趙容山，梁偉堅(jiān)，鄧煒聰，林正江，曾昕明，洪永昌

東莞市人民醫(yī)院手外科，東莞 523000

骨質(zhì)疏松癥是最常見(jiàn)的骨退行性疾病之一，其主要特點(diǎn)是骨量低、骨微結(jié)構(gòu)改變和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加，嚴(yán)重影響了老年人尤其是絕經(jīng)后婦女的生活[1-3]。成骨細(xì)胞負(fù)責(zé)骨形成，破骨細(xì)胞參與骨吸收。骨質(zhì)疏松癥的病理生理學(xué)基礎(chǔ)是破骨細(xì)胞吸收增加，而成骨細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致骨形成減少和凈骨丟失[4,5]。研究表明，氧化應(yīng)激是骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵致病因素，過(guò)度氧化引起的成骨細(xì)胞功能障礙進(jìn)而導(dǎo)致成骨不足是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中凈骨丟失的重要原因[6,7]。氧化應(yīng)激不僅抑制成骨細(xì)胞分化和增殖還誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[8-10]。因此，通過(guò)藥物干預(yù)減輕氧化應(yīng)激有助于保護(hù)成骨細(xì)胞的功能并減少其死亡，對(duì)改善骨質(zhì)疏松癥有一定作用。

姜黃素(curcumin，Cur)是姜黃根莖中的一種黃色物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗癌的作用，常被用作香料和強(qiáng)效草藥[11]。據(jù)Li等[12]報(bào)道，Cur預(yù)處理通過(guò)消除活性氧(reactive oxygen species,ROS)對(duì)GSK3β-Nrf2信號(hào)通路的抑制作用減少成骨細(xì)胞凋亡并維持其分化功能。此外，3D打印支架釋放的脂質(zhì)體Cur對(duì)體外骨肉瘤(骨癌)細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性，但促進(jìn)成骨細(xì)胞(健康骨細(xì)胞)的存活和增殖[13]。然而，目前關(guān)于Cur對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下成骨細(xì)胞增殖的影響及其對(duì)成骨細(xì)胞氧化-還原系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未明確。因此，本研究采用過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激構(gòu)建成骨細(xì)胞功能障礙模型，并通過(guò)觀察Cur對(duì)細(xì)胞活性、增殖、分化及氧化-還原系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，闡明Cur保護(hù)氧化應(yīng)激狀態(tài)下成骨細(xì)胞功能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器

生物安全柜(Thermo Fisher公司，1384 A2型)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher公司，371型)；倒置顯微鏡(Nikon公司，LV150N型)；高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher公司，X1R型)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DHG-9030A型)；電熱恒溫震蕩水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DKZ-2型)；酶標(biāo)儀(Thermo Fisher公司，Multiskan FC型)；成像系統(tǒng)(上海天能生命科學(xué)有限公司，Tanon-5200Multi型)。

1.2 藥品與試劑

成骨細(xì)胞完全培養(yǎng)基(上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司，Lot：2020032501)。胎牛血清(美國(guó)Gibco公司，Lot：2176404)；β-甘油磷酸酯(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，Lot：D1809035)；抗壞血酸(德國(guó)默克公司，Lot：SLBN3833V)；堿性磷酸酶染液(南京建成生物工程研究所，Lot：20200112)；CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所，Lot：20200328)；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒(ABTS法，Lot：20200716)(南京建成生物工程研究所，Lot：20200724)；丙二醛測(cè)定試劑盒(TBA法)(南京建成生物工程研究所，Lot：20200502)；總超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒(WST-1 法)(南京建成生物工程研究所，Lot：20201025)；過(guò)氧化氫酶測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，Lot：20211127)；堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，Lot：20200315);茜素紅S染色液(0.2%)(北京索萊寶科技有限公司，Lot：20200423);β-actin抗體(澳大利亞Affinity公司，Lot：67c9910)；p-p38 MAPK抗體(澳大利亞Affinity公司，Lot：40s1057)；Wnt5a抗體(澳大利亞Affinity公司，Lot：56a9800)；β-catenin抗體(澳大利亞Affinity公司，Lot：52i2198)。

