的表面密度,觀察初始片層的形成,并研究片層的成長(zhǎng)動(dòng)力學(xué).

所有實(shí)驗(yàn)均在PDMS 艙中靜置的條件下進(jìn)行.圖1 給出了SLB 形成過(guò)程中的熒光圖像,其中吸附囊泡為熒光強(qiáng)度較高的圓點(diǎn);隨著囊泡破裂形成支撐膜,出現(xiàn)熒光強(qiáng)度偏低的片層結(jié)構(gòu)(紅色箭頭標(biāo)記).囊泡向片層結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變,熒光強(qiáng)度降低,源于單位吸附投影面積磷脂層數(shù)的降低、標(biāo)記與未標(biāo)記磷脂結(jié)構(gòu)間的融合.隨著片層結(jié)構(gòu)面積的提高,最終形成完整的支撐膜結(jié)構(gòu).

圖1 支撐雙層膜形成的動(dòng)力學(xué)過(guò)程: 四張典型TIRFM 照片顯示了SLB 形成過(guò)程的不同階段.第一次觀測(cè)到的囊泡破裂用紅色箭頭標(biāo)記表示形成了初始片層.比例尺為20 μmFig.1.Spatiotemporal kinetics of the SLB formation: Four typical TIRFM images illustrating different stages of SLB formation.The first observed vesicle rupture is marked with red arrows to indicate the formation of the initial patch.The scale bar is 20 μm.

采用直徑為40和112 nm 兩種尺寸囊泡,定量考察了片層成長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程.首先,片層數(shù)量小幅提高(圖2(a)),片層所占面積緩慢增長(zhǎng)(圖2(b)),表明囊泡破裂形成片層結(jié)構(gòu),該過(guò)程占據(jù)了整體成膜時(shí)間的約60%—70%;隨后,片層數(shù)量達(dá)到峰值并降低,同時(shí)片層所占面積快速增大.表明囊泡形成大量片層結(jié)構(gòu)后,片層間大量融合并迅速形成了完整的支撐膜.但40 nm 囊泡達(dá)到轉(zhuǎn)變峰值的時(shí)間(14 min)明顯早于112 nm 囊泡(50 min).說(shuō)明尺寸較小的囊泡更易向片層結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變.圖2(c)和圖2(d)給出了不同尺寸囊泡在同時(shí)段的圖像,可以觀察到小尺寸囊泡有更多的低熒光強(qiáng)度片層面積、數(shù)量,并實(shí)現(xiàn)了片層間的連接;與之相對(duì),大尺寸囊泡的數(shù)量、面積增長(zhǎng)緩慢.

圖2 定量?jī)煞N囊泡尺寸下,片層成長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)(統(tǒng)計(jì)區(qū)域?yàn)?812 μm2)(a)片層數(shù)量隨時(shí)間(t)變化;(b)片層歸一化面積隨時(shí)間的變化,插圖為局域放大圖;(c)112 nm 囊泡與 (d)40 nm 囊泡的TIRFM 圖像.比例尺為20 μmFig.2.The kinetics of patch growth was quantitatively investigated using two vesicle samples with different sizes (Area of interest is 5812 μm2): (a)The number of patches changes with time (t);(b)the normalized area of patches changes with time.The inset shows the data on enlarged scales;TIRFM images of (c)112 nm vesicles and (d)40 nm vesicles.The scale bar is 20 μm.

采用前沿成長(zhǎng)速度描述了片層成長(zhǎng).將相鄰時(shí)間圖片中片層邊界之間的最短距離(lmin)與拍照時(shí)間間隔(Δt)之比定義為前沿成長(zhǎng)速度(vfv),vfv≈lmin/Δt,某給定時(shí)刻的平均成長(zhǎng)速度vafv發(fā)現(xiàn)vafv隨時(shí)間變大,說(shuō)明片層的成長(zhǎng)是隨時(shí)間逐漸加速的.這與其他物理、化學(xué)過(guò)程中眾多的前沿成長(zhǎng)存在顯著差異(一般為恒定或逐漸降低),是囊泡向支撐膜轉(zhuǎn)變體系特有的動(dòng)力學(xué)現(xiàn)象,下文將進(jìn)行細(xì)致的定量闡述.圖3 給出在773 s 的記錄時(shí)間內(nèi),112 nm 囊泡的vafv值(＜10 nm/s)與40 nm 囊泡的vafv值(10—102nm/s)存在量級(jí)區(qū)別,這與之前觀測(cè)到的小囊泡更易向片層結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變是一致的.

