辛思源 楊志新 柳金英 劉慧 郭建恩

承德醫(yī)學(xué)院（河北承德 067000）

橋本甲狀腺炎又被稱為慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎，甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞凋亡在橋本甲狀腺炎的發(fā)病機(jī)制中起重要作用［1-2］。玉郎傘多糖（Yulangsan polysaccharide，YLSPS）是玉郎傘提取物的主要活性成分之一，主要由葡萄糖和阿拉伯糖組成。研究顯示，YLSPS 可保護(hù)布洛芬引起的小鼠肝損傷，其可能通過(guò)抗氧自由基損傷、抗脂質(zhì)過(guò)氧化損傷以及減少炎癥因子的釋放發(fā)揮作用［3］；YLSPS 可抑制Aβ25-35誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞PC12 凋亡［4］。Caveolin-1（Cav-1）位于甲狀腺細(xì)胞的頂端，是甲狀腺毒素多蛋白復(fù)合物的一部分，在甲狀腺激素的合成和調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用，可避免細(xì)胞損傷和凋亡［5］。研究顯示，Caveolin-1 在橋本甲狀腺炎組織中表達(dá)降低，其可能通過(guò)抑制甲狀腺濾泡細(xì)胞的自噬活性參與橋本甲狀腺炎的發(fā)病過(guò)程［6］；Caveolin-1 表達(dá)的降低通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平和細(xì)胞凋亡介導(dǎo)甲狀腺上皮細(xì)胞損傷［7］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，可誘發(fā)多種炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，LPS 可破壞T、B 淋巴細(xì)胞對(duì)鼠甲狀腺免疫蛋白的耐受，促進(jìn)橋本甲狀腺炎的發(fā)生［8］。本研究以人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞Nthy-ori3-1 為研究對(duì)象，并以Caveolin-1 為切入點(diǎn)，探究YLSPS 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的Nthy-ori3-1 細(xì)胞炎癥損傷和凋亡的影響和其分子機(jī)制，以期為橋本甲狀腺炎治療藥物的研發(fā)提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞Nthyori3-1 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，玉郎傘飲片購(gòu)自購(gòu)于南寧醫(yī)藥公司，細(xì)胞凋亡試劑盒試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）和單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 試劑盒購(gòu)自深圳晶美生物工程有限公司，Trizol 試劑和LipofectamineTM2000試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，Caveolin-1 過(guò)表達(dá)載體（pcDNA-Caveolin-1）、空載體（pcDNA）、Caveolin-1 小干擾RNA（si-Caveolin-1）、亂序無(wú)意義陰性序列（si-NC）及PCR 引物均購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司，兔抗人Caveolin1、B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 相關(guān)蛋白（Bax）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司。

