李文娟 賈 航 薛 斌, 樊振川,

(1. 天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457;2. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457;3. 天津科技大學(xué)大健康生物技術(shù)國家國際科技合作基地,天津 300457)

鞭毛(又稱纖毛)是突起于大多數(shù)真核細(xì)胞表面,主要由纖毛膜包裹的軸絲組成。起初研究者認(rèn)為鞭毛僅具有運(yùn)動功能,但是越來越多的研究表明,鞭毛在信號傳導(dǎo)中也發(fā)揮著重要的作用[1]。鞭毛結(jié)構(gòu)異常或功能缺陷會導(dǎo)致一系列先天性疾病的發(fā)生,包括巴德-畢德氏綜合征(Bardet-Biedl syndrome,BBS)、阿耳斯特雷姆(氏)綜合癥(Alstrom syndrome)、Meckel-Gruber綜合癥和Joubert綜合癥等,這些與鞭毛有關(guān)的疾病統(tǒng)稱為“纖毛病”[2]。BBS是一種常染色體隱性遺傳病[3],能夠引發(fā)多種疾病,如視網(wǎng)膜變性[4]、肥胖[5]、多指(趾)癥[6]及腎功能障礙[7]等。

BBS主要是由于巴德-畢德氏綜合征復(fù)合物(BBSome)組裝缺陷或者功能缺失,導(dǎo)致鞭毛內(nèi)信號蛋白異常累積或缺失,最終引發(fā)相關(guān)的疾病[8]。BBSome不參與鞭毛組裝,但是其在鞭毛內(nèi)信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要的功能[9],因此闡明BBSome組裝及其信號傳導(dǎo)機(jī)理是攻克BBS疾病的前提。

BBS8也稱TTC8,是BBSome的組成成分,具有三角形四肽重復(fù)序列(Tetratricopeptide repeat,TPR)。Ansley等[10]首次在沙特阿拉伯和巴基斯坦的家族中出現(xiàn)BBS患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)突變的BBS8蛋白。孫琳等[11]研究發(fā)現(xiàn),萊茵衣藻BBS8蛋白參與鞭毛內(nèi)膜蛋白運(yùn)輸,但是其詳細(xì)的分子機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。為了深入研究BBS8蛋白功能,需制備一支特異性強(qiáng)的anti-BBS8多克隆抗體。萊茵衣藻是單細(xì)胞真核生物,由于其細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單、生長迅速,其鞭毛可以從細(xì)胞體分離下來等優(yōu)勢,常作為國內(nèi)外研究鞭毛結(jié)構(gòu)、組裝及功能的理想模式生物[12]。本研究首先在大腸桿菌中表達(dá)萊茵衣藻BBS8蛋白,然后利用純化后的BBS8蛋白免疫新西蘭白兔獲得抗血清,對抗血清進(jìn)行IgG亞型抗體富集和抗原抗體親和純化后,獲得高特異性的anti-BBS8多克隆抗體,該研究為萊茵衣藻BBS8蛋白功能的研究奠定了材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌株和質(zhì)粒大腸桿菌(Escherichia coli)XL1-blue和BL-21(DE3)菌株、萊茵衣藻(Chlamydomo-nas reinhardtii)野生型藻種CC-125、大腸桿菌表達(dá)載體pMal-c2x與pET-28a(+)均保存在本實(shí)驗(yàn)室;萊茵衣藻BBS8基因突變體(命名為bbs8)由清華大學(xué)潘俊敏老師饋贈,該突變體是通過電轉(zhuǎn)化的方法將APHVⅢ片段插入野生型藻種21gr基因組,插入位置在BBS8基因的第5個內(nèi)含子上,最終形成BBS8蛋白完全缺失突變體[11]。

