高艷艷，郭鳳霞，郭少波，梁 燕，張 薇，劉 斌

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488

寬筋藤為防己科青牛膽屬植物中華青牛膽Tinosporaesinenisis(Lour.)Merr.的干燥藤莖，主要分布于廣東、廣西、云南等地，尤以兩廣分布廣，產(chǎn)量大，民間應(yīng)用歷史悠久[1]。《全國(guó)中草藥匯編》記載，寬筋藤味微苦、性涼，具有祛風(fēng)止痛，舒筋活絡(luò)的功效[2]。寬筋藤在藏藥中又名“勒哲”，是藏藥常用藥材，善祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)，療效顯著，《晶珠本草》中記載寬筋藤“治療隆，赤巴合并癥；培根病、風(fēng)濕病、隆熱病”[3]。臨床上，寬筋藤主要用于治療風(fēng)濕痹痛、腰肌勞損、跌打損傷等骨傷科疾病[4，5]，可見其具有較大的研究?jī)r(jià)值和開發(fā)潛力?，F(xiàn)代藥理研究表明，青牛膽屬植物具有抗炎、抗輻射、抗腫瘤、抗病毒、免疫抑制等多種藥理活性，但目前對(duì)該屬植物的化學(xué)成分研究主要集中在海南青牛膽以及心葉青牛膽兩個(gè)種上[5,6]。寬筋藤作為青牛膽屬植物中華青牛膽的藤莖，民間應(yīng)用歷史悠久，療效確切可靠。但目前對(duì)寬筋藤的開發(fā)利用度依然較低，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究還比較薄弱，且多集中在乙酸乙酯部位化學(xué)成分分離，藥理作用研究多集中在寬筋藤水煎液或提取物層面，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚未完全闡明。為進(jìn)一步豐富寬筋藤的化學(xué)成分，本實(shí)驗(yàn)采用多種色譜分離技術(shù)對(duì)寬筋藤的氯仿和正丁醇萃取部位進(jìn)行化學(xué)成分研究，并對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行了抑制脂多糖誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放NO活性的測(cè)定，以期為從寬筋藤中尋找和發(fā)現(xiàn)活性成分，對(duì)進(jìn)一步開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker Avance Ⅲ-500型超導(dǎo)核磁共振儀(美國(guó)Bruker公司)；VARIAN INOVA-600型超導(dǎo)核磁共振儀(美國(guó)Varian公司)；VG-ZAB-HS型質(zhì)譜儀(英國(guó)VG Instruments公司)；Bruker ESQUIRE-LC型質(zhì)譜儀(美國(guó)Bruker公司)；LTQ-Orbitrap XL質(zhì)譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；酶標(biāo)儀(德國(guó)BMG Labtech公司)。

柱色譜用硅膠(60～100目、200～300目，青島海洋化工廠)；硅膠G預(yù)制薄層板(20 cm × 20 cm，青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20(美國(guó)Pharmacia公司)；ODS色譜柱材料(50 μm，日本Yamaha Motor Company,YMC公司)；AB-8型大孔吸附樹脂(天津南開大學(xué)化工廠)；MCI-GEL CHP20P(日本三菱化學(xué)公司)。其他試劑均為分析純。

小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7(北京協(xié)和細(xì)胞資源中心)；地塞米松(大連美倫生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；PBS磷酸緩沖液(美國(guó)Gibco公司)；雙抗(10 000 U青霉素和鏈霉素混合液)(美國(guó)Gibco公司)；FBS胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；DMSO(阿拉丁公司)；甲基噻唑藍(lán)(美國(guó)Sigma公司)；脂多糖(大連美倫生物科技有限公司)；NO試劑盒(北京百瑞極生物科技有限公司)。

寬筋藤藥材購(gòu)自安國(guó)市萬聯(lián)中藥飲片有限公司，產(chǎn)地廣西，批號(hào)140101，經(jīng)鑒定為防己科青牛膽屬植物中華青牛膽Tinosporasinenisis(Lour)Merr.的干燥藤莖。

1.2 提取與分離

干燥寬筋藤藥材(10 kg)經(jīng)粉碎后加入70%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓回收溶劑得寬筋藤提取物1.3 kg。將總提取物加水分散，依次用氯仿、乙酸乙酯、水飽和的正丁醇萃取，萃取液減壓回收溶劑，分別得到氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位。