圖3 片層成長(zhǎng)期間觀察到的代表性圖像以及 vafv 對(duì)時(shí)間的依賴性,顏色指代了其前沿的成長(zhǎng)速度 (a)112 nm 囊泡;(b)40 nm囊泡.比例尺為20 μmFig.3.Representative images observed during the patch growth and the dependence of vafv on t,colors refer to the growth rate of patch boundary: (a)112 nm vesicles;(b)40 nm vesicles.The scale bar is 20 μm.

圖4(a)給出了不同尺寸囊泡形成初始片層、片層數(shù)量峰值以及完全成膜的時(shí)間.發(fā)現(xiàn)囊泡尺寸對(duì)形成初始片層的時(shí)間沒(méi)有明顯影響,但對(duì)后兩個(gè)階段影響較明顯.相對(duì)于40 nm 囊泡,112 nm囊泡實(shí)驗(yàn)中片層達(dá)到加速成長(zhǎng)和完全形成支撐膜的時(shí)間均增長(zhǎng)了約2.8—3.4 倍.說(shuō)明不同尺寸囊泡對(duì)片層成長(zhǎng)的影響強(qiáng)于片層產(chǎn)生的影響.此外,對(duì)吸附囊泡的數(shù)量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)(圖4(b)),發(fā)現(xiàn)囊泡數(shù)先增加后減少,表明囊泡數(shù)量發(fā)生了由吸附主導(dǎo)向破裂成片層主導(dǎo)的轉(zhuǎn)變.對(duì)于該轉(zhuǎn)變,小囊泡所消耗的時(shí)間也顯著短于大囊泡.

圖4 (a)通過(guò)TIRFM 表征不同尺寸囊泡初始片層形成、片層數(shù)量達(dá)到峰值及完全成膜的時(shí)間;(b)囊泡數(shù)量與隨時(shí)間變化(統(tǒng)計(jì)區(qū)域?yàn)?812 μm2);(c)通過(guò)QCM-D 表征不同尺寸囊泡的吸附與成膜Fig.4.(a)The time spent for the initial patch formation,the maximum of patch number,and complete SLB formation using vesicles with different sizes,characterized by TIRFM;(b)The number of vesicles changes with time (The area of interest is 5812 μm2);(c)The vesicle-to-SLB transformation using vesicles with different sizes,characterized by QCM-D.

另采用QCM-D 對(duì)成膜動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了表征(圖4(c)).該技術(shù)基于壓電石英晶體的共振頻率(Δf)和能量耗散(ΔD)的偏移,獲取了二氧化硅表面吸附物質(zhì)的質(zhì)量與黏質(zhì)性變化.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),—Δf和ΔD隨時(shí)間先增加,表明襯底表面吸附了高黏滯性的囊泡.隨后二者減小,表明囊泡逐漸破裂釋放出內(nèi)含水,形成高剛性的片層結(jié)構(gòu).40 nm 囊泡的Δf和ΔD變化轉(zhuǎn)折時(shí)間均短于112 nm 囊泡,證實(shí)了小囊泡更迅速地向片層結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變.最終兩者的Δf和ΔD平衡在—25 Hz,ΔD＜ 1× 10—6,表明都形成了完整的支撐雙層膜.在QCM-D 實(shí)驗(yàn)的二氧化硅襯底和TIRFM 實(shí)驗(yàn)的玻璃襯底上,小囊泡均展現(xiàn)出更強(qiáng)的片層形成效率,表明該結(jié)果是不依賴于襯底種類的.

更為重要的是,玻璃表面吸附的囊泡數(shù)量、QCM-D 表面的囊泡吸附質(zhì)量變化均具有顯著的囊泡尺寸依賴性.如圖4(b),40 nm 囊泡吸附數(shù)量在600 s 即達(dá)到峰值(約1400 個(gè)),而112 nm 囊泡吸附數(shù)量在1000 s 才達(dá)到峰值(約480 個(gè)).該統(tǒng)計(jì)不包含囊泡破裂造成的吸附數(shù)量損失,下文將對(duì)囊泡吸附動(dòng)力學(xué)進(jìn)行深入的定量研究.同時(shí),圖4(c)顯示40 nm 囊泡造成的 Δ 下降快于112 nm 囊泡,說(shuō)明小尺寸的囊泡更利于吸附質(zhì)量(含水)增長(zhǎng).因此,囊泡吸附數(shù)量與質(zhì)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果均表明,磷脂向襯底的輸運(yùn)效率是與囊泡尺寸相關(guān)的.

