李英娜 董蘭 劉婉珊 全林菲 何鳳

廣州市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科（廣州 510180）

糖尿病（diabetic mellitus，DM）是一種累及全身多個器官、具有高致殘率和致死率，嚴(yán)重危害公眾健康的慢性代謝性疾病。我國已是糖尿病第一大國，而糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病主要的慢性微血管并發(fā)癥之一，是目前全球終末期腎臟?。‥SRD）的主要原因之一，目前已成為我國需迫切解決的慢性疾病問題之一［1-3］。然而，目前的臨床治療措施有限，不能有效阻止糖尿病腎病向ESRD 進(jìn)展。ESRD 患者大多需終身替代治療，高昂的費用與無明顯改善的預(yù)后，使之成為我國醫(yī)療系統(tǒng)、患者及其家屬的巨大負(fù)擔(dān)。糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，目前較多研究表明其病程的發(fā)生發(fā)展主要與血流動力學(xué)異常和糖脂代謝紊亂等過程有關(guān)，但其具體機(jī)制仍待進(jìn)一步闡明［4］。越來越多的流行病學(xué)和臨床前研究表明［5］，炎癥反應(yīng)在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制上占有重要的地位，其可能是發(fā)病初期最先參與的過程，然而其具體的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。因此，以炎癥為靶標(biāo)去探尋糖尿病腎病診斷和治療的新視野是目前研究的一大熱點，同時對糖尿病腎病早期潛在的致病分子和治療靶點亦是亟待挖掘。

基因表達(dá)綜合庫（gene expression omnibus，GEO）創(chuàng)建于2000年，是由美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）創(chuàng)建并維護(hù)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫，是目前最大的公共基因資源庫，其中海納了高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)，具有全面的生物學(xué)資料且獲取方式簡單易操作。測序技術(shù)為生物科學(xué)研究帶來了新思路，隨著生物信息學(xué)的提出及發(fā)展，生物信息學(xué)工具收集、儲存、整合、分析這些海量的數(shù)據(jù)，為探尋更加深刻的分子機(jī)制提供可能性，更有利于深入探索疾病進(jìn)展中的分子變化和相關(guān)信號通路的功能聯(lián)系。本研究擬利用生物信息學(xué)方法，分析并挖掘早期糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展的重要信號通路及分子，為進(jìn)一步闡明糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制以及靶向分子治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源收集2019年1月至2021年1月收治于廣州市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科首次入院并經(jīng)腎臟組織病理活檢確診的DN 患者6 例（eDN 組），診斷符合糖尿病腎臟疾病臨床診療中國指南（2021版）［6］。對照組（NC 組，6 例）樣本為腫瘤切除術(shù)后癌旁正常組織。本項研究經(jīng)廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，獲得所有參與者/患者的知情同意書。手術(shù)獲取標(biāo)本組織后立即放置于凍存管中，隨后轉(zhuǎn)入液氮，最后放于-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑包括常溫/4 ℃離心機(jī)（Thermo，Eppendorf）；Nanodrop 2000 分光光度計（Thermo Scientific）；普通PCR（ABI）；實時熒光定量PCR 儀（Roche）；Trizol 提取液（Sigma）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（HiScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit，Vazyme）；SYBR?Premix Ex TaqTM（SYBR Green，Vazyme）；焦碳酸二乙酯（DEPC，Sigma）；免疫組化試劑盒（Bioss IHC001）；石蠟切片機(jī)（Leica HistoCore MULTICUT）；載玻片；蓋玻片；中性樹脂；明場正置顯微鏡（Lecia DM2500）。

1.3 數(shù)據(jù)集獲取及差異基因的篩選在NCBI 的基因表達(dá)綜合（GEO）數(shù)據(jù)庫中下載RNA 測序譜GSE142025 數(shù)據(jù)集，應(yīng)用R 語言對其進(jìn)行基因表達(dá)分析。該數(shù)據(jù)集中包含NC組（6例）與eDN組（6例）的基因表達(dá)數(shù)據(jù)?；赗 軟件中“l(fā)imma”包可視化NC 組與eDN 組之間的差異表達(dá)基因（DEGs），以P＜0.05 和|log2FC|＞1 為DEGs 的篩選標(biāo)準(zhǔn)。使用R 版本4.0.3 對GEO 數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析。