氯仿萃取部位經(jīng)硅膠柱色譜，二氯甲烷∶甲醇(20∶1→0∶1，V/V)梯度洗脫，得Fr.1～Fr.4四個(gè)流分。Fr.3通過硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷∶甲醇(150∶1→0∶1，V/V)洗脫，經(jīng)薄層檢識(shí)合并得Fr.3-1～Fr.3-4。Fr.3-1、Fr.3-3和Fr.3-4先后經(jīng)Sephadex LH-20(氯仿∶甲醇 = 1∶2)洗脫、甲醇重結(jié)晶，得到化合物1(3.6 mg)、化合物2(5.4 mg)和化合物3(4.3 mg)。Fr.4先后經(jīng)硅膠柱色譜(二氯甲烷∶甲醇，100∶1→0∶1，V/V)，Sephadex LH-20柱色譜(氯仿∶甲醇 = 1∶2)和制備薄層色譜(二氯甲烷∶甲醇 = 9∶1)分離純化，得到化合物4(4.2 mg)。

正丁醇萃取部位經(jīng)AB-8型大孔吸附樹脂，水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脫，得到Fr.1～Fr.5五個(gè)流分。Fr.2經(jīng)硅膠柱色譜(氯仿∶甲醇，15∶1→0∶1，V/V)洗脫，得到Fr.2-1～Fr.2-4。Fr.2-1經(jīng)硅膠柱色譜，氯仿∶甲醇(18∶1→0∶1，V/V)洗脫，得到Fr.2-1-1和Fr.2-1-2。Fr.2-1-1經(jīng)硅膠柱色譜，氯仿-甲醇(15∶1→0∶1，V/V)梯度洗脫，得到化合物5(21.5 mg)。Fr.2-1-2經(jīng)MCI柱色譜，水∶甲醇(9∶1→0∶1，V/V)梯度洗脫和硅膠柱色譜分離(氯仿∶甲醇∶水 = 15∶1∶0.05，V/V/V)，得到化合物6(4.1 mg)。Fr.2-2經(jīng)硅膠柱色譜，氯仿∶甲醇(15∶1→0∶1，V/V)洗脫，得到Fr.2-2-1～Fr.2-2-3。Fr.2-2-1經(jīng)Sephadex LH-20，甲醇洗脫，再經(jīng)硅膠柱色譜(氯仿∶甲醇∶水 = 15∶1∶0.05，V/V/V)分離，得到化合物7(3.2 mg)。Fr.2-2-3經(jīng)硅膠柱色譜，氯仿∶甲醇∶水(12∶1∶0.05，V/V/V)分離，得到化合物8(2.7 mg)。Fr.2-3經(jīng)硅膠柱色譜，氯仿∶甲醇(12∶1→0∶1，V/V)梯度洗脫，得到Fr.2-3-1和Fr.2-3-2。Fr.2-3-1經(jīng)Sephadex LH-20，甲醇洗脫，得到Fr.2-3-1-1～Fr.2-3-1-3。Fr.2-3-1-1和Fr.2-3-1-2分別過硅膠柱色譜，氯仿∶甲醇∶水(12∶1∶0.05，V/V/V)洗脫，得到化合物9(3.3 mg)和化合物10(5.3 mg)。Fr.2-3-1-3經(jīng)硅膠柱色譜分離，氯仿∶甲醇(30∶1→0∶1，V/V)、氯仿∶甲醇(20∶1→0∶1，V/V)、氯仿∶甲醇∶水(12∶1∶0.05，V/V/V)洗脫，得到化合物11(2.9 mg)。Fr.2-3-2經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，甲醇洗脫，再經(jīng)硅膠柱色譜，氯仿∶甲醇∶水(12∶1∶0.05，V/V/V)洗脫，得到化合物12(3.2 mg)。Fr.2-4過硅膠柱色譜，先后以氯仿∶甲醇∶水(20∶1∶0.05→0∶1∶0，V/V/V)、氯仿∶甲醇∶水(18∶1∶0.05→0∶1∶0，V/V/V)、氯仿∶甲醇∶水(9∶1∶0.05，V/V/V)洗脫，得到化合物13(15 mg)。

