王思琦 盧雪 金香子 于婕 金光明

延邊大學(xué)附屬醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科（吉林延吉 133000）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）和糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥［1-2］?，F(xiàn)階段，從基因水平研究病因及預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)因素是各國(guó)研究的熱點(diǎn)，至今已有20 多種線粒體基因突變被發(fā)現(xiàn)與T2DM 有關(guān)［3-5］。有學(xué)者認(rèn)為［6］同一疾病在不同民族之間，其易感基因也存在差異，朝鮮族作為我國(guó)代表性少數(shù)民族之一，研究其T2DM 及DR 的易感基因是非常有意義的。另?yè)?jù)研究表明［7］，由炎癥介質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)引發(fā)的炎癥及應(yīng)激反應(yīng)，可引起DR 患者視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈（central retinal artery，CRA）的血流動(dòng)力學(xué)改變，這是導(dǎo)致DR 發(fā)生發(fā)展的重要原因。彩色多普勒超聲（colour doppler ultrasound，CDUS）是臨床上應(yīng)用最為廣泛的檢查技術(shù)，在檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)方面，具有其他檢查無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。本研究創(chuàng)新性地將基因突變與血流動(dòng)力學(xué)改變相結(jié)合，旨在為延邊朝鮮族T2DM 患者早期診斷DR 提供一些預(yù)警信息，以達(dá)到早期預(yù)防DR 發(fā)生的目標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2020年1月至2021年8月在我院內(nèi)分泌科及眼科住院的朝鮮族T2DM 患者198 例，其中男103 例，女95 例，平均年齡（53.87 ±15.30）歲。依據(jù)2014年中華醫(yī)學(xué)會(huì)眼科學(xué)分會(huì)眼底病學(xué)組撰寫(xiě)的《我國(guó)糖尿病視網(wǎng)膜病變臨床診療指南（2014年）》進(jìn)行眼底病變分期。所有T2DM患者行眼底鏡、裂隙燈檢查并眼底照相。診斷出DR 患者67 例，無(wú)DR 患者131 例。應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)患者線粒體ND4 基因12026 A→G 突變，根據(jù)結(jié)果分為無(wú)基因突變組和存在基因突變組，再以CDUS 對(duì)患者眼部進(jìn)行檢查，記錄CRA 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。本研究倫理審核批準(zhǔn)號(hào)為IACUC-201910010-81，實(shí)驗(yàn)前向所有患者詳細(xì)告知實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，在患者自愿條件下簽署知情同意書(shū)。

1.2 CRA 血流動(dòng)力學(xué)檢查方法應(yīng)用SIEMENS S2000 彩色多普勒超聲診斷儀，選用線陣探頭（頻率5～10 MHz），進(jìn)行操作時(shí)，所有患者彩超診斷儀設(shè)定條件均一致。囑患者取仰臥位，閉合眼瞼，探頭置于眼瞼上方，當(dāng)二維圖像上出現(xiàn)眼球及視神經(jīng)后，加用彩色多普勒超聲，當(dāng)清晰顯示CRA 主干血流束時(shí)，將其放置于彩色取樣框中央，再緩慢將取樣線中心移至血流束顏色最明亮處，進(jìn)行頻譜多普勒測(cè)量，根據(jù)測(cè)量結(jié)果分別記錄每位患者CRA 搏動(dòng)指數(shù)（PI）、阻力指數(shù)（RI）最高流速（Vmax）、最低流速（Vmin）、平均流速（Vmean）和血流速度積分（VTI）等血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.3 DNA 提取和基因型檢測(cè)

1.3.1 基因組DNA 提取空腹條件下，抽取患者靜脈血3 mL，從中提取300 μL 移至1.5 mL 離心管中，按照DNA 基因組純化試劑盒（賽默飛世爾科技）說(shuō)明書(shū)上的步驟提取DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量，最后置于超低溫冰箱儲(chǔ)存。