1.4 生物信息學(xué)分析使用R 語言中“pheatmap”“ggplot2”“tidyverse”等軟件包，通過heatmap 和volcano 將DEGs 中顯著的差異基因展示出來。

采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）方法，利用R 軟件分析差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)，獲取eDN 組差異表達(dá)基因富集的生物學(xué)功能與相關(guān)信號通路，設(shè)定篩選標(biāo)準(zhǔn)為：歸一化富集得分（normalized enrichment score，NES）絕對值＞1、P＜0.05、錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.25。

利用在線工具STRING（https：//cn.string-db.org/），將差異表達(dá)基因?qū)胂到y(tǒng)，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。采用Cytoscape3.8.0 軟件（http：//www.cytoscape.org）中的cyto Hubba 插件篩選PPI 網(wǎng)絡(luò)中的Hub 基因。

1.5 基因表達(dá)水平檢測

1.5.1 免疫組織化學(xué)染色（IHC）手術(shù)或穿刺所取組織于10%福爾馬林固定，進(jìn)行常規(guī)組織脫水、石蠟包埋，4 μm 連續(xù)切片，切片放置37 ℃恒溫箱過夜。選擇合適的切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，烤片1 h 后依次進(jìn)行脫蠟、水化，使用3%H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶，用枸櫞酸鈉緩沖液在微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)，5%BSA 常溫封閉1 h，棄去封閉液加入稀釋好的一抗，切片置于濕盒中放-20 ℃冰箱過夜。次日孵育二抗，后加入二氦基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，顯微鏡下觀察效果，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，脫水透明后中性樹脂封片，通風(fēng)處晾干于明場顯微鏡下觀察拍攝。

1.5.2 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）根據(jù)制造商的方案，使用Trizol 提取液（Sigma）分離提取組織標(biāo)本總RNA，隨后在Nanodrop 2000 分光光度計上規(guī)范操作，檢測所提RNA 的濃度及判定其純度，并做好記錄。按試劑盒說明書操作，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成為cDNA，再使用SYBR Green RT-qPCR 檢測試劑盒檢測目的基因相對表達(dá)水平，總反應(yīng)體系為20 μL，每個樣品做三個復(fù)孔，以GAPDH 為內(nèi)源性對照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法使用Microsoft Excel 軟件建立資料數(shù)據(jù)表格，應(yīng)用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，對所有計量資料呈正態(tài)或近似正態(tài)分布的以（±s）表示，正態(tài)分布且方差齊者采用獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，采用兩獨立樣本的非參數(shù)秩和檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因的分析在GEO 數(shù)據(jù)庫中檢索并下載，獲取RNA 測序譜GSE142025 數(shù)據(jù)集，流程見圖1A。通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行FPKM 標(biāo)準(zhǔn)化，利用R軟件分析，發(fā)現(xiàn)相比較于NC組，eDN組有1 859個差異表達(dá)基因（DEGs），其中有1 063 個表達(dá)上調(diào)，有796個表達(dá)下調(diào)。其中，以P＜0.05和|log2FC|＞1為DEGs 的篩選標(biāo)準(zhǔn)。在火山圖中顯示了NC 組與eDN 組間總的差異表達(dá)基因，見圖1B。同時，用熱圖顯示了eDN 組中顯著表達(dá)上調(diào)和下調(diào)各25 個，見圖1C。

圖1 NC 組與eDN 組間的差異表達(dá)基因Fig.1 Differentially expressed genes between NCgroupand eDNgroup

2.2 KEGG 富集通路分析對篩選出1 859 個差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集，以了解其可能參與的生物過程。使用GSEA 的方式將差異基因富集到KEGG 通路中，利用R 軟件來分析NC 組與eDN 組之間的通路富集，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：NES 絕對值＞1、P＜0.05、FDR＜0.25，結(jié)果見表1。其中，“JAK-STAT通路”、“細(xì)胞因子受體通路”、“趨化因子信號通路”、“細(xì)胞黏附分子通路”、“細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路”等顯著上調(diào)，見圖2。結(jié)果顯示，顯著上調(diào)的KEGG 富集通路多與炎癥、細(xì)胞因子、趨化因子相關(guān)，提示CCR2 等顯著上調(diào)基因可能通過炎癥相關(guān)通路參與早期糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

圖2 eDN 組中上調(diào)的KEGG 富集通路Fig.2 Up-regulated KEGG-enriched pathways in the eDN group