1.3 抗炎活性篩選

采用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7釋放一氧化氮(NO)炎癥細(xì)胞模型，通過Griess法測(cè)定NO的含量[7]，對(duì)寬筋藤中分離得到的化合物1～13進(jìn)行了體外抗炎活性初步篩選。

1.3.1 RAW 264.7細(xì)胞的培養(yǎng)

RAW 264.7細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。待RAW 264.7細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，按3×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度，每孔100 μL，接種于96孔板中于37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 不同化合物對(duì)NO釋放量的影響

實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組、模型組、陽性藥組和給藥組?？瞻讓?duì)照組加入完全培養(yǎng)基；模型組加入10 μg/L LPS溶液；陽性藥組加入20 μmol/L地塞米松和10 μg/L LPS混合液；藥物組加入10 μg/L LPS溶液和20 μmol/L各單體化合物的混合液，刺激細(xì)胞共孵育24 h。24 h后，每孔取50 μL上清液，加入至新的96孔培養(yǎng)板中，根據(jù)一氧化氮試劑盒說明書進(jìn)行操作。將96孔培養(yǎng)板置于搖床上搖晃10 min，在酶標(biāo)儀540 nm處讀取各孔OD值，計(jì)算化合物NO的抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

抑制率 =(OD模型-OD藥物)/

(OD模型-OD對(duì)照)× 100%

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色粉末(氯仿)；ESI-MS：m/z684.6[M+H]+，m/z706.6[M+Na]+，分子式C42H85O5N；1H NMR(600 MHz，C5D5N)δ：8.59(1H，d，J=8.9 Hz，NH)，6.72(2H，br s，3-OH，4-OH)，6.23(1H，br s，1-OH)，5.13(1H，m，H-2)，4.63(1H，br s，H-2′)，4.53(1H，dd，J=9.6，5.3 Hz，H-1a)，4.44(1H，dd，J=9.6，5.3 Hz，H-1b)，4.37(1H，br s，H-3)，4.29(1H，br s，H-4)，2.24(2H，m，H-3′)，2.04(1H，m，H-5a)，1.95(2H，m，H-5b，H-6a)，0.86(6H，t，H-18，H-24′)；13C NMR(150 MHz，C5D5N，)δ：61.8(C-1)，52.7(C-2)，76.5(C-3)，72.8(C-4)，35.5(C-5)，26.4(C-6)，175.0(C-1′)，72.2(C-2′)，33.9(C-3′)，25.6(C-4′)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻(xiàn)[8]對(duì)照，鑒定化合物1為2-(2′-羥基二十四碳酰氨基)十八碳-1,3,4-三醇。

化合物2白色結(jié)晶(吡啶)；ESI-MS：m/z753.5[M+Na]+，分子式C41H78O10；1H NMR(500 MHz，C5D5N)δ：5.67(1H，m，H-2)，4.69(1H，dd，J=11.9，4.2 Hz，H-3a)，4.53(1H，dd，J=11.9，4.2 Hz，H-3b)，4.37(1H，dd，J=10.8，3.2 Hz，H-1a)，4.16(1H，dd，J=10.8，5.3 Hz，H-1b)，4.14(1H，d，J=7.5 Hz，H-1′)，0.85(6H，t，J=6.8 Hz，CH3)；13C NMR(125 MHz，C5D5N)δ：63.3(C-1)，71.0(C-2)，68.1(C-3)，105.8(C-1′)，72.4(C-2′)，75.3(C-3′)，70.2(C-4′)，77.3(C-5′)，62.3(C-6′)，173.3(C-1′′)，173.2(C-1′′′)，34.5(C-2′′)，34.3(C-2′′′)，25.3(C-3′′，3′′′)，23.0～34.5(C-4′′～15′′，4′′′～15′′′)，14.3(C-16′′，16′′′)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻(xiàn)對(duì)照[9,10]，鑒定化合物2為1,2-di-O-palmitoyl-3-O-β-D-galactopyranosyl glycerol。