1.2 方法

1.2.1 YLSPS的制備參照文獻(xiàn)方法提取YLSPS［9］。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染復(fù)蘇Nthy-ori3-1 細(xì)胞，用含10 % FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)5%，濕度97%。每2～3 d 更換1 次新鮮培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度至80%～90%時(shí)，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗細(xì)胞，0.25 %胰蛋白酶消化，按照1∶3 比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Nthy-ori3-1 細(xì)胞調(diào)整濃度為2.5 × 104個(gè)/mL，每孔2.5 mL 以每孔1 × 105個(gè)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度至60%時(shí)，參照LipofectamineTM2000 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h 后，換為含10%FBS 的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞分組處理細(xì)胞調(diào)整濃度為2.5 × 104個(gè)/mL，每孔1.0 mL 接種于24 孔板中。未轉(zhuǎn)染的Nthy-ori3-1 細(xì)胞分為對(duì)照組（Con 組）、LPS 組、LPS+YLSPS-L 組、LPS+YLSPS-M 組和LPS+YLSPS-H 組。Con 組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)；LPS 組細(xì)胞用含10 ng/mL LPS 的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；LPS+YLSPS-L 組、LPS+YLSPS-M 組和LPS+YLSPS-H 組細(xì)胞分別用含0.01、0.1、1.0 μg/mL YLSPS 與10 ng/mL LPS 的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-Caveolin-1 的細(xì)胞用含10 ng/mL LPS 的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，記為L(zhǎng)PS+pcDNA 組和LPS+pcDNA-Caveolin-1 組。轉(zhuǎn)染si-NC、si-Caveolin-1 的細(xì)胞用含1.0 μg/mL YLSPS 與10 ng/mL LPS 的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)24 h，記為L(zhǎng)PS+YLSPS+si-NC 組 和LPS+YLSPS+si-Caveolin-1 組。每組均設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 MTT 法檢測(cè)YLSPS 對(duì)Nthy-ori3-1 細(xì)胞活性的影響收集Con 組、YLSPS-L 組、YLSPS-M 組、YLSPS-H 組Nthy-ori3-1 細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液接種于96 孔板（150 μL/孔），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，各組轉(zhuǎn)染48 h時(shí)，每孔加入質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的MTT 溶液20 μL，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，室溫條件下經(jīng)1 300 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，避光振蕩孵育5 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞中IL-1β、IL-6 和MCP-1 表達(dá)加入細(xì)胞裂解液，充分裂解各組培養(yǎng)后的細(xì)胞，3 500 r/min 離心10 min，收集上清液-20 ℃保存?zhèn)溆?。分別參照IL-1β、IL-6和MCP-1試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)上清中其表達(dá)水平。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡各組培養(yǎng)后的細(xì)胞使用PBS 清洗2 次，1 000 r/min 離心5 min，吸棄PBS。加入500 μL 結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞。加入10 μL Annexin V-FITC，混合均勻后，室溫避光孵育10 min。再加入5 μL PI，混合均勻，室溫避光孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.7 RT-qPCR 檢測(cè)Caveolin-1 mRNA 表達(dá) Trizol 試劑提取細(xì)胞中總RNA，微量核酸儀檢測(cè)其濃度和純度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以cDNA 為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95 ℃5 min，95 ℃15 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，共35 個(gè)循環(huán)，2-△△Ct法計(jì)算細(xì)胞中Caveolin-1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.8 Western Blot 法檢測(cè)細(xì)胞中Bcl-2、Bax 和Caveolin-1 蛋白表達(dá)RIPA 試劑提取細(xì)胞中總蛋白，經(jīng)BCA 法測(cè)定蛋白濃度后，行10 %十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。電泳后，將分離蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏乙烯二氟（PVDF）膜，于使用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉，時(shí)間為1 h。分別加入Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Caveolin-1（1∶800）和GAPDH（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過(guò)夜后，加入山羊抗兔二抗（1∶5 000），37 ℃孵育1 h。加入化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影后，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。以GAPDH 為內(nèi)參，Image J 軟件分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.9 甲狀腺炎模型小鼠誘導(dǎo)及給藥分組隨機(jī)選擇50 只小鼠，隨機(jī)分為5 組，空白對(duì)照組、模型組、低劑量YLSPS 處理組、中劑量YLSPS 處理組、高劑量YLSPS處理組。采用灌胃法，每天灌胃1次，共實(shí)驗(yàn)4 周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組小鼠摘眼球取血0.2 mL，3 000 r/min 離心10 min，取上清液，檢測(cè)IL-1β、IL-6 和MCP-1 水平。然后各組小鼠采用麻醉法處死取胰腺組織，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.10 組織形態(tài)學(xué)觀察與切片制作摘下各組小鼠的甲狀腺組織，將其置于分析天平中稱量，計(jì)算各組小鼠甲狀腺指數(shù)，然后置于顯微鏡下，觀察各組小鼠甲狀腺的體積和形態(tài)。同時(shí)，取下部分小鼠甲狀腺組織，將其用于制作切片，進(jìn)行HE染色。

1.2.11 小鼠胰腺組織中Caveolin-1 蛋白表達(dá)檢測(cè)各組小鼠甲狀腺組織中Caveolin-1 蛋白表達(dá)的檢測(cè)方法同1.2.7。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法GraphPad Prism 7.0 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YLSPS對(duì)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞活性的影響與Con組比較（100.00±0），YLSPS-L組、YLSPS-M組、YLSPS-H 細(xì)胞活性［（99.43±9.57）、（98.36±9.74）、（97.98±8.46）］無(wú)明顯變化（F=0.122，P=0.947）。