表1 KEGG 富集通路結(jié)果Tab.1 KEGG enrichment pathway results

2.3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建使用在線工具STRING 和Cytoscape 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），PPI中紅色為上調(diào)基因，藍(lán)色為下調(diào)基因，可見CCR2、CCR4 和CXCR3 作為HUB 基因表達(dá)顯著上調(diào)，見圖3A，提示CCR2 等HUB 基因可能通過炎癥、趨化因子信號通路發(fā)揮其作用，繼而影響早期糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

2.4 HUB基因水平的驗證通過IHC檢測HUB基因在早期糖尿病腎病患者組織中的表達(dá)，與上述生物信息學(xué)分析結(jié)果一致，相比于NC 組，CCR2、CCR4 和CXCR3 在早期糖尿病腎病患者中均顯著表達(dá)，見圖3B。同時采用RT-qPCR 對腎組織樣本進(jìn)行檢測，CCR2、CCR4 和CXCR3 的相對基因表達(dá)在eDN 組較NC 組高表達(dá)，而且CCR2 mRNA 較對照組顯著上調(diào)達(dá)2.51 倍（P＜0.05），見表2與圖3C，與IHC 結(jié)果一致。

圖3 eDN 腎組織中上調(diào)HUB 基因的鑒定及檢測Fig.3 Identification and detection of up-regulated HUB genes in eDN kidney tissue

表2 NC 組與eDN 組中CCR2、CCR4、CXCR3 mRNA 水平的比較Tab.2 Comparison of CCR2，CCR4，CXCR3 mRNA levels in NC group and eDN group

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病常見的累及腎臟的慢性微血管并發(fā)癥，大約有30%～40%的糖尿病患者會最終發(fā)展為糖尿病腎病，其患病率的增加與世界范圍內(nèi)糖尿病患病率的急劇上升平行，且國家收入及發(fā)展程度與患病率也有平行的趨勢［7-8］。糖尿病腎病是糖尿病患者生活質(zhì)量和生存時間的獨立危險因素，是我國新發(fā)慢性腎衰竭的重要病因，是腎臟透析的主要原因之一［9］。已有明確的研究表明糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制是多因素且較為復(fù)雜，主要涉及代謝紊亂、糖基化終產(chǎn)物的堆積、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和巨自噬/自噬等因素［10-12］。由于其代謝紊亂極為復(fù)雜，一旦發(fā)展到ESRD，往往比其他腎臟疾病的治療更加困難，大多需終身替代治療或者進(jìn)行腎移植。因此探索糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制相關(guān)信號通路和分子對早期防治、延緩糖尿病腎病具有重大意義。

本研究通過生物信息學(xué)的方法，篩選和分析eDN 組和NC 組患者之間差異表達(dá)基因。eDN 組有1 859個差異表達(dá)基因，其中有1 063個表達(dá)上調(diào)，有796個表達(dá)下調(diào)。KEGG通路富集顯示，“JAK-STAT通路”、“細(xì)胞因子受體通路”、“趨化因子信號通路”、“細(xì)胞黏附分子通路”、“細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路”等炎癥相關(guān)通路異常激活，與既往研究一致，炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子及趨化因子異常表達(dá)在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)很重要的地位［13］。本研究表明免疫介導(dǎo)的炎癥是腎臟損傷的主要潛在機(jī)制相符合［14］。

