薩仁高娃，蘇龍嘎，才仁拉毛，齊和日瑪

1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)民族醫(yī)藥創(chuàng)新中心；2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 010110

玫瑰(RosarugosaThunb.)，多年生落葉灌木，屬于薔薇科薔薇屬植物。野生玫瑰分布于東亞溫帶地區(qū)，原產(chǎn)于我國(guó)北部，朝鮮，日本及堪察加半島和鄂霍次克海亞北極區(qū)地帶[1]。玫瑰花為玫瑰的干燥花蕾，其味甘、微苦、性溫、有疏肝理氣、和血調(diào)經(jīng)的功能，可用于治療肝胃氣痛、食少嘔惡、月經(jīng)不調(diào)、帶下、跌撲傷痛、風(fēng)濕痹痛[2-5]等。玫瑰花作為藥食同源植物，在我國(guó)各地均有栽培種植，主要產(chǎn)區(qū)在山東平陰縣、甘肅苦水鎮(zhèn)、新疆和田地區(qū)、陜西渭南市、江蘇銅山縣、北京妙峰山等[6]。

玫瑰花的主要化學(xué)成分為酚類化合物[7]、揮發(fā)油[8]、多糖[9]、黃酮[10,11]和鞣質(zhì)[12]等，其中，主要研究集中在玫瑰花瓣中酚類化合物及其抗氧化活性[13-15]的研究，而對(duì)其他成分的藥理作用和生物活性的研究甚少[16]。

可水解鞣質(zhì)化合物是一類由酚酸及其衍生物與葡萄糖或多元醇通過苷鍵或酯鍵而形成的化合物。其藥理作用包括抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抑菌、降血糖、抗過敏、抗脂質(zhì)過氧化等多種生物活性[17,18]。前期研究中報(bào)道新疆和田玫瑰中發(fā)現(xiàn)了包括新嗩吶草素I的幾種具有糖苷酶抑制作用的可水解鞣質(zhì)化合物，其總含量為干燥玫瑰花瓣中約占3%～5%[19]。Okuda等[20]首次從日本野生玫瑰中分離出新嗩吶草素I。據(jù)報(bào)道，新嗩吶草素I具有抗痤瘡和抗炎活性[21]、保肝和抗氧化作用[22]、抗菌作用[23]。

本研究從內(nèi)蒙古阿爾山區(qū)生產(chǎn)的玫瑰花中分離新嗩吶草素I，鑒定其結(jié)構(gòu)，對(duì)不同產(chǎn)地玫瑰中新嗩吶草素I的含量進(jìn)行測(cè)定，考察了其對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用和抗氧化活性，為篩選降低餐后血糖的玫瑰花保健品的開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿爾山玫瑰花(Q/ATY006-2012)、長(zhǎng)白山玫瑰花(Q/JMY00015)、北京玫瑰花(Q/YXS HT001)、新疆于田玫瑰花(Q/HSM000 IS-2014)、新疆和田玫瑰花(GB/T19598)、甘肅苦水玫瑰花(Q/SGT0005S)、山東平陰玫瑰花(GB/T19696)、湖南南山玫瑰花(Q/YSNJ0001S)、云南昆明重瓣玫瑰花(Q/KXY0002S)、云南金邊玫瑰(Q/CYC00035)、法蘭西玫瑰(Q/CYC00035)均購(gòu)自內(nèi)蒙古天盛蒙中醫(yī)藥有限公司。

α-葡萄糖苷酶(美國(guó)Sigma，批號(hào)G5003-100UN)；阿卡波糖(北京拜爾藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H19990205)；DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，美國(guó)Sigma)。

1.2 儀器

高效液相色譜儀(Shimadzu LC-20303 3D)；半制備高效液相色譜儀(Waters 2487)；AVANCE NEO600 MHz核磁共振儀(Bruker Biospin AG)；超高效液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters XEVO G2-XS Q-Tof)；KQ-500DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TELSTAR Cryodos 凍干機(jī)(西班牙泰事達(dá)公司)；Fliter Max F5酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices)；NUAIRE培養(yǎng)箱(美國(guó)NUAIRE)。