1.3 細(xì)胞

將新生SD大鼠置于75%的酒精中浸泡2 min，用眼科剪及鑷子分離顱骨，用眼科剪將其剪碎，然后轉(zhuǎn)移至離心管中，分別加入0.1%的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅳ型膠原酶和中性蛋白酶，于4 ℃消化過(guò)夜；次日將組織過(guò)100目篩網(wǎng)，收集濾液，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，接種至25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，每3天換液1次；細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)，用含EDTA的0.25%胰酶消化傳代。細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片，生長(zhǎng)至80%～90%匯合時(shí)取出爬片進(jìn)行ALP染色，用冷丙酮固定10 min，然后分別用孵育液在37 ℃孵育5 h，2%硝酸鈷浸泡5 min，1%硫酸銨浸泡2 min，最后沖洗、干燥、封固。在顯微鏡下觀察ALP染色情況，胞質(zhì)呈現(xiàn)灰黑色顆粒或塊狀沉積則為成骨細(xì)胞。

1.4 方法

1.4.1 氧化應(yīng)激模型構(gòu)建與藥物處理

依照文獻(xiàn)中構(gòu)建成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的方法處理體外培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞[14]，分為6個(gè)實(shí)驗(yàn)組：(1)正常對(duì)照組(normal control，NC)，在正常條件下培養(yǎng)；(2)H2O2處理組(H2O2)，用50 μmol/L終濃度的H2O2處理細(xì)胞；(3)1.25 μmol/L Cur預(yù)處理組(H2O2+1.25 μmol/L Cur)，用1.25 μmol/L的Cur預(yù)處理12 h后，再用50 μmol/L終濃度的H2O2處理細(xì)胞；(4)2.5 μmol/L Cur預(yù)處理組(H2O2+2.5 μmol/L Cur)，用2.5 μmol/L的Cur預(yù)處理12 h后，再用50 μmol/L終濃度的H2O2處理細(xì)胞；(5)5 μmol/L Cur預(yù)處理組(H2O2+5 μmol/L Cur)，用5 μmol/L的Cur預(yù)處理12 h后，再用50 μmol/L終濃度的H2O2處理細(xì)胞；(6)10 μmol/L Cur預(yù)處理組(H2O2+10 μmol/L Cur)，用10 μmol/L的Cur預(yù)處理12 h后，再用50 μmol/L終濃度的H2O2處理細(xì)胞。

1.4.2 成骨細(xì)胞增殖檢測(cè)

通過(guò)檢測(cè)H2O2處理后24、48和72 h大鼠成骨細(xì)胞的活力評(píng)估各組細(xì)胞的增殖情況。按照CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒的步驟，在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)往96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)的吸光度值(OD450 nm)。

1.4.3 總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)檢測(cè)

按照總抗氧化能力(T-AOC)檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)步驟配制反應(yīng)液，室溫反應(yīng)6 min后，檢測(cè)405 nm波長(zhǎng)的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品的T-AOC。

1.4.4 丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量測(cè)定

按照MDA測(cè)定試劑盒的說(shuō)明書(shū)步驟配制反應(yīng)液，95 ℃水浴40 min，取出后流水冷卻，4 000 r/min，離心10 min，取上清，檢測(cè)532 nm波長(zhǎng)的OD值，根據(jù)以下公式計(jì)算MDA含量：

MDA含量(nmol/mL)=[(OD測(cè)定-OD對(duì)照)/

(OD標(biāo)準(zhǔn)-OD空白)]×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)

1.4.5 過(guò)氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測(cè)定

按照總SOD測(cè)定試劑盒的說(shuō)明書(shū)步驟配制反應(yīng)液，37 ℃孵育20 min，檢測(cè)405 nm波長(zhǎng)的OD值。先計(jì)算出SOD抑制率(IRSOD)，然后根據(jù)IRSOD計(jì)算出SOD活性，計(jì)算公式如下：

IRSOD=[(OD對(duì)照-OD對(duì)照空白)-(OD測(cè)定-

OD測(cè)定空白)]/(OD對(duì)照-OD對(duì)照空白)×100%

SOD活性(U/mL)=(IRSOD/50%)×

反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)×樣品稀釋倍數(shù)

1.4.6 過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活性測(cè)定

按照CAT測(cè)定試劑盒的說(shuō)明書(shū)步驟配置相關(guān)試劑，與樣本混勻后在37 ℃反應(yīng)1 min，在405 nm處測(cè)定OD值，然后根據(jù)以下公式計(jì)算CAT活性：