1.3.2 聚合酶鏈反應(yīng)根據(jù)基因庫(kù)數(shù)據(jù)，上游引物：5′-TTTACCACAACACAATGGGG-3′，下游引物：5′-AAGGGGTCGTAAGCCTCTGT-3′，由賽默飛世爾科技公司合成。在離心管中依次加入5 μL 的10×PCR 緩沖液，5 μL 的dNTP（濃度為2.5 mmol/L），5 μL 的模板DNA，0.5 μL 的Taq DNA 聚合酶及上、下游引物各1 μL，其余部分添加無(wú)菌蒸餾水直至PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系達(dá)到50 μL。以賽默飛世爾熱循環(huán)PCR 儀（Veriti 96）進(jìn)行擴(kuò)增，具體條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；再按如下程序循環(huán)35 次：95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；末次循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。

1.3.3 限制性酶切離心管中分別加入PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，0.5 μL Hinc Ⅱ內(nèi)切酶（賽默飛世爾科技公司）進(jìn)行酶切反應(yīng)，結(jié)束后置于37 ℃水浴箱中孵育3 h。5%瓊脂糖凝膠電泳，EB 染色后經(jīng)紫外燈判斷結(jié)果并拍照，判定所有樣本基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 23.0 軟件包進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，比較用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 線粒體基因ND4 12026（A→G）突變反向測(cè)序結(jié)果基因測(cè)序委托中科生信（北京信源佳生物科技有限公司）進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)根據(jù)“H-W 平衡定律”檢驗(yàn)線粒體基因，結(jié)果顯示基因型分布符合遺傳平衡定律。進(jìn)一步進(jìn)行反向測(cè)序，結(jié)果顯示線粒體基因12026 位點(diǎn)存在A→G 突變（圖1）。

圖1 線粒體基因ND4 12026（A→G）突變反向測(cè)序圖Fig.1 Reverse sequencing of mitochondrial gene ND4 12026（A→G）mutation

2.2 線粒體基因ND4（12026）基因型判定經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，線粒體ND4（12026）基因所得產(chǎn)物長(zhǎng)度為209 bp，限制性內(nèi)切酶HincⅡ酶切識(shí)別位點(diǎn)為GTY↓RAC（R=A 或G，Y=G 或T），線粒體DNA 12026 位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)將其分割成171 bp 和38 bp 兩個(gè)片段（圖2）。

圖2 HincⅡ酶切線粒體基因ND4（12026）5%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 5%agarose gel electrophoresis of Hinc Ⅱenzyme digestion of mitochondrial gene ND4（12026）

2.3 無(wú)DR與DR患者線粒體ND4基因12026A→G突變情況在無(wú)DR 組131 例T2DM 患者中，檢出線粒體DNA 12026 A→G 突變1 例，其突變率為0.08%；在DR 組67 例T2DM 患者中，檢出線粒體DNA 12026 A→G突變10例，其突變率為14.91%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.522，P=0.023）。見(jiàn)表1。

2.4 無(wú)基因突變和有基因突變DR 患者CRA 血流動(dòng)力學(xué)的比較有基因突變的DR 患者的CRA血流速度Vmax、Vmin、Vmean 及VTI 較無(wú)基因突變的DR 患者降低（P＜0.05），而PI、RI 增加（P＜0.001）。見(jiàn)表1、圖3。

表1 無(wú)基因突變和有基因突變DR 患者之間CRA 血流動(dòng)力學(xué)比較Tab.1 Comparison of CRA hemodynamics between DR patients without and with gene mutation ±s

表1 無(wú)基因突變和有基因突變DR 患者之間CRA 血流動(dòng)力學(xué)比較Tab.1 Comparison of CRA hemodynamics between DR patients without and with gene mutation ±s

組別無(wú)突變組存在突變組P 值例數(shù)57 10 Vmax（cm/s）15.29±3.70 7.81±0.27 0.041 Vmin（cm/s）5.37±1.36 2.02±0.48 0.039 Vmean（cm/s）10.30±11.59 4.56±1.44 0.044 VTI 8.86±2.60 4.03±1.15 0.036 PI 0.51±0.52 0.87±0.24＜0.001 RI 0.53±0.03 0.82±0.18＜0.001

圖3 無(wú)突變和存在突變的DR 患者CRA 血流動(dòng)力學(xué)超聲圖Fig.3 Ultrasonography of CRA hemodynamics in DR patients without and with mutations