1.3 提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定

1.3.1 提取與分離

稱取玫瑰花粉末1.0 kg，加入50%乙醇1 L，混勻，浸泡24 h，過濾，反復(fù)提取3次，合并濾液，減壓濃縮至約200 mL。再用等量乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯可溶部分，濃縮，冷凍干燥，得玫瑰花多酚提取物129.0 g。取玫瑰花多酚提取物10.0 g，進(jìn)行Diaion HP-20(4.6 cm×45.7 cm)柱色譜分離，依次用水、50%乙醇、乙醇、丙酮洗脫，得到4個(gè)洗脫部分，濃縮，凍干。經(jīng)高效液相色譜分析，選取50%乙醇洗脫部分，用水溶解采用Sephadex LH-20(4.6 cm × 45.7 cm)柱，以系統(tǒng)梯度水-乙醇不同比率(100∶1→0∶1)洗脫，對(duì)55%乙醇洗脫部分進(jìn)行3～4次分離，高效液相色譜分析，得到富含多酚的乙醇洗脫液，合并，濃縮，再用半制備液相色譜柱進(jìn)行分離純化，得到化合物1(47.9 mg)。半制備高效液相色譜條件：色譜柱：Waters T01741S 06(7.8 mm × 300 mm)；進(jìn)樣量：1 mL；流速：3.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流動(dòng)相：純水(A)-乙腈(B)，采用二元梯度洗脫(0～5 min，100%→90% A；5～5.10 min，90%→77.5% A；5.10～12 min，77.5% A；12～12.10 min，77.5%→0% A；12.10～17 min，0% A；17～17.10 min，0%→90% A；17.10～20 min，90% A)。

1.3.2 結(jié)構(gòu)鑒定

采用核磁共振儀(NMR)和質(zhì)譜(Tof-Mass)解析，進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。質(zhì)譜條件：毛細(xì)管電壓：3.0 kV(正離子)/2.5 kV(負(fù)離子)；取樣電壓：80 V；源抵消電壓：80 V；離子源溫度：130 ℃；霧化溫度：450 ℃；錐孔氣：100 L/h；脫溶氣：800 L/h；數(shù)據(jù)采集模式：MSEContinuum；質(zhì)量范圍：100～1 200 Da。

1.4 新嗩吶草素I的含量測(cè)定

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-4(4.6 mm×150 mm，5 μm)；柱溫：40 ℃，進(jìn)樣量：20 μL，流速：1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流動(dòng)相：純水加0.1%甲酸(A)-乙腈加0.1%甲酸(B)，采用二元梯度洗脫(0～4 min，100%A；4～10 min，100%→85%A；10～18 min，85%→80%A；18～22 min，80%→70%A；22～28 min，70%→50%A；28～30 min，50%→0%A；30～32 min，0%→100%A)。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取“1.3.1”項(xiàng)下方法分離純化的新嗩吶草素I 25.0 mg，溶于50%乙醇定容于25 mL，用50%乙醇稀釋至五個(gè)不同濃度(20.0、40.0、50.0、60.0、80.0 μg/mL)，0.45 μm濾頭過濾，按“1.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 玫瑰花中新嗩吶草素I含量的測(cè)定

分別取11個(gè)不同產(chǎn)地的玫瑰花，把花柄、花托、花萼、雌雄蕊等清理干凈后，花瓣粉碎，過100目篩子，備用。取玫瑰花粉末200.0 mg，加40 mL 50%乙醇溶解，超聲提取30 min，離心20 min(3 500 r/min，室溫)，取上清液，加50%乙醇定至50 mL，0.45 μm濾頭過濾，按“1.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.5 玫瑰花的體外活性評(píng)價(jià)

1.5.1 樣品制備

稱取上述玫瑰花粉末2.0g，加200 mL 50%乙醇溶解，按“1.4.3”項(xiàng)下方法提取2次，上清液合并，濃縮，冷凍干燥，得玫瑰花提取物。

1.5.2 抑制α-葡萄糖苷酶活性的測(cè)定

采用pNPG法測(cè)定11種玫瑰花提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用[24-26]。分別準(zhǔn)確稱取玫瑰花提取物0.10、0.15、0.20、0.25、1.25 mg，用50%乙醇溶液溶解分別定容到10 ml，得到濃度為10、15、20、25、125 μg/mL的樣品溶液。96孔培養(yǎng)皿里加12 mm pNPG培養(yǎng)基80 μL，分別加10 μL上述5個(gè)不同濃度的樣品溶液(n= 3)，再加α-葡萄糖苷酶溶液10 μL，在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，然后放進(jìn)37 ℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng)20 min，再次測(cè)定其吸光度。陽(yáng)性對(duì)照品為0.1 mg/mL阿卡波糖溶液，空白對(duì)照品為純水。根據(jù)抑制率公式計(jì)算樣品抑制率,從而推算其半數(shù)抑制濃度值(IC50)。

抑制率=[A空白-(A樣品-A樣品空白)]/A空白×100%

式中，A空白為空白對(duì)照溶液吸收度；A樣品為樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶作用后的吸收度數(shù)值；A樣品空白為樣品吸收度數(shù)值。

