黃鶯 周芬 袁文勝 徐芳

1武漢市第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科（武漢 430022）；2泰康同濟(jì)（武漢）醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科（武漢 430022）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以氣道炎癥和氣道重塑為主要病理特征的呼吸系統(tǒng)疾病，以抗炎、逆轉(zhuǎn)氣道重塑為主要治療目標(biāo)。紅景天苷（Salidroside，SAL）為紅景天主要有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗惡病質(zhì)、抗凋亡等特性［1］，LUO 等［2］報(bào)道紅景天苷可通過(guò)抗炎作用緩解香煙煙霧引起的小鼠COPD 病情，但關(guān)于其在COPD 中的作用機(jī)制尚無(wú)定論。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ）為核受體超家族成員之一，在肺部炎癥控制中扮演了重要角色［3］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor β，TGF-β）為促纖維化細(xì)胞因子，在氣道炎癥與氣道重塑中發(fā)揮了重要作用。研究表明，TGF-β1/果蠅母源抗生物皮膚生長(zhǎng)因子（drosophilamothersagainstdecapentaplegic，Smad）通路是TGF-β1 誘導(dǎo)氣道重塑的重要途徑之一，其中Smad 蛋白是該途徑調(diào)節(jié)系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)子，可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，并促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄［4］。為故本實(shí)驗(yàn)擬分析紅景天苷治療COPD 的功效，探索其通過(guò)PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/3 通路影響COPD 相關(guān)炎癥與重塑的潛在機(jī)制，為研發(fā)COPD治療新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，40 只，7 周齡，體質(zhì)量260～270 g，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。實(shí)驗(yàn)開展前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，動(dòng)物房溫度22～26 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，自然光照，普通飼料喂養(yǎng)，自由攝食飲水。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器紅旗渠香煙（焦油13 mg，尼古丁1.1 mg，河南安陽(yáng)卷煙廠），布地奈德混懸液（AstraZeneca Pty Ltd，注冊(cè)證號(hào)H20140475，規(guī)格2 mL：1 mg），紅景天苷（北京索萊寶科技有限公司，HPLC ≥98%，分子式C14H20O7，分子量300.3，貨號(hào)SS8080）。大鼠白介素-8（interleukin-8，IL-8）、IL-10 ELISA 試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司），PPAR-γ、磷酸化PPAR-γ（p-PPAR-γ）、TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3 和GAPDH 一抗（Abcam），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（上海碧云天生物科技有限公司）。Buxcodx 動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)PFT（美國(guó)BUXCO 公司），Smart view 凝膠圖像分析系統(tǒng)（美國(guó)Major Science 公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模、分組和干預(yù)將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、SAL 低劑量組、SAL 高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組，每組8 只。除了正常組不作任何處理，其余四組用香煙煙熏法建立大鼠COPD 模型［5］：自制45 cm × 55 cm × 60 cm 煙熏箱，將大鼠置入箱內(nèi)，每次點(diǎn)燃6 支香煙，每次煙熏10 min 左右，香煙燃盡5 min 后，打開頂蓋讓大鼠休息5 min，然后再次點(diǎn)燃6 支香煙重復(fù)上述步驟。每日煙熏1 次，每周6 次，共計(jì)36 周。連續(xù)煙熏7 d 后，第8 天開始煙熏前半小時(shí)予以腹腔注射給藥，直至第36周最后1次煙熏結(jié)束。SAL 低、高劑量組每日上午煙熏前半小時(shí)分別腹腔注射紅景天苷100、200 mg/kg［6］，模型組和正常組腹腔注射等體積生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組予以霧化吸入布地奈德0.025 mg/kg，每日2次，該劑量參考《藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算》，動(dòng)物與人每公斤體重劑量折算系數(shù)6.25，折算大鼠用藥劑量為此劑量［7］。觀察大鼠一般狀況。

1.2.2 小動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀檢測(cè)各組大鼠肺功能最后1 次用藥結(jié)束后，在大鼠器官軟骨環(huán)之間取水平切口，置入金屬插管固定，將大鼠置入體描箱，鏈接數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，檢測(cè)呼吸功能參數(shù)用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）、第0.1 秒最大用力呼氣容量（FEV0.1）、呼氣峰流速（Peak Expiratory Flow，PEF），重復(fù)3 次檢測(cè)，計(jì)算FEV0.1/FVC和PEF 值。