2.2 YLSPS 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞炎癥損傷的影響與Con 組比較，LPS 組IL-1β、IL-6和MCP-1 水平均顯著升高（P＜0.05）。與LPS 組比較，LPS+YLSPS-L 組、LPS+YLSPS-M 組和LPS+YLSPS-H 組IL-1β、IL-6 和MCP-1 水平均顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 YLSPS 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的Nthy-ori3-1 細(xì)胞炎癥損傷的影響Tab.1 The effect of YLSPS on LPS-induced inflammatory injury of Nthy-ori3-1 cells ±s

表1 YLSPS 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的Nthy-ori3-1 細(xì)胞炎癥損傷的影響Tab.1 The effect of YLSPS on LPS-induced inflammatory injury of Nthy-ori3-1 cells ±s

注：與Con 組比較，*P＜0.05；與LPS 組比較，#P＜0.05；與LPS+YLSPS-L 組比較，&P＜0.05；與LPS+YLSPS-M 組比較，$P＜0.05

分組Con組LPS組LPS+YLSPS-L組LPS+YLSPS-M組LPS+YLSPS-H組F值P值IL-1β（pg/mL）58.69±5.79 435.34±30.27*314.54±29.25#205.38±19.02#&82.07±8.62#&$504.750＜0.001 IL-6（pg/mL）88.89±7.18 273.28±24.50*221.05±16.20#164.75±12.40#&108.10±1.13#&$249.387＜0.001 MCP-1（pg/mL）47.27±4.25 340.83±26.24*263.52±23.03#139.95±13.54#&71.24±7.05#&$687.290＜0.001

2.3 YLSPS 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞凋亡的影響與Con 組比較，LPS 組細(xì)胞凋亡率和Bax 蛋白水平均顯著升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平顯著降低（P＜0.05）。與LPS 組比較，LPS+YLSPS-L 組、LPS+YLSPS-M 組和LPS+YLSPS-H 組細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白水平均顯著降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 YLSPS 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的Nthy-ori3-1 細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 The effect of YLSPS on LPS-induced apoptosis of Nthy-ori3-1 cells

表2 YLSPS 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的Nthy-ori3-1 細(xì)胞凋亡的影響Tab.2 Effects of YLSPS on LPS-induced apoptosis of Nthy-ori3-1 cells ±s

表2 YLSPS 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的Nthy-ori3-1 細(xì)胞凋亡的影響Tab.2 Effects of YLSPS on LPS-induced apoptosis of Nthy-ori3-1 cells ±s

注：與Con 組比較，*P＜0.05；與LPS 組比較，#P＜0.05；與LPS+YLSPS-L 組比較，&P＜0.05；與LPS+YLSPS-M 組比較，$P＜0.05

分組Con組LPS組LPS+YLSPS-L組LPS+YLSPS-M組LPS+YLSPS-H組F值P值凋亡率（%）7.62±0.71 29.38±2.40*21.26±2.03#15.58±1.27#&10.98±1.05#&$255.605＜0.001 Bcl-2蛋白0.59±0.05 0.14±0.02*0.25±0.03#0.37±0.03#&0.49±0.04#&$232.286＜0.001 Bax蛋白0.28±0.03 0.76±0.05*0.63±0.04#0.51±0.04#&0.37±0.03#&$224.100＜0.001

2.4 YLSPS 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞中Caveolin-1 表達(dá)的影響與Con 組比較，LPS 組Caveolin-1的mRNA蛋白水平均顯著降低（P＜0.05）。與LPS 組比較，LPS+YLSPS-L 組、LPS+YLSPS-M 組和LPS+YLSPS-H 組Caveolin-1 的mRNA 蛋白水 平顯著升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、表3。

表3 YLSPS 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的Nthy-ori3-1 細(xì)胞中Caveolin-1表達(dá)的影響Tab.3 The effect of YLSPS on the expression of Caveolin-1 in LPS-induced Nthy-ori3-1 cells ±s

表3 YLSPS 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的Nthy-ori3-1 細(xì)胞中Caveolin-1表達(dá)的影響Tab.3 The effect of YLSPS on the expression of Caveolin-1 in LPS-induced Nthy-ori3-1 cells ±s

