徐笑天，姬凌波，段小群*，王宇暉*

1桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，桂林 541199；2中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州 450001

微生物的次生代謝產(chǎn)物是抗菌等多種生物活性成分的來源，具有重大的藥用價值，近年來也成為天然藥物化學(xué)研究的熱點[1]。昆蟲共生真菌是指那些全部或部分生活史在宿主昆蟲體內(nèi)度過、不引起宿主明顯感染癥狀的真菌。它們能分解有機(jī)成分為宿主提供營養(yǎng)，幫助宿主抵抗外來微生物侵襲，引起宿主的免疫反應(yīng)[2,3]。在長期進(jìn)化過程中，真菌發(fā)展出一系列方法適應(yīng)腸道環(huán)境，與宿主形成了穩(wěn)定的共生關(guān)系，它們對宿主的選擇和定殖有一定的特殊性。

九香蟲，俗稱“臭屁蟲”，即兜蝽科昆蟲瓜黑蝽，是藥典收載的一類用藥歷史悠久的昆蟲類中藥，在部分地區(qū)也作為一種美味食品?！侗静菥V目》記載九香蟲“主治膈脘滯氣，脾腎虧損，壯元陽”，可用于腎虛陽痿、腰膝酸軟、胃炎脹痛。研究表明，九香蟲的滋補作用可能與它富含的豐富的維生素、微量元素、磷脂、氨基酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及N-乙酰多巴胺類物質(zhì)有關(guān)[4,5]。此外，九香蟲提取物對金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌、甲型副傷寒桿菌及福氏痢疫桿菌皆有抗菌作用，在其血淋巴中還發(fā)現(xiàn)了新型抗菌肽[6]。這些抗菌活性物質(zhì)可能與九香蟲的胃炎治療相關(guān)。九香蟲的抗菌作用提示其內(nèi)生真菌也可能會產(chǎn)生抗菌活性的次生代謝產(chǎn)物。目前對九香蟲內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物的研究尚缺乏相關(guān)報道。本研究選取九香蟲為研究對象，從其腸道中分離得到一株曲霉菌，并采用大米固體培養(yǎng)基進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵，對其次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，并測試抗菌活性，以期得到抗菌活性良好的代謝產(chǎn)物，豐富昆蟲內(nèi)生菌的化學(xué)成分和生物活性研究。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)譜由Agilent 6520B Q-TOF質(zhì)譜儀測定(美國安捷倫儀器有限公司)；核磁數(shù)據(jù)由Bruker AVIII-500及AVIII-600核磁共振儀(布魯克儀器有限公司)測定(1H NMR：500 MHz和600 MHz；13C NMR：125 MHz和150 MHz)，以TMS作為內(nèi)標(biāo)；分析型HPLC為Waters 1525型(Symmetry-C18，150 mm×4.6 mm，5 μm，流速1.0 mL/min)、半制備型HPLC為Waters 1525型(Zorbax SB-C18，250 mm×9.4 mm，5 μm，流速4.0 mL/min，美國沃特世儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(瑞士帝肯儀器公司)；高壓滅菌鍋(上海申安儀器有限公司)；QYC-200型搖床(上海?，攦x器有限公司)；正相柱色譜硅膠(200～300目，青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20凝膠柱填料(瑞典Pharmacia公司)；MCI柱色譜填料(日本三菱公司)；所用試劑均為分析純(天津富宇精細(xì)化工有限公司)；青霉素(上海麥克林生化試劑有限公司)、硫酸鏈霉素(北京索萊寶科技有限公司)；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的分離

捕捉九香蟲活蟲后將蟲體消毒，取腸道組織，加入組織勻漿器中研碎。將組織液稀釋涂布于馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(PDA)上，由此分離得到該曲霉菌。在PDA平板上，該菌為棕黃色絨毛狀菌落，表面散布大量孢子，顯微鏡下可見頭狀分生孢子梗和圓形孢子(見圖1)，根據(jù)以上形態(tài)和顯微特征初步鑒定為曲霉屬真菌。其18S rDNA和ITS序列鑒定由上海生工有限公司完成，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增其18S rDNA和ITS序列后進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)其18S rDNA序列和ITS序列與Aspergillusflavipes(Genbank accession No.KT809365)100%相似，鑒定為曲霉菌Aspergillussp.。菌種保存于桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)實驗室(保存編號為Aspergillussp.AJXC5-7)。

圖1 Aspergillus sp.的形態(tài)(A)和顯微特征(B，10×40)