CAT活性(U/mL)=[(OD對(duì)照-OD測(cè)定)/

(60×樣品量)]×271×稀釋倍數(shù)

1.4.7 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性測(cè)定

按照ALP測(cè)定試劑盒的說(shuō)明書(shū)步驟配制反應(yīng)液，37 ℃水浴15 min后加入顯色劑，檢測(cè)520 nm波長(zhǎng)的OD值，然后根據(jù)以下公式計(jì)算ALP活性：

ALP活性(U/mL)=

[(OD測(cè)定-OD空白)/(OD標(biāo)準(zhǔn)-

OD空白)]×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×100 mL×樣品稀釋倍數(shù)

1.4.8 誘導(dǎo)成骨分化及茜素紅染色

大鼠成骨細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)六孔板中，70%匯合時(shí)添加5 mmol/L的β-甘油磷酸酯和100 mg/mL抗壞血酸誘導(dǎo)成骨分化，每天更換1次分化培養(yǎng)基，持續(xù)1周。六孔板中的細(xì)胞用PBS洗3次后，4%多聚甲醛固定20 min；用雙蒸水洗3次；將水完全吸干凈后慢慢加入茜素紅S染色液，常溫下染色30 min；棄去染料，用雙蒸水洗5次。

1.4.9 免疫印跡(Western blotting)

提取成骨細(xì)胞的總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)PVDF膜，封閉后，用1∶500稀釋的β-actin、p38 MAPK、Wnt5a和β-catenin抗體在4 ℃孵育18 h；次日用TBST洗膜3次，用HRP標(biāo)記的二抗在室溫孵育1 h；TBST清洗3次后，加入ECL顯影。

1.4.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠成骨細(xì)胞鑒定

ALP為一類(lèi)磷酸酯酶，是成熟成骨細(xì)胞的標(biāo)志性酶。本實(shí)驗(yàn)采用金屬沉淀法顯示ALP的分布，此法以天然存在的β-甘油磷酸鈉為底物，經(jīng)ALP水解釋放出磷酸，立即被鈣離子沉淀為磷酸鈣，再次被置換為磷酸鈷，最終被硫化液置換為灰黑色沉淀。如圖1所示，ALP存在于95%以上的細(xì)胞被染成灰黑色，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)分離和培養(yǎng)的細(xì)胞即為成骨細(xì)胞。

圖1 成骨細(xì)胞鑒定

2.2 Cur對(duì)大鼠成骨細(xì)胞活力和增殖的影響

NC組的成骨細(xì)胞活力隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明細(xì)胞處于良好的增殖狀態(tài)，用H2O2處理后，細(xì)胞活力顯著降低(P< 0.001)(見(jiàn)圖2)，而且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞活性逐漸降低，提示由H2O2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激不僅抑制成骨細(xì)胞增殖，還誘導(dǎo)其死亡。與H2O2組相比，除了1.25 μmol/L的Cur在48 h開(kāi)始起作用，其它濃度的Cur(2.5～10 μmol/L)在24、48和72 h均顯增加細(xì)胞活性(P< 0.05)(見(jiàn)圖2)，而且胞活性也隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，說(shuō)明Cur除了保護(hù)成骨細(xì)胞抵御氧化損傷，還可以促進(jìn)氧化應(yīng)激狀態(tài)下的成骨細(xì)胞增殖。

圖2 成骨細(xì)胞活性及增殖檢測(cè)

2.3 Cur對(duì)氧化應(yīng)激的影響

SOD和CAT是內(nèi)源性抗氧化酶，對(duì)機(jī)體和細(xì)胞的氧化-還原平衡維持起重要作用，過(guò)度氧化應(yīng)激則可促進(jìn)脂質(zhì)發(fā)生氧化，生成MDA。與NC組比較，H2O2組的T-AOC、SOD和CAT水平顯著降低，而MDA水平顯著升高(P<0.001)(見(jiàn)圖3)，說(shuō)明50 μoml/L終濃度的H2O2可以刺激成骨細(xì)胞發(fā)生過(guò)度氧化應(yīng)激。各濃度的Cur(1.25～10 μmol/L)預(yù)處理均可以抑制氧化應(yīng)激，表現(xiàn)為T(mén)-AOC、SOD和CAT水平顯著升高，MDA水平顯著降低(P<0.01)(見(jiàn)圖3)，而且對(duì)MDA生成的抑制作用具有劑量依賴(lài)性，說(shuō)明該藥物具有良好的抗氧化活性。