3 討論

本研究中首先應(yīng)用PCR-RFLP 技術(shù)和直接測(cè)序法檢測(cè)了延邊地區(qū)198 例朝鮮族T2DM 患者線粒體ND4 基因12026 A→G 突變的情況，根據(jù)結(jié)果將其分為無(wú)基因突變和有基因突變兩組，再應(yīng)用CDUS 對(duì)兩組患者的CRA 血流動(dòng)力學(xué)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。發(fā)現(xiàn)DR患者突變率為14.9%，無(wú)DR患者突變率為0.08%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

CRA 是負(fù)責(zé)滋養(yǎng)視網(wǎng)膜、維持視網(wǎng)膜血運(yùn)的最主要?jiǎng)用}血管，一旦CRA 發(fā)生血管硬化、管腔狹窄、甚至閉塞時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜毛細(xì)血管缺血缺氧，引發(fā)視網(wǎng)膜病變，甚至導(dǎo)致失明。研究顯示，線粒體DNA 中的某些基因突變可以導(dǎo)致機(jī)體葡萄糖、胰島素、脂質(zhì)水平代謝異常，從而引起T2DM患者血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展［8-9］。此外，線粒體ND4 基因12026 A→G 的突變可導(dǎo)致T2DM 患者產(chǎn)生過(guò)多的活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS 引發(fā)CRA 硬化并最終形成DR 的可能機(jī)制如下：（1）使低密度脂蛋白被氧化，導(dǎo)致大量氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein cholesterol，ox-LDL）的形成，當(dāng)其被巨噬細(xì)胞吞噬后，形成泡沫細(xì)胞堆積于血管壁，引發(fā)血管壁彈性下降［10］。（2）引發(fā)高級(jí)糖基化末端產(chǎn)物（advanced glycosylation end，AGE）的大量形成，通過(guò)激活多元醇、己糖胺和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）等信號(hào)通路，使環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）在血管內(nèi)皮過(guò)度表達(dá)，導(dǎo)致血管平滑肌的增殖遷移及血管內(nèi)皮的缺血［11-13］。（3）與一氧化氮（nitric oxide，NO）協(xié)同作用產(chǎn)生大量過(guò)氧亞硝基陰離子（peroxynitroso anion，ONOO-），通過(guò)硝基化作用，導(dǎo)致血管壁纖維組織增生及鈣質(zhì)沉著，甚至斑塊形成發(fā)生狹窄［14］。上述結(jié)果均會(huì)導(dǎo)致存在該基因突變的T2DM 患者CRA血管內(nèi)阻力增大及血管彈性降低，因此在CDUS 檢測(cè)時(shí)，呈現(xiàn)出CRA 血流速度明顯降低，RI、PI 值升高的情況。

有不同學(xué)者［15-18］分別對(duì)我國(guó)云南、南昌和上海等地區(qū)漢族T2DM 患者線粒體基因mt12026 A→G 突變進(jìn)行了研究，得出了該基因突變與漢族T2DM 患者的發(fā)病相關(guān)的結(jié)論，并且認(rèn)為存在此基因突變的T2DM 患者起病更早，擁有明確的遺傳史，在治療上應(yīng)盡早使用胰島素治療。而國(guó)內(nèi)其他少數(shù)民族有關(guān)此類的研究則較稀少，根據(jù)本研究可得出初步結(jié)論，線粒體基因mt12026 A→G 突變是漢族與朝鮮族T2DM 患者發(fā)展為DR 的共同易感基因，這與一些國(guó)外學(xué)者的研究結(jié)果相類似［19-21］，但此基因突變是否是不同人種的普遍易感基因則需要結(jié)合不同人種做進(jìn)一步的研究方可確定。

綜上所述，存在線粒體ND4 基因12026A→G 突變的T2DM 患者，提示其發(fā)展為DR 的可能性升高，或可作為臨床的一項(xiàng)預(yù)警信息。通過(guò)CDUS 觀察評(píng)價(jià)T2DM 患者CRA 血流動(dòng)力學(xué)變化，可作為預(yù)警DR的一項(xiàng)參考信息，具有一定的實(shí)用價(jià)值。