化合物3白色結(jié)晶(吡啶)；ESI-MS：m/z714.5[M+H]+，m/z736.5[M+Na]+(分子式C40H75NO9，分子量713)；1H NMR(500 MHz，C5D5N)δ：5.49(2H，m，H-8，9)，4.23(1H，m，H-1′′)，0.87(6H，t，-CH3)；13C NMR(125 MHz，C5D5N)δ：70.1(C-1)，54.7(C-2)，72.4(C-3)，132.0(C-4)，132.1(C-5)，33.0(C-6)，32.1/27.6(C-7)，130.0/129.4(C-8)，131.1/130.6(C-9)，32.9/27.4(C-10)，175.6(C-1′)，72.5(C-2′)，14.3(CH3)，105.6(C-1′′)，75.1(C-2′′)，78.5(C-3′′)，71.6(C-4′′)，78.4(C-5′′)，62.7(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻(xiàn)對(duì)照[11,12]，鑒定化合物3為由soyacerebroside Ⅰ和soyacerebroside Ⅱ組成的一組順反異構(gòu)混合物，通過分析13C NMR放大譜的豐度，表明soyacerebroside I(反式異構(gòu)體)與soyacerebroside II(順式異構(gòu)體)二者比例約為5∶4。

化合物4白色無定性粉末(甲醇)；ESI-MS：m/z419.2[M+Na]+，m/z815.4[2M+Na]+，分子式C21H32O7；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：5.61(1H，s，H-3)，2.90(1H，m，H-6)，4.26(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′)，2.54(1H，d，J=6.7 Hz，H-1)，2.00(1H，m，H-9)，1.94(3H，s，H-14)，1.93(1H，m，H-5)，1.69(1H，m，H-7)，1.18(1H，m，H-8)，1.06(3H，s，H-15)，0.97(3H，s，H-12)，0.86(3H，s，H-13)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：56.7(C-1)，202.9(C-2)，120.8(C-3)，170.7(C-4)，54.5(C-5)，53.1(C-6)，49.0(C-7)，20.6(C-8)，36.5(C-9)，55.9(C-10)，79.6(C-11)，20.4(C-12)，22.2(C-13)，23.7(C-14)，23.9(C-15)，97.1(C-1′)，70.6(C-2′)，77.5(C-3′)，74.0(C-4′)，76.9(C-5′)，61.5(C-6′)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻(xiàn)對(duì)照[13]，鑒定化合物4為tinocordiside。

化合物5白色針狀結(jié)晶(甲醇)；ESI-MS：m/z395.1[M+Na]+，m/z767.3[2M+Na]+，分子式C17H24O9；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.77(2H，s，H-2，H-6)，6.57(1H，d，J=15.9 Hz，H-7)，6.35(1H，dt，J=15.8，5.6 Hz，H-8)，4.89(1H，d，J=7.6 Hz，H-1′)，4.25(2H，d，J=5.6 Hz，H-9)，3.88(6H，s，3，5-OCH3)，3.81(1H，dd，J=12.0，2.2 Hz，H-6′b)，3.69(1H，dd，J=12.0，5.2 Hz，H-6′a)，3.50(1H，m，H-2′)，3.44(2H，m，H-3′，H-4′)，3.24(1H，m，H-5′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：135.2(C-1)，105.5(C-2，6)，154.3(C-3，5)，135.9(C-4)，130.0(C-7)，131.3(C-8)，63.6(C-9)，57.0(3，5-OCH3)，105.3(C-1′)，75.7(C-2′)，78.4(C-3′)，71.3(C-4′)，77.8(C-5′)，62.6(C-6′)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻(xiàn)對(duì)照[14,15]，鑒定化合物5為反式丁香苷。

化合物6白色結(jié)晶(甲醇)；ESI-MS：m/z317.1[M+H]+，分子式C14H20O8。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：6.82(1H，d，J=8.8 Hz，H-5)，6.70(1H，d，J=2.7 Hz，H-2)，6.55(1H，dd，J=2.7，8.7 Hz，H-6)，4.71(1H，d，J=7.7 Hz，H-1′)，4.04(1H，dd，J=12.0，2.2 Hz，H-6′a)，3.92(1H，dd，J=12.0，5.2 Hz，H-6′b)，3.71(3H，s，3-OCH3)，3.68(3H，s，4-OCH3)，3.17～3.44(4H，m，H-2′～H-5′)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：143.9(C-1)，102.4(C-2)，152.0(C-3)，149.4(C-4)，107.2(C-5)，112.6(C-6)，55.4(3-OCH3)，56.1(4-OCH3)，101.5(C-1′)，73.4(C-2′)，76.8(C-3′)，70.0(C-4′)，77.2(C-5′)，60.9(C-6′)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻(xiàn)對(duì)照[16]，鑒定化合物6為3,4-二甲氧基苯基-β-D-葡萄糖苷。