注：與Con 組比較，*P＜0.05；與LPS 組比較，#P＜0.05；與LPS+YLSPS-L 組比較，&P＜0.05；與LPS+YLSPS-M 組比較，$P＜0.05

分組Con組LPS組LPS+YLSPS-L組LPS+YLSPS-M組LPS+YLSPS-H組F值P值Caveolin-1 mRNA 1.00±0.07 0.39±0.03*0.56±0.04#0.71±0.07#&0.88±0.06#&$168.311＜0.001 Caveolin-1蛋白0.69±0.06 0.23±0.02*0.35±0.03#0.46±0.04#&0.58±0.04#&$183.722＜0.001

圖2 Caveolin-1 蛋白表達(dá)Fig.2 Caveolin-1 protein expression

2.5 Caveolin-1 過(guò)表達(dá)對(duì)LPS 誘導(dǎo)的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞炎癥損傷的影響與LPS+pcDNA組比較，LPS+pcDNA-Caveolin-1 組Caveolin-1 蛋白水 平 顯著升高［（0.22 ± 0.02）vs.（0.61 ± 0.06），P＜0.05］，IL-1β、IL-6 和MCP-1 水平均顯著降低［（436.69 ±32.48）、（265.29±22.61）、（347.47±31.79）vs.（94.27± 7.56）、（122.29±11.37）、（83.70±7.08），P＜0.05］。見(jiàn)圖3。

圖3 Caveolin-1 蛋白表達(dá)Fig.3 Caveolin-1 protein expression

2.6 Caveolin-1 過(guò)表達(dá)對(duì)LPS 誘導(dǎo)的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞凋亡的影響與LPS+pcDNA組比較，LPS+pcDNA-Caveolin-1 組細(xì)胞凋亡率和Bax 蛋白水平均顯著降低［（28.75 ± 2.09）%vs.（12.98 ± 1.08）%，（0.77 ± 0.06）vs.（0.42 ± 0.04），P＜0.05］，Bcl-2 蛋白水平顯著升高［（0.13 ± 0.02）vs.（0.41 ± 0.04），P＜0.05］。見(jiàn)圖4。

圖4 Caveolin-1 過(guò)表達(dá)對(duì)LPS 誘導(dǎo)的Nthy-ori3-1 細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of Caveolin-1 overexpression on LPS-induced apoptosis of Nthy-ori3-1 cells

2.7 抑制Caveolin-1 表達(dá)對(duì)YLSPS（1.0 μg/mL）作用的逆轉(zhuǎn)與LPS+YLSPS+si-NC 組比較，LPS+YLSPS+si-Caveolin-1 組Caveolin-1 蛋白水平、Bcl-2蛋白水平顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白、IL-1β、IL-6 和MCP-1 水平均顯著升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖5、表4。

圖5 抑制Caveolin-1 表達(dá)逆轉(zhuǎn)YLSPS 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的Nthy-ori3-1 細(xì)胞和凋亡的作用Fig.5 Inhibition of Caveolin-1 expression reverses the effect of YLSPS on LPS-induced Nthy-ori3-1 cells and apoptosis

表4 抑制Caveolin-1 表達(dá)逆轉(zhuǎn)YLSPS 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的Nthy-ori3-1 細(xì)胞炎癥損傷和凋亡的作用Tab.4 Inhibition of Caveolin-1 expression reverses the effect of YLSPS on LPS-induced inflammatory injury and apoptosis in Nthy-ori3-1 cells ±s

表4 抑制Caveolin-1 表達(dá)逆轉(zhuǎn)YLSPS 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的Nthy-ori3-1 細(xì)胞炎癥損傷和凋亡的作用Tab.4 Inhibition of Caveolin-1 expression reverses the effect of YLSPS on LPS-induced inflammatory injury and apoptosis in Nthy-ori3-1 cells ±s

分組LPS+YLSPS+si-NC LPS+YLSPS+si-Caveolin-1 t值P值Caveolin-1蛋白0.61±0.05 0.21±0.02 22.283＜0.001 IL-1β（pg/mL）78.85±7.72 376.17±27.00 31.763＜0.001 IL-6（pg/mL）92.37±7.99 240.97±18.20 22.428＜0.001 MCP-1（pg/mL）67.66±6.34 291.05±22.87 28.238＜0.001凋亡率（%）10.57±1.08 21.51±2.17 13.540＜0.001 Bcl-2蛋白0.51±0.04 0.25±0.03 15.600＜0.001 Bax 蛋白0.32±0.03 0.66±0.05 17.493＜0.001