圖3 成骨細(xì)胞的氧化還原指標(biāo)檢測(cè)

2.4 Cur對(duì)成骨細(xì)胞分化功能的影響

通過(guò)比較各組細(xì)胞的ALP活性及誘導(dǎo)分化后礦化鈣結(jié)節(jié)的形成情況評(píng)估Cur對(duì)成骨細(xì)胞分化功能的影響。如圖4所示，H2O2處理后成骨細(xì)胞的ALP活性顯著降低(P< 0.001)，而且礦化鈣結(jié)節(jié)(茜素紅S染色陽(yáng)性)明顯減少；1.25～5 μmol/L的Cur均可以顯著上調(diào)ALP的活性(P< 0.05)，并促進(jìn)礦化鈣結(jié)節(jié)形成，提示Cur可以保護(hù)氧化應(yīng)激狀態(tài)下的成骨細(xì)胞分化功能。

圖4 成骨細(xì)胞的分化功能評(píng)估

2.5 Cur對(duì)p-p38 MAPK和Wnt信號(hào)通路的影響

通過(guò)Western blotting檢測(cè)各組p-p38 MAPK和Wnt信號(hào)通路的表達(dá)，分析Cur保護(hù)氧化應(yīng)激狀態(tài)下成骨細(xì)胞功能的可能機(jī)制。如圖5所示，H2O2處理后成骨細(xì)胞的p-p38 MAPK蛋白表達(dá)水平顯著升高，而Wnt5a和β-catenin顯著降低(P< 0.001)；不同濃度的Cur則可以下調(diào)p-p38 MAPK并上調(diào)Wnt5a和β-catenin的水平(P< 0.05)，提示Cur可能通過(guò)調(diào)節(jié)p38 MAPK和Wnt信號(hào)通路保護(hù)成骨細(xì)胞功能。

圖5 各組p-p38 MAPK、Wnt5a和β-catenin的蛋白表達(dá)水平比較

3 討論與結(jié)論

氧化應(yīng)激損傷是骨質(zhì)疏松癥和/或骨壞死的主要病理之一，在培養(yǎng)液中加入H2O2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞功能障礙是一種已建立的模擬骨質(zhì)疏松癥的細(xì)胞模型[12,15,16]。H2O2是一種常見(jiàn)的活性氧(ROS)，其半衰期長(zhǎng)且容易穿透各種質(zhì)膜，因此可誘發(fā)明顯的脂質(zhì)氧化、蛋白質(zhì)損傷和DNA斷裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡和功能障礙[17]。本研究采用H2O2處理大鼠原代成骨細(xì)胞，致使細(xì)胞活性降低，增殖率和分化率減少，同時(shí)伴隨氧化還原失衡，說(shuō)明成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型構(gòu)建成功。

目前治療骨質(zhì)疏松癥的藥物主要包括雙膦酸鹽、激素療法、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、降鈣素、地諾單抗、鈣和維生素D補(bǔ)充劑[18]。最近，合成代謝藥物如特立帕肽，雷奈酸鍶，羅莫昔單抗已經(jīng)上市[17]。一項(xiàng)網(wǎng)絡(luò)薈萃分析研究表明，不同的藥物對(duì)不同部位的骨質(zhì)疏松具有不同療效[18]。此外，一些藥物的安全性問(wèn)題和不良副作用也需要引起重視[19,20]。因此，研究人員通過(guò)篩選天然藥物的藥效以期尋找有效且副作用小的骨質(zhì)疏松治療方法。目前研究發(fā)現(xiàn)，天然抗氧化劑(如Cur、白藜蘆醇、山茶等)可以提供更安全有效的替代性治療策略[17]。但是Cur改善骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制尚未完全明確。因此，本研究旨在從氧化還原和信號(hào)通路方面探討Cur保護(hù)成骨細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制。我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，各濃度的Cur均可抑制H2O2介導(dǎo)的過(guò)度氧化并促進(jìn)應(yīng)激狀態(tài)下的成骨細(xì)胞增殖，說(shuō)明其安全且有效發(fā)揮藥理效應(yīng)的濃度范圍較廣。