化合物7白色無定型粉末(甲醇)；ESI-MS：m/z527.2[M+Na]+，m/z543.1[M+K]+，分子式C22H32O13；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.74(2H，s，H-3，H-5)，6.53(1H，d，J=15.9 Hz，H-7)，6.31(1H，dt，J=15.9，5.6 Hz，H-8)，5.30(1H，d，J=2.7 Hz，H-1′′)，4.89(1H，d，J=7.7 Hz，H-1′)，4.21(2H，d，J=5.6 Hz，H-9)，4.11(1H，d，J=9.3 Hz，H-4′′b)，4.00(1H，d，J=2.7 Hz，H-2′′)，3.84(6H，s，3，5-OCH3)，3.78(1H，m，H-6′b)，3.77(1H，m，H-4′′a)，3.65(1H，dd，J=12.1，5.0 Hz，H-6′a)，3.60(2H，s，H-5′′)，3.59(1H，dd，J=8.9，7.7 Hz，H-2′)，3.51(1H，dd，J=8.9，8.8 Hz，H-3′)，3.44(1H，dd，J=8.8，9.5 Hz，H-4′)，3.22(1H，m，H-5′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：135.3(C-1)，154.3(C-2，6)，105.4(C-3，5)，135.8(C-4)，131.3(C-7)，130.1(C-8)，63.6(C-9)，57.0(3，5-OCH3)，105.1(C-1′)，75.4(C-2′)，85.2(C-3′)，69.8(C-4′)，78.1(C-5′)，62.5(C-6′)，111.4(C-1′′)，77.9(C-2′′)，80.6(C-3′′)，75.0(C-4′′)，65.2(C-5′′)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻(xiàn)對(duì)照[13,17]，鑒定化合物7為tinosinen。

化合物8白色無定型粉末(甲醇)；ESI-MS：m/z167.0[M-H]-，m/z123.0[M-COOH]-，分子式C8H8O4；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.38(1H，q，J=15.7 Hz，H-7)，6.67(1H，d，J=3.3 Hz，H-3)，6.41(1H，d，J=3.3 Hz，H-4)，6.23(1H，q，J=15.7 Hz，H-6)，4.53(2H，s，H-1′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：151.9(C-2)，116.7(C-3)，111.0(C-4)，158.9(C-5)，132.5(C-6)，117.0(C-7)，170.7(C-8)，57.5(C-1′)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻(xiàn)對(duì)照[18]，鑒定化合物8為5-羥甲基-2-呋喃丙烯酸，是合成5-取代-2-羥甲基(羧基)呋喃的中間產(chǎn)物。

化合物9白色無定型粉末(甲醇)；ESI-MS：m/z601.2[M-H+HCOOH]-，分子式C26H36O13；1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ：7.64(1H，br s，H-16)，7.52(1H，m，H-15)，6.54(1H，d，J=1.0 Hz，H-14)，5.79(1H，dd，J=12.6，3.4 Hz，H-12)，4.93(1H，dd，J=11.0，2.4 Hz，H-1)，4.39(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′)，4.08(1H，br d，J=2.4 Hz，H-2)，3.94(1H，br s，H-4)，3.86(1H，dd，J=11.7，1.6 Hz，H-6′b)，3.66(1H，dd，J=11.7，7.5 Hz，H-6′a)，3.35(1H，dd，J=8.3，5.6 Hz，H-3′)，3.28(1H，dd，J=5.6，8.6 Hz，H-4′)，3.24(1H，m，H-5′)，3.21(1H，dd，J=8.3，7.8 Hz，H-2′)，2.62(1H，dd，J=14.4，12.6 Hz，H-11b)，2.50(1H，dd，J=11.0，11.1 Hz，H-10)，2.33(1H，m，H-3b)，2.33(1H，m，H-7b)，2.01(3H，s，COCH3)，1.95(1H，dd，J=14.4，3.4 Hz，H-11a)，1.77(1H，m，H-5)，1.77(1H，m，H-6b)，1.66(1H，m，H-3a)，1.66(1H，m，H-7a)，1.60(1H，s，H-6a)，1.07(3H，s，H-20)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：77.2(C-1)，69.1(C-2)，32.6(C-3)，76.7(C-4)，39.5(C-5)，26.5(C-6)，30.2(C-7)，76.6(C-8)，40.5(C-9)，35.2(C-10)，37.0(C-11)，73.1(C-12)，126.7(C-13)，109.6(C-14)，145.1(C-15)，141.3(C-16)，174.8(C-17)，15.5(C-20)，172.0(COCH3)，21.8(COCH3)，100.9(C-1′)，74.9(C-2′)，78.0(C-3′)，71.6(C-4′)，77.8(C-5′)，62.8(C-6′)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻(xiàn)對(duì)照[13]，鑒定化合物9為tinosineside A。