1.2.2 發(fā)酵、提取與分離

將曲霉菌接種在PDA平板上活化，活化的真菌用刀片切取適量接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)基中，在28 ℃和140 r/min培養(yǎng)5天后作為種子液。取500 mL錐形瓶20個，每瓶裝入80 g大米和120 mL蒸餾水，于115 ℃滅菌30 min作為固體發(fā)酵培養(yǎng)基。在超凈臺中，每瓶固體培養(yǎng)基加入10 mL種子液，在28 ℃條件下靜置避光培養(yǎng)30天。

固體發(fā)酵物用乙酸乙酯提取3次，減壓濃縮獲得浸膏(40.3 g)。浸膏以硅膠柱分段，分別用石油醚-乙酸乙酯洗脫(20∶1→1∶3)，合并后分為8段(A～H)。將E-H段合并上MCI柱，以甲醇-水(10%→100%)洗脫合并為6段(M1～M6)。M3段通過凝膠柱色譜和半制備液相(45%甲醇+0.1%甲酸)進(jìn)一步分離，得到化合物1(8.3 mg，純度98.8%，tR= 19.5 min)、2(12.5 mg，純度99.0%，tR= 28.8 min)、4(28.5 mg，純度95.7%，tR= 42.8 min)、5(20.4 mg，純度97.4%，tR= 30.7 min)和6(15.3 mg，純度91.4%，tR= 34.7 min)。M1段通過凝膠柱色譜重結(jié)晶得到化合物3(265.3 mg，純度97.9%)。

1.2.3 抗菌實驗

抗菌實驗所用病原細(xì)菌為金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 25923)，枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisATCC 6633)和大腸桿菌(EscherichiacoliATCC 25922)。所用細(xì)菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上37 ℃活化24 h，挑取菌落加入MH培養(yǎng)液(Mueller-Hinton Broth)中，震蕩培養(yǎng)6 h，稀釋菌液至1.0×104～1.0×106CFU/mL備用。待測樣品用二甲基亞砜(DMSO)溶解，用MH培養(yǎng)液稀釋成200.0、100.0、50.0、25.0、12.5 μg/mL的待測溶液?？瞻捉M加入200 μL MH培養(yǎng)液，陽性組加入100 μL陽性藥溶液和100 μL菌懸液，測試組加入100 μL待測樣品溶液和100 μL菌懸液，生長組加入100 μL MH培養(yǎng)液和100 μL菌懸液。37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，用酶標(biāo)儀測定530 nm下的OD值，每一組設(shè)置3個平行。MIC(最小抑菌濃度)值為菌液OD值下降一半的藥物濃度，利用GraphPad Prism 5軟件統(tǒng)計分析并計算MIC值和SD(標(biāo)準(zhǔn)差)值。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色固體；HR-ESI-MS：m/z257.078 7[M+Na]+(calcd for C13H14NaO4，257.078 4)，推測分子式為C13H14O4。紅外光譜3 444 cm-1和1 642 cm-1顯示該化合物有羥基和羰基。

圖2 化合物1～6的結(jié)構(gòu)

圖3 化合物1的關(guān)鍵HMBC信號

表1 化合物1的NMR數(shù)據(jù)(500 MHz和125 MHz，CD3OD)

化合物2白色固體；ESI-MS：m/z246.9[M-H]-，分子式為C14H16O4。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.31(1H，br t，H-9)，6.29(1H，br t，H-13)，6.27(1H，br t，H-11)，5.30(1H，s，H-5)，4.54(1H，m，H-2)，3.73(3H，s，H-15)，3.45(2H，s，H-7)，2.43(1H，dd，J=17.0，11.9 Hz，H-3a)，2.39(1H，dd，J=17.1，5.2 Hz，H-3b)，1.43(3H，d，J=6.4 Hz，H-14)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：77.6(C-2)，43.1(C-3)，196.2(C-4)，105.2(C-5)，179.3(C-6)，42.1(C-7)，139.1(C-8)，107.4(C-9)，162.5(C-10)，101.0(C-11)，159.8(C-12)，109.7(C-13)，20.4(C-14)，55.6(C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7,8]報道基本一致，故鑒定化合物2為citreovirenone。

化合物3白色固體；ESI-MS：m/z142.1[M+H]+，分子式為C6H6O4。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：9.05(1H，s，5-OH)，8.02(1H，s，H-6)，6.34(1H，s，H-3)，5.66(1H，t，J=0.6 Hz，OH-7)，4.29(2H，d，J=0.6 Hz，H-7)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：168.2(C-2)，109.9(C-3)，174.0(C-4)，145.8(C-5)，139.3(C-6)，59.5(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報道基本一致，故鑒定化合物3為曲酸。