試劑pfu DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和DNA Marker購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒小提試劑盒購自TIANGEN;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒與PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒購自Sangon Biotech;蛋白標(biāo)志物(Protein Marker,貨號26616)購自加拿大Fermentas公司;Protein A SepharoseTMCL-4B(貨號17-0780-01)、Ni SepharoseTM6 Fast Flow(貨號17-5318-01)、Dextrin SepharoseTMHigh Performance(貨號28-9817-80)和CNBr-activated Sepharose 4B(貨號17-0981-01)購自美國 GE Healthcare公司;紅外熒光素(Alexa Fluor 594)標(biāo)記的羊抗兔二抗(貨號A11012)購自美國Sigma公司提供;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗購自美國Jackson公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

原核表達(dá)載體pET-28a(+)-BBS8與pMal-c2x-BBS8的構(gòu)建BBS8的cDNA基因被送至上海生工生物工程有限公司合成,并且在5′和3′端分別添加EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。BBS8cDNA基因合成后,將BBS8cDNA克隆至大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a(+)和pMal-c2x,形成新的重組表達(dá)載體pET-28a(+)-BBS8和pMal-c2x-BBS8。

蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[13]中所述方法進(jìn)行。將重組表達(dá)載體pET-28a(+)-BBS8和pMal-c2x-BBS8轉(zhuǎn)入E.coliBL21細(xì)胞,在利用IPTG誘導(dǎo)12—16h。收集菌體,利用超高壓破碎儀對菌體超聲破碎,收集少量細(xì)菌破碎物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析,確定目標(biāo)蛋白表達(dá)于上清還是沉淀。在蛋白誘導(dǎo)表達(dá)過程中,所有培養(yǎng)基都需添加相應(yīng)抗生素。

蛋白純化超聲破碎菌體后,4℃及12000 r/min離心2min收集沉淀(重組蛋白6×His::BBS8表達(dá)于沉淀中),用添加有8 mol/L尿素的結(jié)合緩沖液溶解并與1mL Ni SepharoseTM6 Fast Flow填料混勻,室溫結(jié)合2h。經(jīng)漂洗后,收集洗脫后的蛋白并對其進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。MBP::BBS8表達(dá)于上清中,超聲破碎菌體后將上清液與1 mL Dextrin SepharoseTMHigh Performance填料混勻,4℃過夜結(jié)合。用結(jié)合緩沖液漂洗填料,后用洗脫緩沖液洗脫填料,收集重組蛋白并對其進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

動物免疫將純化合格的蛋白送至北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司進(jìn)行動物免疫。免疫用兔子是2.0 kg左右的新西蘭大白兔;免疫之前在耳靜脈取陰性血。初次免疫取400 μg抗原,再加入等體積弗氏完全佐劑并混勻,將混勻好的抗原進(jìn)行背部皮下注射,打8—10個點(diǎn)。初次免疫14d后,取200 μg抗原,進(jìn)行加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫14d后進(jìn)行第三次加強(qiáng)免疫。第三次免疫后,耳靜脈取血測定效價。若效價達(dá)到1∶51200,則頸動脈取血,離心收集抗血清;若效價低于1∶51200,則繼續(xù)加強(qiáng)免疫。

抗血清效價測定本研究采用間接ELISA法測定抗血清的效價[14],詳細(xì)實(shí)驗(yàn)過程如下。將包被抗原BBS8稀釋至10 μg/mL,并以100 μL/孔包被于酶標(biāo)板。用5%的脫脂牛奶對抗原室溫封閉1h,后用PBST清洗液洗板3次,然后加入抗血清室溫孵育1h,在孵育結(jié)束后,用PBST洗板4次,后加入酶標(biāo)二抗室溫孵育30min。最后加入TMB(3′,3′,5′,5′-四甲基聯(lián)苯胺)顯色液顯色,利用酶標(biāo)儀測定其在OD450處的吸光值?？寡逍r為最大OD值一半時所對應(yīng)的抗血清稀釋倍數(shù)。

IgG亞型抗體富集IgG亞型抗體富集參照參考文獻(xiàn)[15]所述方法進(jìn)行,其詳細(xì)實(shí)驗(yàn)過程如下。首先用結(jié)合緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.0)平衡Protein A純化株,然后將1 mL抗血清與Protein A純化株混勻,室溫結(jié)合1—2h后用結(jié)合緩沖液漂洗10次,最后用酸性洗脫液(0.1 mol/L 甘氨酸,pH 2.7)洗脫P(yáng)rotein A填料,收集洗脫下來的抗體加入中和液(1 mol/L Tris-HCl,pH 9.0)保存?zhèn)溆谩?/p>