1.5.3 清除DPPH自由基活性的測(cè)定

稱取玫瑰花提取物10.0 mg，用50%乙醇溶解定容到10 mL，得到1.0 mg/mL樣品溶液，再用50%乙醇分別稀釋得到濃度為1.0、0.5、0.1、0.05、0.025 mg/mL的溶液。精密吸取樣品溶液20 μL，加1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，125 mmol/L)180 μL，混勻，在避光條件下，冰塊中靜置20 min，在517 nm下測(cè)定其吸光度。空白對(duì)照溶液為同樣體積的50%乙醇加125 mmol/L DPPH溶液。使用其吸光度計(jì)算DPPH的清除率，從而推算其IC50。

DPPH的清除率=[1-(A樣品-A樣品空白)/A空白]×100%

式中，A樣品為樣品對(duì)DPPH作用后的吸光度，A樣品空白為樣品吸光度，A空白為DPPH空白對(duì)照溶液吸光度。

2 結(jié)果

2.1 化合物的結(jié)構(gòu)解析和純度分析

化合物1黃色粉末；HR-ESI-MS：m/z787.081 3[M + H]+，分子式為C34H26O22。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：6.88(2H，s，HI-2′，6′a)，6.87(2H，s，HI-2′，6′b)，6.80(2H，s，HII-2′,6′a)，6.75(2H，s，HII-2′,6′b)，6.38(1H，s，H-3′′a)，6.36(1H，s，H-3′′b)，6.23(1H，s，H-3′′′a)，6.20(1H，s，H-3′′′b)，5.68(1H，t，J= 9.8 Hz，H-3a)，5.53(1H，t，J= 9.8 Hz，H-3b)，5.37(1H，d，J= 1.5 Hz，H-1a)，5.16(1H，dd，J= 9.8，1.5 Hz，H-6a)，5.11(1H，dd，J= 9.8，1.5 Hz，H-6b)，5.04(1H，dd，J= 9.8，8.1 Hz，H-2a)，4.98(1H，dd，J= 9.8，8.3 Hz，H-2b)，4.94(1H，d，J= 1.5 Hz，H-1b)，4.90(1H，dd，J= 9.8，6.3 Hz，H-5a)，4.87(1H，dd，J= 9.8，6.3 Hz，H-5b)，4.54(1H，t，J= 9.8 Hz，H-4a)，4.33(1H，t，J= 9.8 Hz，H-4b)，3.82(1H，d，J= 9.8 Hz，H-6a)，3.75(1H，dd，J= 9.8，1.5 Hz，H-6b)；13C NMR(151 MHz，DMSO-d6)δ：95.7(C-1a)，90.4(C-1b)，71.3(C-2a)，70.7(C-2a)，73.3(C-3a)，72.9(C-3b)，70.5(C-4a)，70.3(C-4b)，72.2(C-5a)，72.2(C-5b)，66.2(C-6a)，62.8(C-6b)，119.3(CI-1′)，109.0(CI-2′,6′)，146.0(CI-3′,5′)，138.6(CI-4′)，166.4(CI-7′)，119.1(CII-1′)，109.0(CII-2′,6′)，144.8(CII-3′,5′)，138.5(CII-4′)，165.7(CII-7′)，115.0(C-1′′)，124.9(C-2′′)，107.2(C-3′′)，144.5(C-4′′,6′′)，136.2(C-5′′)，168.3(C-7′′)，115.3(C-1′′′)，124.5(C-2′′′)，106.7(C-3′′′)，143.4(C′′′-4′′′，6′′′)，136.2(C-5′′′)，167.9(C-7′′′)。將上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20,27]比較，鑒定化合物1為新嗩吶草素I(結(jié)構(gòu)式見圖1)?；衔?的純度以歸一化法推算，互變異構(gòu)體峰1的相對(duì)峰面積為26.64%；互變異構(gòu)體峰2的相對(duì)峰面積為68.84%，總相對(duì)峰面積為95.48%。

圖1 新嗩吶草素I結(jié)構(gòu)式

2.2 新嗩吶草素I含量測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別以新嗩吶草素I互相異構(gòu)體的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制回歸曲線，回歸方程分別為Y=51 915X-141 156(R2= 0.999 4)、Y= 63 016X-233 878(R2= 0.998 7)，在0.2～0.8 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(見圖2)。

圖2 新嗩吶草素I互變異構(gòu)體的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 玫瑰花中的新嗩吶草素I含量的測(cè)定