理論上,囊泡的尺寸越大,它在襯底表面的形變?cè)酱?囊泡形變產(chǎn)生的高膜張力與局域高曲率均造成了膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的下降(易破裂)[22,23,31].但本文和之前報(bào)道的實(shí)驗(yàn)[9]均發(fā)現(xiàn)小囊泡更快地形成了支撐膜.該不一致性可能與襯底的表面囊泡濃度(即囊泡向襯底的供給效率)相關(guān).在實(shí)驗(yàn)?zāi)遗轁舛认?囊泡向底面吸附過(guò)程符合擴(kuò)散受限動(dòng)力學(xué)模型[20].在該模型中,單位支撐面積的擴(kuò)散通量定義為

其中D為擴(kuò)散系數(shù)(c m2/s ),n為溶液中囊泡濃度(m ol/m3).DkBT/(6πηR),其中kB為玻爾茲曼常數(shù),T為溫度,η為黏滯性,R為囊泡半徑.表面濃度和擴(kuò)散通量滿足關(guān)系 dC/dtJ.從而得到囊泡的表面濃度(C,cm—2):

表面濃度隨擴(kuò)散系數(shù)的增大、時(shí)間的延長(zhǎng)和囊泡濃度的增大而增大.由(3)式可得,在任意時(shí)刻,40 與112 nm 囊泡的表面濃度均相差一個(gè)量級(jí).同時(shí),在熒光圖像中選取未破裂的區(qū)域(圖5(a)),對(duì)囊泡的表面濃度進(jìn)行了統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)在初始500 s,40 與112 nm 囊泡的表面濃度之比在7—11 之間.圖5(b)顯示數(shù)值計(jì)算的表面濃度與實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)值基本符合.因此,理論與實(shí)驗(yàn)均說(shuō)明,囊泡尺寸的改變產(chǎn)生了囊泡表面濃度跨量級(jí)的變化.

圖5 擴(kuò)散受限的囊泡吸附動(dòng)力學(xué) (a)40 nm (上)和112 nm (下)的囊泡表面濃度隨時(shí)間變化的TIRFM 圖像;(b)吸附囊泡數(shù)量的實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)與理論計(jì)算值.比例尺為20 μmFig.5.Diffusion-limited kinetics of vesicle adsorption: (a)TIRFM images of surface-attached vesicles,whose concentration changes with time.Vesicle diameter=40 nm (upper)and 112 nm (lower);(b)Experimental statistics and theoretical estimation of the number of adsorbed vesicles.The scale bar is 20 μm.

為了闡明尺寸帶來(lái)的供給差異是否產(chǎn)生了片層前沿成長(zhǎng)的差異,采用全局成長(zhǎng)(GGM)和局域成長(zhǎng)(LGM)兩種模型進(jìn)行分析[28].假定吸附的半球形囊泡-襯底接觸區(qū)域的半徑等于囊泡半徑R,片層以恒定的速度常數(shù)k(由片層前沿的表面能決定)誘導(dǎo)與之接觸的囊泡破裂形成多層磷脂膜堆疊結(jié)構(gòu)[19].GGM 認(rèn)為[28]多層磷脂膜堆疊結(jié)構(gòu)能夠迅速再組裝,其中θ比例的磷脂與半徑為rf(t)的圓形片層相結(jié)合(其余磷脂形成多層磷脂膜或斷裂丟失)[32].即單個(gè)囊泡破裂可導(dǎo)致片層面積增加4πR2 θ.而rf(t)的片層是由位于rf(t-Δt)之內(nèi)的囊泡破裂形成的.形成片層的囊泡數(shù)為(t-Δt)C.因此,(t-Δt)4πR2θC或rf(t)βrf(t-Δt),這里:

由此可得:

這里rf(0)為初始的片層半徑.