抗原抗體親和純化抗原抗體親和純化實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[16]所述方法進(jìn)行,詳細(xì)實(shí)驗(yàn)過程如下。稱取0.2—0.4 g CNBr-activated Sepharose 4B干粉,加入2 mL 1 mmol/L HCl使其充分溶脹,溶脹大約0.5h后用pH 8.3的結(jié)合緩沖液(0.1 mol/L NaHCO3,0.5 mol/L NaCl)平衡。將MBP::BBS8蛋白溶于結(jié)合緩沖液中,與溶脹好的CNBr-activated Sepharose 4B于4℃結(jié)合過夜。用結(jié)合緩沖液漂洗3次,加入pH 8.0的0.1 mol/L Tris-HCl室溫封閉2—4h。最后用pH 8.5的100 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl和pH 3.5的50 mmol/L甘氨酸、1 mol/L NaCl交替洗脫8次以上。按照上文中IgG亞型抗體富集的方法洗脫抗體,保存?zhèn)溆谩?/p>

免疫印跡取20 μg野生型CC-125和bbs8突變體藻種的全細(xì)胞蛋白提取物進(jìn)行SDS-PAGE電泳,并將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,5%的脫脂奶粉室溫封閉2h。封閉結(jié)束后添加稀釋后的抗體室溫孵育1h,用TBST緩沖液(10 mmol/L Tris,pH 7.5,166 mmol/L NaCl,0.05% Tween-20)漂洗3次后,加入HRP標(biāo)記的二抗,室溫孵育1h,TBST緩沖液漂洗3次后,用ECL化學(xué)發(fā)光顯色液曝光。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)免疫熒光實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[16,17]所示的方法進(jìn)行,其詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方法如下。取對數(shù)生長期的野生型CC-125和bbs8突變體細(xì)胞并固定到蓋玻片上,用封閉液(5%BSA,10%山羊血清,0.3% TritonTMX-100)室溫封閉2h。封閉結(jié)束后加入稀釋后的抗體,室溫孵育4h,用50% PBS漂洗10次,然后加入紅外熒光素(Alexa Fluor 594)標(biāo)記的羊抗兔二抗,室溫孵育1h,50% PBS漂洗10次后封片,最后在熒光顯微鏡下拍照留用。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a(+)-BBS8的構(gòu)建

用EcoRΙ和HindⅢ酶切pET-28a(+)和BBS8cDNA并進(jìn)行純化回收,然后將兩個片段室溫連接1h后轉(zhuǎn)入E.coliXL1-blue細(xì)胞中,待長出轉(zhuǎn)化子后,隨機(jī)挑取兩個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶切驗(yàn)證。載體經(jīng)雙酶切后,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,載體經(jīng)EcoRI和HindⅢ雙酶切后,分別在5和2 kb附近出現(xiàn)兩條帶并且其大小與pET28a和BBS8的大小一致,酶切驗(yàn)證正確。將酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送至金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序,測序后結(jié)果與Phytozome v13數(shù)據(jù)庫BBS8cDNA參考序列進(jìn)行比對,連接到載體pET28a上的BBS8cDNA序列與原始參考序列一致,說明載體構(gòu)建成功并將其命名為pET-28a(+)-BBS8。

2.2 6×His::BBS8重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將原核表達(dá)載體pET-28a(+)-BBS8轉(zhuǎn)入E.coliBL21細(xì)胞中,待長出轉(zhuǎn)化子后,挑取單克隆接種至LBK(LB培養(yǎng)基中加入卡那霉素)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)。蛋白表達(dá)后經(jīng)鎳柱純化和SDS-PAGE分析。蛋白經(jīng)純化后獲得純度較高的目的蛋白6×His::BBS8(大小約61 kD),經(jīng)Image J分析后得知,目標(biāo)蛋白占總蛋白的92.5%,符合公司純度達(dá)到85%的免疫要求,可進(jìn)行后續(xù)免疫。