11個(gè)不同產(chǎn)地的玫瑰花分別經(jīng)過超聲處理后，采用高效液相色譜儀進(jìn)行分析。結(jié)果得出，玫瑰花提取物中新嗩吶草素I的分離度較好，色譜圖見圖3。11個(gè)不同產(chǎn)地玫瑰花提取物均含有新嗩吶草素I，其含量普遍較高(如表1所示)，1 g干燥玫瑰花中含有7.75～73.75 mg新嗩吶草素I，含量為0.8%～7.4%。其中云南重瓣玫瑰花中新嗩吶草素I含量最高，新疆于田玫瑰中含量最低。

圖3 新嗩吶草素I(a)和玫瑰花提取物(b)的液相色譜圖

表1 玫瑰花中新嗩吶草素I的含量測(cè)定結(jié)果

2.3 體外活性評(píng)價(jià)

2.3.1 抑制α-葡萄糖苷酶的活性評(píng)價(jià)

對(duì)11個(gè)不同產(chǎn)地玫瑰花提取物進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，11個(gè)不同產(chǎn)地玫瑰花提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶均顯示較強(qiáng)的抑制活性，其中甘肅苦水玫瑰的IC50為14.73 μg/mL，而新疆和田玫瑰對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用最弱，IC50為40.96 μg/mL。陽(yáng)性藥阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性IC50為38.00 μg/mL，而新嗩吶草素I對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性IC50為10.00 μg/mL，對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性比陽(yáng)性藥阿卡波糖高3.8倍。

2.3.2 抗氧化活性評(píng)價(jià)

玫瑰花提取物的抗氧化活性評(píng)價(jià)結(jié)果如表2所示，不同產(chǎn)地玫瑰花提取物均有抗氧化活性，其中北京妙峰山玫瑰的抗氧化作用最強(qiáng)，其IC50為102.1 μg/mL，而新疆和田玫瑰抗氧化作用最弱，其IC50為379.9 μg/mL。

表2 玫瑰花的抑制α-葡萄糖苷酶活性和DPPH自由基清除能力評(píng)價(jià)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

本文采用葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)柱層析和半制備高效液相色譜法，從阿爾山玫瑰提取物中分離制備了一種可水解鞣質(zhì)類化合物-新嗩吶草素I，是葡萄糖的2、3位上的沒食子?；?、5位上的HHDP(hexahydroxydiphenyl)基組成的鞣花鞣質(zhì)。該化合物葡萄糖的端基為游離羥基，在液相色譜儀分析，280 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)到兩個(gè)峰。以pNPG為底物的酶抑制劑評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)新嗩吶草素I相對(duì)于阿卡波糖(IC50為38.00 μg/mL)有較強(qiáng)的抑制作用，其IC50為10.0 μg/mL。而DPPH自由基清除能力評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)顯示，新嗩吶草素具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其清除DPPH自由基的半數(shù)清除率IC50為8.1μg/mL。

玫瑰花中富含大量可水解鞣質(zhì)類化合物，主要含有新嗩吶素I、新嗩吶素II、玫瑰素A、玫瑰素B、玫瑰素D、木麻黃鞣亭、木麻黃素、異木麻黃素等化合物[7,12]，其中新嗩吶草素I的含量為最高[7,12]。這些可水解鞣質(zhì)類在酸、堿、酶的作用下，水解為小分子酚酸類化合物和糖或多元醇。本研究中，對(duì)11個(gè)不同產(chǎn)地玫瑰花進(jìn)行新嗩吶草素I的含量測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均含有新嗩吶草素I，并且含量為0.8%～7.4%，由此可見，新嗩吶草素I為玫瑰花中可水解類化合物中含量比較高的主要成分之一。體外活性實(shí)驗(yàn)中，不同產(chǎn)地玫瑰花提取物均對(duì)α-葡萄糖苷酶有抑制活性和清除DPPH自由基活性，并且除了新疆和田玫瑰，其他10個(gè)產(chǎn)地的玫瑰花對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性均高于陽(yáng)性藥阿卡波糖，表明玫瑰花藥材中存在具有α-葡萄糖苷酶抑制功能的化學(xué)成分，可作為玫瑰花的新功能開發(fā)潛力的有效成分。通過本研究可以證明，新嗩吶草素I是玫瑰花中抑制α-葡萄糖苷酶活性和抗氧化活性成分之一。不同產(chǎn)地玫瑰花提取物中新嗩吶草素I的含量越高，相應(yīng)提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性和清除DPPH自由基活性有增加的趨勢(shì)，但無顯著性差異，表明無量效關(guān)系，這可能是玫瑰花中具有其他新嗩吶草素I結(jié)構(gòu)類似而活性相近的鞣質(zhì)類化合物或酚酸類化合物的不同而引起的，故進(jìn)一步研究玫瑰花中其它酚類成分是有必要的。