而LGM 認(rèn)為[28],囊泡破裂時(shí),釋放的磷脂再組裝能力弱.該囊泡破裂形成多層磷脂膜堆疊結(jié)構(gòu)與早期片層的重疊部分不對(duì)片層面積的成長(zhǎng)產(chǎn)生貢獻(xiàn).rf單位時(shí)間的增量與R相關(guān):rf(t+Δt)rf(t)+αR.當(dāng)t ?Δt時(shí)滿足rf(t)αkRt,其中α是無(wú)量綱因數(shù)(與囊泡表面濃度和形變相關(guān))[28].

由于多層磷脂膜堆疊結(jié)構(gòu)的再組裝依賴于磷脂膜與襯底間的吸引作用[33].因此LGM 適用于弱的吸引作用條件(如囊泡與襯底存在靜電排斥),而GGM 適用于強(qiáng)的吸引作用條件.選取兩個(gè)近圓的片層(圖6(a))考察了本文實(shí)驗(yàn)中片層前沿成長(zhǎng)動(dòng)力學(xué).圖6(b)給出了兩個(gè)模型下實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合結(jié)果,相較于LGM,本文實(shí)驗(yàn)中的片層前沿成長(zhǎng)更符合GGM.40 與112 nm 囊泡擬合獲得的β值分別約為1.14和1.08.由(3)式可得,40 與112 nm 囊泡的C值之比為10.5.計(jì)算可得兩者的θ值之比為0.92.即C的差異遠(yuǎn)大于θ.而β的差異取決于C與θ的乘積((4)式),因此對(duì)于同樣的片層,囊泡尺寸造成的片層成長(zhǎng)速率(由β反映)的不同主要由C主導(dǎo).同時(shí)GGM 模型中,各時(shí)刻片層前沿的成長(zhǎng)速度主要由rf與C決定((5)式).而根據(jù)(6)式與(3)式,rf與C隨時(shí)間增長(zhǎng),即片層總能夠在下一時(shí)刻誘導(dǎo)更大面積、更高表面濃度的囊泡破裂,因此片層結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出加速成長(zhǎng)(圖3).擬合還給出大小囊泡的θ值,反映片層成長(zhǎng)時(shí)磷脂丟失是存在區(qū)別的.小囊泡的磷脂丟失率略大于大囊泡,原因可能是囊泡表面濃度越高,片層成長(zhǎng)造成的磷脂丟失比例越高.我們將在后續(xù)的研究中繼續(xù)探索囊泡尺寸影響成膜過(guò)程中磷脂丟失率的物理機(jī)理.

圖6 片層的半徑隨kt 的變化 (a)選用的40和112 nm囊泡形成的片層;(b)兩種尺寸囊泡的片層成長(zhǎng)的全局(實(shí)線)和局域(虛線)模型擬合.比例尺為20 μmFig.6.Radius of the patch changes as a function of kt:(a)Patches formed by 40 and 112 nm vesicles;(b)fit of the experimental data to the GGM and LGM using the vesicles with two sizes.The scale bar is 20 μm.

4 結(jié)論

本文通過(guò)TIRFM和QCM-D 結(jié)合的表征手段,研究了不同尺寸囊泡條件下片層前沿的成長(zhǎng)動(dòng)力學(xué).與之前其他實(shí)驗(yàn)中研究囊泡破裂的方法相比,混摻標(biāo)記和未標(biāo)記的囊泡混合物,提高了單個(gè)磷脂組裝結(jié)構(gòu)的辨識(shí)度.TIRFM 能夠快速獲取低背景熒光的信息,捕捉囊泡破裂后形成的片層結(jié)構(gòu)及其成長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué).我們觀察到囊泡尺寸不同,成膜所經(jīng)歷階段大致相似,但片層的數(shù)量、面積、前沿成長(zhǎng)速度具有顯著差異.發(fā)現(xiàn)片層成長(zhǎng)符合全局模型,囊泡表面濃度是產(chǎn)生片層成長(zhǎng)差異的主要因素.囊泡吸附符合擴(kuò)散受限模型,因此小囊泡產(chǎn)生的片層成長(zhǎng)顯著快于大囊泡.本研究深化了片層成長(zhǎng)機(jī)制的認(rèn)識(shí),為支撐磷脂膜在仿細(xì)胞載藥和生物芯片體系中的優(yōu)化設(shè)計(jì)與可控制備提供參考.