化合物10白色無定型粉末(甲醇)；ESI-MS：m/z561.2[M+Na]+，分子式C27H38O11；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.99(1H，d，J=8.2 Hz，H-5′)，6.79(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.66(1H，d，J=1.5 Hz，H-2′)，6.63(1H，d，J=1.5 Hz，H-2)，6.62(1H，dd，J=8.2，1.5 Hz，H-6′)，6.62(1H，dd，J=8.0，1.5 Hz，H-6)，4.82(1H，d，J=7.3 Hz，H-1′′)，3.86(1H，dd，J=12.0，5.2 Hz，H-6′′b)，3.78(3H，s，4-OCH3)，3.73(3H，s，3′-OCH3)，3.70(3H，s，3-OCH3)，3.67(1H，dd，J=12.0，5.2 Hz，H-6′′a)，3.58(2H，m，H-9)，3.58(2H，m，H-9′)，3.48(1H，dd，J=6.6，7.3 Hz，H-2′′)，3.46(1H，d，J=6.6 Hz，H-3′′)，3.39(1H，m，H-4′′)，3.39(1H，m，H-5′′)，2.68(1H，dd，J=13.7，8.9 Hz，H-7b)，2.68(1H，dd，J=13.7，8.9 Hz，H-7′b)，2.56(1H，dd，J=13.7，8.9 Hz，H-7a)，2.56(1H，dd，J=13.7，8.9 Hz，H-7′a)，1.90(1H，m，H-8)，1.90(1H，m，H-8′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：135.4(C-1)，113.9(C-2)，150.4(C-3)，148.7(C-4)，112.9(C-5)，122.7(C-6)，36.2(C-7)，44.2(C-8)，62.2(C-9)，137.5(C-1′)，114.4(C-2′)，150.6(C-3′)，146.2(C-4′)，117.8(C-5′)，122.9(C-6′)，36.2(C-7′)，44.2(C-8′)，62.3(C-9′)，56.5(3-OCH3)，56.7(4-OCH3)，56.7(3′-OCH3)，103.2(C-1′′)，75.1(C-2′′)，77.9(C-3′′)，71.5(C-4′′)，78.3(C-5′′)，62.7(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻(xiàn)對(duì)照[13,17]，鑒定化合物10為tinosposide A。