2.8 各組小鼠一般情況及甲狀腺組織形態(tài)學(xué)觀察（1）與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠一般狀態(tài)差、精神亢奮、易怒、毛發(fā)稀疏、無(wú)毛澤和體重增長(zhǎng)慢；與模型組相比，YLSPS 處理后，各組小鼠狀態(tài)得到明顯改善，高劑量組小鼠狀態(tài)接近對(duì)照組。（2）與對(duì)照組相比，模型組小鼠甲狀腺體積顯著增大，顏色更深；與模型組相比，YLSPS 處理后，各組小鼠狀態(tài)甲狀腺狀態(tài)得到明顯改善，高劑量組小鼠狀態(tài)接近對(duì)照組。（3）空白對(duì)照組、模型組、低劑量YLSPS 組、中劑量YLSPS 組和高劑量YLSPS 組小鼠甲狀腺指數(shù)為（2.565 ± 0.482）× 10-4、（5.427 ±0.391）×10-4、（4.134±0.338）×10-4、（3.502±0.481）×10-4和（2.835±0.327）×10-4。

2.9 YLSPS對(duì)各組小鼠甲狀腺HE染色影響空白對(duì)照組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞排列整齊，呈扁平狀，濾泡腔光滑，泡腔內(nèi)均勻充滿深紅色膠質(zhì)。而模型組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞顯著增大，濾泡腔粗糙，泡腔內(nèi)紅色膠質(zhì)明顯減少。與模型組相比，YLSPS 處理后，甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞狀態(tài)得到明顯改善，且具有劑量依賴性，高劑量組與對(duì)照組接近。見(jiàn)圖6。

圖6 各組小鼠甲狀腺組織（HE 染色）Fig.6 Thyroid tissue of mice in each group（HE staining）

2.10 YLSPS 對(duì)小鼠甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞炎癥損傷的影響與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠中IL-1β、IL-6 和MCP-1 水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各劑量YLSPS 處理組中IL-1β、IL-6和MCP-1 水平均顯著降低（P＜0.05），且具有劑量依賴性，見(jiàn)表5。

2.11 各組小鼠甲狀腺組織中Caveolin-1 表達(dá)情況與對(duì)照組比較，模型組小鼠甲狀腺組織中Caveolin-1 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與模型組比較，各劑量YLSPS 處理組小鼠甲狀腺組織中Caveolin-1 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），且具有劑量依賴性，見(jiàn)圖7、表6。

表6 各組小鼠甲狀腺組織中Caveolin-1 表達(dá)情況Tab.6 Expression of Caveolin-1 in thyroid tissue of mice in each group±s

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與低劑量處理組比較，&P＜0.05；與中劑量處理組比較，$P＜0.05

分組對(duì)照組模型組低劑量處理組中劑量處理組高劑量處理組F 值P 值Caveolin-1 mRNA 1.00±0.07 0.43±0.04*0.62±0.05#0.76±0.07#&0.91±0.06#&$148.086＜0.001 Caveolin-1 蛋白0.82±0.07 0.34±0.03*0.49±0.04#0.62±0.06#&0.75±0.06#&$129.212＜0.001

圖7 各組小鼠甲狀腺組織中Caveolin-1 蛋白的表達(dá)Fig.7 Caveolin-1 protein expression in thyroid tissues of mice in each group

3 討論

玉郎傘是一種廣西地區(qū)常用的民間草藥，具有補(bǔ)氣、補(bǔ)血和抗衰老等功效。玉郎傘的活性成分比較復(fù)雜，包括多糖、黃酮和皂苷類等物質(zhì)［10］。研究顯示，YLSPS 可通過(guò)降低血清中TGF-β 和IL-6表達(dá)、抗自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)放射性肺損傷大鼠發(fā)揮保護(hù)作用［11］；YLSP可通過(guò)增強(qiáng)抗氧化活性和免疫力，調(diào)節(jié)衰老相關(guān)基因的表達(dá)保護(hù)D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠氧化應(yīng)激損傷和免疫功能［12］；YLSPS可通過(guò)降低脂質(zhì)過(guò)氧化減輕異煙肼和利福平誘導(dǎo)的小鼠肝損傷，具有研發(fā)為治療肝損傷新藥的潛在價(jià)值［13］。