化合物4黃色膠狀物；ESI-MS：m/z397.2[M+H]+，分子式為C18H17ClO8。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：10.93(1H，s，3′-OH)，6.82(1H，br s，H-3)，6.67(1H，br s，H-5)，6.56(1H，s，H-4′)，3.77(3H，s，H-7)，3.72(3H，s，H-9)，3.53(3H，s，H-9′)，2.32(3H，s，H-7′)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ：139.9(C-1)，123.2(C-2)，114.5(C-3)，151.1(C-4)，106.1(C-5)，151.0(C-6)，56.8(C-7)，166.7(C-8)，52.6(C-9)，159.9(C-1′)，105.3(C-2′)，154.1(C-3′)，108.5(C-4′)，144.2(C-5′)，117.6(C-6′)，21.1(C-7′)，170.4(C-8′)，52.4(C-9′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道基本一致，故鑒定化合物4為methyl chloroasterrate。

化合物5無色油狀物；ESI-MS：m/z357.3[M+H]+，分子式為C19H16O7。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.76(2H，d，J=8.7 Hz，H-13和H-17)，7.09(2H，s，H-7和H-11)，6.82(2H，d，J=8.7 Hz，H-14和H-16)，6.34(1H，s，H-5)，3.88(6H，s，H-18和H-19)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：171.9(C-1)，101.8(C-2)，165.0(C-3)，142.9(C-4)，109.0(C-5)，138.3(C-6)，109.2(C-7/C-11)，149.4(C-8/C-10)，125.6(C-9)，122.8(C-12)，130.3(C-13/C-17)，116.2(C-14/C-16)，157.9(C-15)，56.9(C-18/C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道基本一致，故鑒定化合物5為aspulvinone P。

化合物6無色油狀物；ESI-MS：m/z349.3[M+Na]+，分子式為C18H14O7。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.80(2H，d，J=8.6 Hz，H-13和H-17)，7.47(1H，s，H-7)，7.18(1H，dd，J=8.3，1.7 Hz，H-11)，6.81(3H，d，J=8.5 Hz，H-11、H-14和H-16)，6.36(1H，s，H-5)，3.90(3H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：172.7(C-1)，100.5(C-2)，167.4(C-3)，143.5(C-4)，108.1(C-5)，126.9(C-6)，114.4(C-7)，149.2(C-8)，148.8(C-9)，116.5(C-10)，125.9(C-11)，123.6(C-12)，129.9(C-13/C-17)，116.1(C-14/C-16)，157.4(C-15)，56.5(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道基本一致，故鑒定化合物6為aspulvinone Q。

2.2 抗菌活性測試

對分得的化合物1～6進(jìn)行了革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抗菌活性篩選，分別以青霉素和硫酸鏈霉素為陽性對照[14,15]，結(jié)果見表2?；衔?對3株細(xì)菌無明顯抗菌活性(MIC>100.0 μg/mL)。化合物3和4表現(xiàn)出一定的抑菌活性，MIC值在35.5到67.5 μg/mL之間。

表2 化合物1～6的最小抑菌濃度

3 結(jié)論

本研究利用硅膠、MCI、凝膠柱色譜及半制備液相等方法對九香蟲內(nèi)生曲霉菌的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，從中分離得到6個化合物，包括1個新化合物和5個已知化合物，均為聚酮類化合物，按照結(jié)構(gòu)類型可以進(jìn)一步細(xì)分為吡喃酮類、二苯醚類及丁內(nèi)酯類。化合物1和2為首次從曲霉菌中分離得到。二苯醚類化合物4表現(xiàn)出一定的抗菌活性，文獻(xiàn)也報道此類化合物有良好的抗菌活性，尤其是一些鹵素取代的作用更強(qiáng)[14]。因此可以對該菌浸膏其他部分的此類化合物開展分離純化，其中不乏具有活性突出的化合物值得探究。文獻(xiàn)報道曲酸(3)具有良好的抗氧化及抗褐變生物活性，可以開展相關(guān)的生物活性研究[16,17]。曲霉屬真菌被報道能合成多種結(jié)構(gòu)類型的生物活性物質(zhì)，但次生代謝產(chǎn)物為非必需物質(zhì)，產(chǎn)量相對較低，后期可以通過大規(guī)模發(fā)酵、改良培養(yǎng)基、誘導(dǎo)生物合成及基因組學(xué)改造等技術(shù)對曲霉屬真的菌次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行深入挖掘，以期獲得更多的良好活性代謝產(chǎn)物，為合理開發(fā)利用蟲生真菌資源提供參考。