用純化合格后的6×His::BBS8融合蛋白進(jìn)行動物免疫,經(jīng)3次免疫后,采集少量血清,利用間接ELISA法測定其效價(圖1)。按照北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心的標(biāo)準(zhǔn),效價為1/2最大OD450值所對應(yīng)的稀釋倍數(shù),由此可知此次所制備的抗血清效價為1∶102400。

圖1 間接ELISA法測定抗血清效價Fig. 1 ELISA test of anti-BBS8 polyclonal antiserum

2.3 BBS8抗體純化及其特異性檢測

IgG亞型抗體富集Protein A是一種金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì),它能夠特異性地結(jié)合多種免疫球蛋白的Fc區(qū)段而與Fab區(qū)或輕鏈結(jié)合很弱。因此,本研究首先利用Protein A純化株對BBS8抗血清IgG進(jìn)行富集,然后用富集所得到的IgG對野生型CC-125和突變體bbs8的全細(xì)胞蛋白提取物進(jìn)行免疫印跡分析。如圖2所示,BBS8抗血清經(jīng)Protein A富集后,可以識別萊茵衣藻野生型藻種CC-125全細(xì)胞蛋白提取物中的內(nèi)源BBS8蛋白(大小約61 kD),而bbs8突變體中由于缺乏BBS8蛋白,因此未能檢測到目標(biāo)條帶。但是Protein A富集后的BBS8抗體仍檢測到多條非特異性條帶,需要對其進(jìn)一步地親和純化以提高BBS8抗體的特異性。

圖2 免疫印跡檢測抗體的特異性Fig. 2 The specificity of the antibody

抗原抗體親和純化: 原核表達(dá)載體pMal-c2x-BBS8的構(gòu)建本研究制備的抗血清是用6×His標(biāo)簽的BBS8融合蛋白,為避免抗體與6×His標(biāo)簽的非特異性結(jié)合,在進(jìn)行抗原抗體純化時,使用MBP標(biāo)簽的融合蛋白,為此首先構(gòu)建原核表達(dá)載體pMal-c2x-BBS8。將EcoRI和HindⅢ雙酶切后的BBS8cDNA克隆至載體pMal-c2x,經(jīng)連接和轉(zhuǎn)化后,隨機(jī)挑取兩個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶切驗(yàn)證。如圖3所示,載體經(jīng)EcoRI和HindⅢ雙酶切后,分別得到與pMalc2x和BBS8大小一致的條帶,酶切驗(yàn)證正確。將酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送至金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序,測序后結(jié)果與Phytozome v13數(shù)據(jù)庫BBS8cDNA參考序列進(jìn)行比對。連接到載體pMalc2x上的BBS8 cDNA序列與原始序列一致,說明載體構(gòu)建成功并將其命名為pMal-c2x-BBS8。

圖3 重組表達(dá)載體pMal-c2x-BBS8雙酶切驗(yàn)證Fig. 3 Restriction digestion analysis of recombination plasmids

MBP::BBS8蛋白表達(dá)與純化CNBr-activated Sepharose 4B通過溴化氰和瓊脂糖上面的羥基反應(yīng)生成活化的氰酸酯基團(tuán),可偶聯(lián)含有氨基的配體,蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸等可以偶聯(lián)到CNBr-activated Sepharose 4B瓊脂糖凝膠上。本研究是用6×His標(biāo)簽的BBS8融合蛋白免疫新西蘭大白兔產(chǎn)生的抗血清,為了提高抗體的特異性,本研究將用MBP標(biāo)簽的BBS8融合蛋白為抗原進(jìn)行抗原抗體純化,因此首先需表達(dá)MBP::BBS8融合蛋白。將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pMal-c2x-BBS8轉(zhuǎn)入E. coliBL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)Dextrin Agarose Resin親和純化后,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MBP::BBS8融合蛋白(大小約101 kD)表達(dá)于上清,且獲得較高濃度的MBP::BBS8融合蛋白。