Janus 激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子即JAKSTAT 信號通路是體內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，主要由酪氨酸激酶JAK、酪氨酸激酶相關(guān)受體以及轉(zhuǎn)錄因子STATs 所構(gòu)成，在機(jī)體中可以發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)錄活化子蛋白的雙重作用，是多種細(xì)胞因子受體和生長因子主要信號傳導(dǎo)的核心［15］。JAK-STAT 信號通路在機(jī)體內(nèi)參與多種生理學(xué)過程，其中免疫炎癥反應(yīng)是其主要的作用靶點之一，參與從免疫感染到免疫耐受等免疫過程，該通路異常激活近些年在糖尿病和代謝性疾病方面?zhèn)涫荜P(guān)注［15］。大量研究表明高血糖、糖基化終末產(chǎn)物、炎性物質(zhì)、多種細(xì)胞因子等觸發(fā)分子可激活JAK-STAT 信號通路，從引起一系列炎癥反應(yīng)，進(jìn)而參與增殖及纖維化而影響糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展［16-18］。WANG 等［16］研究發(fā)現(xiàn)白芍總苷可產(chǎn)生保護(hù)腎臟作用，通過抑制JAK2/STAT3 通路和巨噬細(xì)胞增殖能力，從而顯著抑制糖尿病腎病進(jìn)展。慢性糖尿病狀態(tài)下，糖基化終末產(chǎn)物累積，可上調(diào)JAK2/STAT3 信號通路，促進(jìn)炎癥和凋亡，誘導(dǎo)糖尿病腎病的發(fā)生［19］。有研究報道［20］，高血糖可調(diào)節(jié)腎小球系膜細(xì)胞中的JAK2 和STAT1、STAT3 和STAT5 活性，并證實高血糖以JAK2-STAT1 依賴性方式刺激腎小球系膜細(xì)胞中TGF-β 和纖連蛋白的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展。另有研究報道［21］，糖基化終末產(chǎn)物可通過受體與其配體相作用激活JAK2/STAT3 通路，誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞凋亡，從而加重糖尿病腎病的腎損傷。綜上，大量研究闡明JAK-STAT 通路在糖尿病腎病的炎癥進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。

趨化因子是一類控制細(xì)胞定向聚集和遷移的細(xì)胞因子，其功能由趨化因子受體介導(dǎo)，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。其中有兩個主要的趨化因子亞家族：CXC 和CC，一般CXC 趨化因子的成員對中性粒細(xì)胞具有趨化性，CC 趨化因子對單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞亞群具有趨化性［22］。CC 基序趨化因子受體2（CCR2）與MCP-1 結(jié)合可有效刺激骨髓中單核細(xì)胞的釋放，并激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的遷移和易位，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用［23］。據(jù)報道［24］，在人類和實驗?zāi)Ｐ椭?，MCP-1/CCR2 會導(dǎo)致多種腎臟疾病，包括腎移植慢性排斥反應(yīng)、狼瘡性腎炎、lgA 腎病和糖尿病腎病。在UUO 模型和腎血管性高血壓模型中，研究者們使用CCR2 抑制劑或CCR2 敲除阻斷MCP-1/CCR2 信號傳導(dǎo)已被證明可減輕腎纖維化［25］。KITAGAWA 等［26］發(fā)現(xiàn)腎纖維化小鼠模型與相關(guān)臨床發(fā)現(xiàn)一致，證實腎臟CCR2 表達(dá)與腎纖維化和巨噬細(xì)胞聚集高度相關(guān)。MIAO等［27］研究發(fā)現(xiàn)CCR2 拮抗作用于局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）小鼠模型中可使蛋白尿和腎小球損傷顯著減少，改善腎功能。另有研究發(fā)現(xiàn)［28］，CCR2拮抗劑CCX140-B 在2 型糖尿病和大量白蛋白尿患者中的具有顯著降低白蛋白尿的作用，發(fā)揮抑制炎癥的作用。DU 等［29］研究證實Loganin 可通過糖尿病腎病中MCP-1/CCR2 信號通路抑制巨噬細(xì)胞浸潤和活化來改善糖尿病腎病的腎損傷。本次研究發(fā)現(xiàn)CCR2 作為HUB 基因在早期糖尿病腎病患者的組織中顯著上調(diào)，KEGG 功能富集集中聚焦于炎癥、細(xì)胞因子和趨化因子相關(guān)通路，提示CCR2 可能作為早期糖尿病腎病發(fā)病的潛在靶點，通過JAK-STAT 通路在炎癥過程中發(fā)揮作用，但其具體作用機(jī)制尚不明確，仍需要進(jìn)一步深入探究。本研究通過在GEO 數(shù)據(jù)庫中檢索并獲取RNA 測序譜，利用生物信息學(xué)方法，篩選和分析eDN 組和對照組之間的差異表達(dá)基因并進(jìn)行KEGG 功能富集，發(fā)現(xiàn)CCR2 作為HUB 基因在早期糖尿病腎病的組織中顯著上調(diào)，提示其可能通過JAK-STAT 通路參與eDN 的炎癥過程，但具體的作用機(jī)制尚不清楚，由于臨床患者的樣本量相對有限，后續(xù)仍需大量動物和臨床試驗進(jìn)行更加深入與精確的驗證，其為進(jìn)一步闡明eDN 發(fā)病機(jī)制提供新的潛在分子靶點，為糖尿病腎病的治療提供新的策略和思路。