化合物11白色無定型粉末(甲醇)；ESI-MS：m/z547.2[M+Na]+，分子式C26H36O11；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.67(1H，d，J=3.6 Hz，H-5′)，6.65(1H，d，J=3.6 Hz，H-5)，6.64(1H，d，J=1.3 Hz，H-2′)，6.62(1H，d，J=1.1 Hz，H-2)，6.56(1H，m，H-6)，6.56(1H，m，H-6′)，4.19(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′′)，3.87(1H，m，H-6′′b)，3.86(1H，m，H-9′b)，3.75(6H，s，3-OCH3，3′-OCH3)，3.67(1H，m，H-6′′a)，3.67(1H，m，H-9b)，3.56(1H，m，H-9a)，3.56(1H，m，H-9′a)，3.35(1H，m，H-4′′)，3.35(1H，m，H-5′′)，3.30(1H，m，H-3′′)，3.21(1H，m，H-2′′)，2.65(2H，m，H-7′)，2.56(2H，m，H-7)，2.06(1H，m，H-8′)，2.04(1H，m，H-8)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：134.0(C-1)，113.4(C-2)，148.8(C-3)，145.4(C-4)，115.7(C-5)，122.8(C-6)，35.5(C-7)，44.0(C-8)，62.8(C-9)，133.9(C-1′)，113.5(C-2′)，148.8(C-3′)，145.4(C-4′)，115.7(C-5′)，122.7(C-6′)，35.5(C-7′)，41.6(C-8′)，70.4(C-9′)，56.3(3-OCH3)，56.2(3′-OCH3)，104.6(C-1′′)，75.2(C-2′′)，78.0(C-3′′)，71.7(C-4′′)，78.2(C-5′′)，62.8(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻(xiàn)對(duì)照[19]，鑒定化合物11為開環(huán)異落葉松脂素-9-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物12白色無定型粉末(甲醇)；ESI-MS：m/z545.2[M+Na]+，分子式C26H34O11；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.74(1H，dd，J=8.0，1.7 Hz，H-6)，6.69(1H，d，J=1.7 Hz，H-2)，6.65(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.64(1H，s，H-5′)，6.18(1H，s，H-2′)，4.04(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′′)，3.85～3.64(10H，m，H-9，9′，2′′，3′′，4′′，5′′，6′′)，3.81(3H，s，3-OCH3)，3.78(3H，s，3′-OCH3)，3.15(1H，m，H-7′a)，2.87(1H，m，H-7′b)，2.75(1H，m，H-7)，1.96(2H，m，H-8，8′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：138.7(C-1)，114.0(C-2)，149.0(C-3)，145.3(C-4)，116.0(C-5)，123.5(C-6)，48.6(C-7)，45.3(C-8)，70.7(C-9)，129.3(C-1′)，112.3(C-2′)，147.3(C-3′)，146.0(C-4′)，117.4(C-5′)，133.7(C-6′)，33.7(C-7′)，41.2(C-8′)，65.5(C-9′)，56.5(3-OCH3)，56.4(3′-OCH3)，103.8(C-1)，75.0(C-2′′)，78.2(C-3′′)，71.4(C-4′′)，77.9(C-5′′)，62.5(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻(xiàn)對(duì)照[20]，鑒定化合物12為異落葉松脂素-9-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物13白色針狀結(jié)晶(甲醇)；ESI-MS：m/z128.0[M-H]-，分子式C5H7NO3；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：4.25(1H，dd，J=9.1，4.6 Hz，H-2)，2.49(1H，m，H-3a)，2.33(2H，m，H-4)，2.16(1H，m，H-3b)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：57.0(C-2)，30.4(C-3)，26.1(C-4)，175.8(C-5)，181.1(C-6)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻(xiàn)對(duì)照[21]，鑒定化合物13為L(zhǎng)-焦谷氨酸。

化合物1～13結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物1～13的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2.2 抗炎活性結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞炎癥篩選模型，以地塞米松為陽性對(duì)照，對(duì)寬筋藤中分離得到13個(gè)化合物(化合物1～13)進(jìn)行了抗炎活性篩選(見表1)。結(jié)果顯示，當(dāng)濃度為20 μmol/L，化合物2、3、4具有一定的NO生成抑制作用。

表1 化合物1～13的抗炎活性

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用多種分離技術(shù)，從寬筋藤氯仿部位和正丁醇部位共分離鑒定了13個(gè)化合物，包括3個(gè)腦苷脂類化合物(1、3)、5個(gè)苯丙素類化合物(5、7、10、11、12)、2個(gè)萜類化合物(4、9)、1個(gè)氨基酸類化合物(13)和3個(gè)其他類化合物(2、6、8)。其中，化合物8作為天然產(chǎn)物首次被報(bào)道，化合物1、2、3、6、11為首次從防己科植物中分離得到，化合物13為首次從寬筋藤中分離得到。有研究報(bào)道化合物4對(duì)人口腔表皮樣癌KB細(xì)胞、子宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞表現(xiàn)出一定的抑制活性；化合物3可通過減少M(fèi)CP-1表達(dá)、抑制單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)滑膜細(xì)胞而達(dá)到減輕滑膜炎癥、預(yù)防關(guān)節(jié)損傷的作用[22,23]。本文在化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上，對(duì)分離得到的13個(gè)化合物以LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞為體外炎癥模型，通過抑制NO生成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)化合物的抗炎活性，結(jié)果顯示化合物2、3、4具有一定的抗炎活性。本研究不僅豐富了寬筋藤的化學(xué)結(jié)構(gòu)類型和化學(xué)成分庫，也為進(jìn)一步闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、促進(jìn)寬筋藤的資源開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。