橋本甲狀腺炎是甲狀腺最常見(jiàn)的炎癥性疾病，與機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。IL-1β 是一種水溶性的細(xì)胞因子，可由活化的單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等分泌。IL-1β 在急慢性炎癥、自身免疫性疾病和腫瘤中不僅能夠破壞細(xì)胞完整性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，還可通過(guò)激活下游信號(hào)通路，誘導(dǎo)其他炎癥因子（IL-6）、趨化因子、黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展［14］。MCP-1 是機(jī)體內(nèi)的重要趨化因子，參與調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白三烯的釋放，促進(jìn)炎癥反應(yīng)［15-17］。本研究顯示，不同濃度的YLSPS 作用于LPS 誘導(dǎo)的Nthy-ori3-1 細(xì)胞后，細(xì)胞中IL-1β、IL-6 和MCP-1 水平均顯著降低，表明YLSPS可抑制LPS誘導(dǎo)的Nthyori3-1 細(xì)胞炎癥損傷。

細(xì)胞凋亡是受多種基因調(diào)控的程序性死亡過(guò)程，在生物體內(nèi)廣泛存在。Bax 和Bcl-2 是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控分子，Bax 表達(dá)升高可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2 表達(dá)升高則抑制細(xì)胞凋亡［18］。研究表明，細(xì)胞凋亡與橋本甲狀腺炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，橋本甲狀腺炎中T 淋巴細(xì)胞及其細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可誘導(dǎo)甲狀腺濾泡細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致腺體破壞［19］。本研究顯示，YLSPS 可降低LPS誘導(dǎo)的Nthy-ori3-1 細(xì)胞凋亡率和Bax 蛋白表達(dá)，并促進(jìn)Bcl-2 蛋白表達(dá)，說(shuō)明YLSPS 可抑制LPS 誘導(dǎo)的Nthy-ori3-1 細(xì)胞凋亡。

Caveolin-1 定位于人染色體7q31.1，廣泛表達(dá)于上皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等終末細(xì)胞中。研究顯示，Caveolin-1 在橋本甲狀腺炎患者組織中表達(dá)降低，下調(diào)Caveolin-1 可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，其可能是橋本甲狀腺炎治療的分子靶點(diǎn)［20-21］。本研究結(jié)果顯示，YLSPS 可促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)的Nthyori3-1 細(xì)胞中Caveolin-1 的mRNA 和蛋白的表達(dá)，過(guò)表達(dá)Caveolin-1 可抑制LPS 誘導(dǎo)的Nthy-ori3-1 細(xì)胞炎癥損傷，抑制了LPS 誘導(dǎo)的Nthy-ori3-1 細(xì)胞凋亡。另外，抑制Caveolin-1 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了YLSPS 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的Nthy-ori3-1 細(xì)胞炎癥損傷和凋亡的影響，說(shuō)明YLSPS 通過(guò)上調(diào)Caveolin-1 表達(dá)來(lái)抑制LPS 誘導(dǎo)的Nthy-ori3-1 細(xì)胞炎癥損傷和凋亡。

本研究還顯示YLSPS 可改善甲狀腺炎模型小鼠甲狀腺組織形態(tài)，降低模型小鼠血清中IL-1β、IL-6 和MCP-1 的水平，并促進(jìn)模型小鼠甲狀腺組織中Caveolin-1 蛋白的表達(dá)，與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步提示YLSPS 可能通過(guò)上調(diào)Caveolin-1表達(dá)對(duì)甲狀腺炎具有一定的治療療效，但其是否直接調(diào)控Caveolin-1 表達(dá)發(fā)揮作用還有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，YLSPS可有效抑制LPS誘導(dǎo)的Nthyori3-1 細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡，其可能通過(guò)上調(diào)細(xì)胞中Caveolin-1 表達(dá)發(fā)揮作用，具有開發(fā)為治療甲狀腺炎藥物的潛在價(jià)值。