1.2.3 ELISA 法測(cè)定大鼠血清炎癥因子腹主動(dòng)脈采血，離心取血清，參考大鼠血清IL-8、IL-10 ELISA 試劑盒檢測(cè)。

1.2.4 HE 染色觀察大鼠肺組織病理變化處死大鼠，取右肺中葉，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后制作3 μm 厚左右的連續(xù)切片。取一半切片根據(jù)HE 染色試劑盒染色，脫水，透明，封片，鏡下計(jì)數(shù)炎性細(xì)胞，隨機(jī)選取10 個(gè)視野計(jì)數(shù)，用半定量法進(jìn)行評(píng)分：（1）無(wú)肺泡炎（-）；（2）輕度肺泡炎（+），細(xì)胞浸潤(rùn)致肺泡隔增寬，病變范圍不足全肺20%；（3）中度肺泡炎（++），病變范圍占全肺20%～50%；（4）重度肺泡炎（+++），病變彌漫性分布，范圍超過(guò)50%。根據(jù)分級(jí)依次計(jì)1、2、3、4 分。

1.2.5 Masson染色觀察氣道平滑肌與膠原面積取剩余切片脫蠟至水，置入Masson復(fù)合染色液10 min，清洗，置入5%磷鎢酸1 min，清洗，置入亮綠染色液，脫水、透明、封片。用Img-Pro 6.0 圖像分析系統(tǒng)，確定5 個(gè)完整的支氣管橫截面，測(cè)定支氣管基底膜內(nèi)壁周徑（Pbm）、膠原沉積面積（Wcol）和平滑肌面積（WAm）。

1.2.6 Western blot 檢測(cè)肺組織中PPAR-γ/TGFβ1/Smad2/3 通路蛋白表達(dá)取左肺組織研磨，裂解后提取蛋白液，BCA 法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，電泳后轉(zhuǎn)膜、封閉。與兔抗大鼠PPAR-γ、p-PPAR-γ、TGFβ1、Smad2/3、p-Smad2/3 和GAPDH 一抗（1∶1 000）孵育過(guò)夜后，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h。經(jīng)發(fā)光、顯影和定影后，分析目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況造模開始后，大鼠有明顯的氣促、煩躁和站立不穩(wěn)等癥狀，且隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，上述表現(xiàn)越來(lái)越明顯，同時(shí)出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、毛色晦暗以及體重減輕等情況，表示造模成功。與模型組比較，干預(yù)組用藥后上述表現(xiàn)有所好轉(zhuǎn)，且有時(shí)間依賴性。正常組大鼠外觀、活動(dòng)、精神以及呼吸等均正常。

2.2 大鼠肺功能指標(biāo)與正常組比較，模型組大鼠FEV0.1/FVC 和PEF 值降低（P＜0.05）；與模型組比較，SAL 低、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠FEV0.1/FVC 和PEF 值升高，其中SAL 低劑量組＜SAL 高劑量組＜陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠肺功能指標(biāo)Tab.1 Pulmonary function indexes of rats in each group x±s

2.3 大鼠血清炎癥因子與正常組比較，模型組大鼠血清IL-8 水平較高，IL-10 水平較低（P＜0.05）；與模型組比較，SAL 低、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清IL-8 水平較低，IL-10 水平較高（P＜0.05）；與SAL 低劑量組比較，SAL 高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清IL-8 水平較低，IL-10 水平較高（P＜0.05）；與SAL 高劑量組比較，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清IL-8 水平較低，IL-10 水平較高（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠血清炎癥因子Tab.2 Serum inflammatory factors of rats in each group x±s，pg/mL

2.4 大鼠肺組織病理改變HE 染色（圖1）顯示：與正常組比較，模型組支氣管壁、間隔和血管周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，SAL 低劑量組有所改善，SAL 高劑量組進(jìn)一步改善，陽(yáng)性對(duì)照組顯著改善。肺泡炎癥半定量評(píng)分：對(duì)照組＜陽(yáng)性對(duì)照組＜SAL 高劑量組＜SAL 低劑量組＜模型組（P＜0.05），見表3。

圖1 肺組織病理學(xué)（HE 染色，×200，標(biāo)尺50 μm）Fig.1 Lung histopathology（HE staining，×200，scale bar 50 μm）

表3 大鼠肺泡炎癥程度半定量評(píng)分Tab.3 Semi-quantitative score of the degree of alveolar inflammation in rats ±s，分

表3 大鼠肺泡炎癥程度半定量評(píng)分Tab.3 Semi-quantitative score of the degree of alveolar inflammation in rats ±s，分

組別正常組模型組SAL 低劑量組SAL 高劑量組陽(yáng)性對(duì)照組例數(shù)8 8 8 8 8肺泡炎癥評(píng)分0.12±0.02 3.66±0.18*2.96±0.14*#1.72±0.12*#&0.78±0.08*#&△