細(xì)胞組織的抗氧化能力有賴(lài)于其內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)對(duì)ROS的清除，但在病理狀態(tài)下，細(xì)胞組織的清除能力減弱導(dǎo)致細(xì)胞的成分發(fā)生氧化損傷進(jìn)而引起功能障礙[21,22]。在成骨細(xì)胞氧化損傷模型中，T-AOC和SOD水平降低代表細(xì)胞的抗氧化能力減弱，而MDA水平升高則提示細(xì)胞的脂質(zhì)成分發(fā)生過(guò)度氧化。用梯度濃度的Cur干預(yù)后，氧化還原失衡有所改善。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明，Cur可能一方面通過(guò)自身的還原基團(tuán)直接中和ROS，另一方面通過(guò)上調(diào)內(nèi)源性抗氧化酶如SOD的活性間接清除ROS。氧化應(yīng)激還通過(guò)激活p38 MAPK引起組織和細(xì)胞損傷[22]，p38 MAPK的磷酸化水平代表其激活狀態(tài)。Western blotting結(jié)果顯示，不同濃度的Cur均可以抑制H2O2介導(dǎo)的p38 MAPK磷酸化，提示Cur對(duì)p38 MAPK激活的抑制作用可能參與其保護(hù)成骨細(xì)胞抗氧化損傷的機(jī)制。然而，由于不同類(lèi)型的內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)失衡導(dǎo)致產(chǎn)生的ROS種類(lèi)不同，因而對(duì)細(xì)胞存活、死亡和功能的影響存在差異，我們將在今后的研究中進(jìn)一步深入探究骨質(zhì)疏松癥的氧化還原調(diào)控機(jī)制。

本研究還發(fā)現(xiàn)，Cur可以改善H2O2對(duì)成骨細(xì)胞分化功能的抑制，表現(xiàn)為礦化鈣結(jié)節(jié)增多且ALP活性升高，這與Li等[12]的研究報(bào)道一致。Cur預(yù)處理后的成骨分化能力增強(qiáng)可能與細(xì)胞增殖及ALP活性升高有關(guān)。然而，10 μoml/L的Cur并未表現(xiàn)出顯著的促成骨分化作用，提示維持良好的細(xì)胞活性與增殖能力可能更有利于成骨細(xì)胞的分化功能。此外，ROS作為一種信號(hào)分子也發(fā)揮其生理學(xué)功能，過(guò)度抗氧化可能反而不利于細(xì)胞的正常功能[23]。10 μoml/L的Cur預(yù)處理雖然能很好地抑制脂質(zhì)過(guò)度氧化，但對(duì)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的保護(hù)作用不及低濃度Cur明顯，因此，當(dāng)Cur在動(dòng)物和人體水平應(yīng)用時(shí)應(yīng)掌握適當(dāng)?shù)膭┝?。Wnt信號(hào)通路已被證實(shí)在成骨分化過(guò)程中起正性調(diào)控作用[24]。過(guò)多的ROS可促進(jìn)Wnt/β-catenin通路中的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)變?yōu)槭蹻oxO調(diào)控，最終抑制成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化，從而形成骨質(zhì)疏松癥[25]。我們通過(guò)Western blotting進(jìn)一步探討了Cur保護(hù)成骨細(xì)胞分化功能的可能機(jī)制，發(fā)現(xiàn)Cur可以逆轉(zhuǎn)H2O2介導(dǎo)的Wnt5a和β-catenin表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明Cur可能通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)氧化應(yīng)激狀態(tài)下成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化。

綜上所述，本研究采用梯度濃度的Cur預(yù)處理大鼠成骨細(xì)胞，觀察其對(duì)氧化應(yīng)激導(dǎo)致成骨細(xì)胞功能障礙的改善作用，并初步闡明其作用機(jī)理。今后，尚需要對(duì)Cur等天然化合物進(jìn)行更深入的應(yīng)用基礎(chǔ)及臨床研究，才能為研發(fā)安全且有效的抗骨質(zhì)疏松治療策略提供理論依據(jù)。另外，Cur的用藥劑量、給藥方式、藥物代謝、藥效評(píng)價(jià)等也是值得探討的科學(xué)問(wèn)題。