抗原抗體親和純化及其特異性檢測按上文所述實(shí)驗(yàn)方法,將純化后的MBP::BBS8與CNBractivated Sepharose 4B偶聯(lián),然后按照上文所述方法對抗BBS8 IgG進(jìn)行抗原抗體親和純化,收集純化后的抗體,保留備用。將純化后的BBS8抗體稀釋500倍后,對野生型CC-125和bbs8突變體的全細(xì)胞蛋白提取物進(jìn)行免疫印跡分析。從圖4可以看出,純化后的BBS8抗體可以特異性識別萊茵衣藻野生型CC-125內(nèi)源性BBS8蛋白,而在bbs8突變體的全細(xì)胞蛋白提取物未能檢測到BBS8蛋白,并且其特異性明顯提高,適合后續(xù)進(jìn)行蛋白功能的研究。

圖4 免疫印跡檢測抗體的特異性Fig. 4 The specificity of the antibody

2.4 BBS8蛋白在萊茵衣藻細(xì)胞中的定位

已有的研究表明,BBSome定位在細(xì)胞基體,并且在細(xì)胞基體與IFT顆粒組裝,從而依賴鞭毛內(nèi)運(yùn)輸機(jī)制(Intraflagellar transport,IFT)輸入和輸出鞭毛[18,19]。本研究利用純化的anti-BBS8對野生型CC-125和bbs8進(jìn)行免疫染色。從圖5可以看出,BBS8蛋白在野生型CC-125的細(xì)胞基體明顯富集,且其分布形狀與BBS4[19]和BBS5[18]蛋白在細(xì)胞基體處一致。而bbs8突變體的細(xì)胞基體和其他部位未看到任何熒光信號,進(jìn)一步說明本研究制備的anti-BBS8具有較高的特異性。

圖5 免疫熒光檢測BBS8蛋白在萊茵衣藻細(xì)胞中的定位Fig. 5 Immunofluorescence analysis of BBS8 in C. reinhardtii

3 討論

在哺乳動物和萊茵衣藻細(xì)胞中,BBSome不參與鞭毛組裝,但是其在信號分子鞭毛內(nèi)運(yùn)輸中發(fā)揮著重要的作用。萊茵衣藻BBSome的單一組分如BBS1、BBS4和BBS7缺失,導(dǎo)致BBSome無法成功組裝,從而無法進(jìn)入鞭毛,但是引起鞭毛內(nèi)信號蛋白的異常累積(如磷脂酶和AMP激酶)和缺失(如碳酸酐酶6)[20]。孫琳等[11]利用隨機(jī)插入的方法篩選到一株BBS8蛋白缺失藻種(bbs8突變體),并且作者進(jìn)一步研究表明bbs8突變體鞭毛內(nèi)膜蛋白異常累積,說明BBS8在調(diào)控鞭毛內(nèi)膜蛋白運(yùn)輸中發(fā)揮著重要的作用,但是其詳細(xì)的分子機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

特異性高的抗體是蛋白功能的研究前提。本研究利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)BBS8蛋白,經(jīng)純化后獲得純度為92.5%的蛋白作為抗原進(jìn)行動物免疫并獲得BBS8抗血清,然后對BBS8抗血清進(jìn)行IgG亞型抗體富集和抗原抗體親和純化,最終獲得特異性較高的anti-BBS8多克隆抗體。用該抗體對野生型CC-125和bbs8突變體進(jìn)行免疫熒光染色,可以看到BBS8蛋白在細(xì)胞基體富集,這種在細(xì)胞內(nèi)的分布與孫琳等[10]報道一致,而bbs8突變體的細(xì)胞基體沒有觀察到任何信號,進(jìn)一步證實(shí)anti-BBS8在體內(nèi)具有較高的特異性,且適合用于后續(xù)免疫熒光分析。因此,Protein A富集IgG和抗原抗體純化用于開發(fā)后續(xù)萊茵衣藻兔源多克隆抗體。在后續(xù)抗體測試中,我們將利用該BBS8抗體對萊茵衣藻細(xì)胞體和鞭毛進(jìn)行免疫共沉淀分析,探索其在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用可能。