2.5 大鼠氣道病理改變Masson 染色（圖2）顯示：支氣管壁平滑肌細(xì)胞呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色，與正常組比較，模型組大鼠平滑肌明顯增生、肥大，氣道膠原沉積明顯增多。與模型組比較，SAL 低劑量組氣道上述病理表現(xiàn)減輕，AL 高劑量組進(jìn)一步減輕，陽(yáng)性對(duì)照組顯著減輕。大鼠氣道WAm/Pbm、Wcol/Pbm 值：對(duì)照組＜陽(yáng)性對(duì)照組＜SAL高劑量組＜SAL低劑量組＜模型組（P＜0.05），見表4。

表4 大鼠氣道病理表現(xiàn)Tab.4 Pathological manifestations of rat airway x±s，μm2/μm

圖2 大鼠肺部病理圖（Masson 染色，×200，標(biāo)尺100 μm）Fig.2 Pathological map of rat lungs（Masson staining，×200，scale bar 100 μm）

2.6 大鼠肺組織中PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/3 通路蛋白表達(dá)各組PPAR-γ 和Smad2/3 蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組比較，模型組大鼠肺組織中p-PPAR-γ 蛋白表達(dá)水平較高，TGF-β1、p-Smad2/3 蛋白表達(dá)水平較低（P＜0.05）；與模型組比較，SAL 低、高劑量組大鼠肺組織中p-PPAR-γ 蛋白表達(dá)水平較低，TGF-β1、p-Smad2/3 蛋白表達(dá)水平較高（P＜0.05）；與SAL 低劑量組比較，SAL 高劑量組大鼠肺組織中p-PPAR-γ 蛋白表達(dá)水平較低，TGF-β1、p-Smad2/3 蛋白表達(dá)水平較高（P＜0.05），見表5、圖3-4。

圖3 大鼠肺組織中PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/Samd3 通路蛋白條帶圖Fig.3 PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/Samd3 pathway protein bands in rat lung tissue

表5 大鼠肺組織中PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/3 通路蛋白表達(dá)Tab.5 PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/3 pathway protein expression in rat lung tissue ±s

表5 大鼠肺組織中PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/3 通路蛋白表達(dá)Tab.5 PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/3 pathway protein expression in rat lung tissue ±s

組別正常組模型組SAL 低劑量組SAL 高劑量組p-PPAR-γ 0.25±0.03 0.97±0.06*0.69±0.05*#0.41±0.03*#&PPAR-γ 0.98±0.07 0.99±0.06 0.98±0.08 0.97±0.09 TGF-β1 0.46±0.04 0.09±0.01*0.22±0.02*#0.34±0.03*#&p-Smad2/3 0.75±0.06 0.22±0.03*0.43±0.04*#0.60±0.05*#&Smad2/3 0.95±0.06 0.94±0.07 0.93±0.08 0.96±0.08

3 討論

COPD 的發(fā)生機(jī)制尚未明確，西醫(yī)常用布地奈德等吸入糖皮質(zhì)激素治療，但部分患者對(duì)其敏感性降低，甚至出現(xiàn)抵抗。中醫(yī)藥在COPD 治療中有著眾多方法和獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，其中紅景天性寒、味甘而澀，歸肺經(jīng)，有補(bǔ)肺氣、散瘀活血之功效，常用于COPD 治療中。紅景天苷是從紅景天中提取的一種化合物，有許多有益的病理功效，HU 等［8］報(bào)道紅景天苷有抗炎功效，ZHANG 等［9］證明紅景天苷可治療肺損傷，故將其作為實(shí)驗(yàn)藥物，并嘗試分析其作用機(jī)制。

圖4 大鼠肺組織中PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/Samd3 通路蛋白表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of PPAR-γ/TGF-β1/Smad2/Samd3 pathway proteins in rat lung tissue

COPD 是以氣流受限為特征，伴發(fā)肺對(duì)有毒氣體或顆粒異常炎癥反應(yīng)的呼吸病，其發(fā)生與吸煙密不可分。故本實(shí)驗(yàn)以香煙煙熏造模，發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)呼吸急促、口唇發(fā)紺等COPD 癥狀，且病理切片可見肺組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，平滑肌增厚，氣道膠原沉積，符合COPD 與氣道重塑的病理變化，說(shuō)明造模成功。FEV0.1/FVC 和PEF 是臨床評(píng)估肺功能的常用指標(biāo)，其中FEV0.1/FVC 反應(yīng)個(gè)體通氣功能，PEF 則可判斷氣道是否堵塞，本研究結(jié)果顯示：紅景天苷干預(yù)后大鼠FEV0.1/FVC 和PEF 值升高，提示紅景天苷可改善COPD 大鼠肺功能。氣道炎癥和氣道重塑幾乎同步，HE 染色觀察發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，SAL 低、高劑量組大鼠肺組織炎癥浸潤(rùn)明顯減輕，炎癥評(píng)分降低，提示紅景天苷對(duì)COPD有抗炎功效。IL-8 為介導(dǎo)肺部炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，是T 淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞強(qiáng)趨化因子，能夠募集大量T 淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞持續(xù)聚集在肺部。煙熏可刺激中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌大量IL-8，誘導(dǎo)上述炎癥細(xì)胞聚集在肺部，形成惡性循環(huán)［10］。IL-8 還可促進(jìn)中性粒細(xì)胞釋放彈性蛋白酶，破壞彈性纖維，刺激尿液分泌，增加基底膜，引起支氣管痙攣，刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-8，最終形成鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，加重肺部炎癥反應(yīng)。IL-10 是活化的T 細(xì)胞與單核細(xì)胞所分泌，可抑制內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞等分泌促炎因子，比如縮短煙熏誘發(fā)的肺內(nèi)炎癥細(xì)胞增加過(guò)程，抑制促炎因子腫瘤壞死因子α、IL-6 等表達(dá)，減輕肺部炎癥反應(yīng)，是肺部炎癥一個(gè)重要內(nèi)源性抑制劑［11］。本研究顯示：紅景天苷干預(yù)后大鼠血清IL-8 水平較低、IL-10 較高，肺組織浸潤(rùn)減少，肺泡炎癥評(píng)分較低，提示紅景天苷可抑制IL-8 分泌同時(shí)提升IL-10 濃度，紅景天苷對(duì)COPD 有抑炎作用。Masson 染色顯示：紅景天苷干預(yù)后大鼠平滑肌增生和氣道膠原沉積均明顯減少，WAm/Pbm 和Wcol/Pbm 值降低，提示紅景天苷可對(duì)COPD 大鼠氣道重塑有改善作用，這對(duì)減輕COPD氣促等癥狀及抑制COPD進(jìn)展有重大作用。

PPARs 是核激素受體超家族成員，也是依賴配體活化的一類轉(zhuǎn)錄因子，可通過(guò)反式阻抑機(jī)制抑制細(xì)胞促炎作用，PPAR-γ作為其亞型之一，本身及其配體因抗炎作用顯著而備受關(guān)注［12-13］。TAM 等［14］通過(guò)建立體外肺泡巨噬細(xì)胞模型和與COPD相關(guān)的體內(nèi)動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)了PPAR-γ的抗炎潛力，證明其相關(guān)激動(dòng)劑對(duì)煙草引起的肺部炎癥有治療作用。本研究中，紅景天苷干預(yù)后大鼠肺組織中p-PPAR-γ蛋白表達(dá)水平升高，提示紅景天苷可上調(diào)COPD 大鼠肺部PPAR-γ 蛋白表達(dá)，這可能是紅景天苷發(fā)揮抗炎作用的靶蛋白。TGF-β超家族在細(xì)胞外基質(zhì)重塑方面有重要作用，其中TGF-β1 是一種重要的促纖維化因子和炎癥介質(zhì)，可促進(jìn)膠原蛋白聚集在細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)，導(dǎo)致氣道重塑［15-16］。Smads 蛋白家族是迄今唯一被證明的TGF-β受體作用底物，也是TGF-β1受體復(fù)合物下游信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白，其中Smad3為受體調(diào)節(jié)型Smad 蛋白，與Smad2 一起被TGF-β1Ⅳ型受體激活后，與Smad4組成異源性多聚體，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，激活DNA 轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)靶蛋白表達(dá)。DENG等［17］、SUN 等［18］證明Smad2 過(guò)表達(dá)時(shí)會(huì)增加氣道膠原蛋白沉積，促進(jìn)平滑肌增生，導(dǎo)致氣道平滑肌增厚，推測(cè)Smad2與氣道重塑有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，模型組肺部TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達(dá)水平高于正常組，提示煙熏造模激活了TGF-β1/Smad 信號(hào)通路；紅景天苷干預(yù)后大鼠肺部TGF-β1、p-Smad2/3 蛋白表達(dá)水平降低，提示紅景天苷可抑制TGF-β1/Smad 信號(hào)通路，這可能是其抑制肺纖維化、肺部炎癥以及氣道重塑的機(jī)制之一。

總之，紅景天苷對(duì)COPD 大鼠有抗炎和改善氣道重塑的作用，可能通過(guò)調(diào)節(jié)PPAR-γ/TGF-β1/Smad信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。但本研究亦存在一些不足，比如紅景天苷是否能靶向PPAR-γ、PPAR-γ 是否為紅景天苷唯一靶點(diǎn)等，這將在未來(lái)進(jìn)一步研究。