周婷婷，譚 勁，吳 丹，劉 尋，李 群

(湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

口腔癌是最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，盡管目前在癌癥診斷和治療方面取得了一定進展，但口腔癌患者的5年生存率僅為50%[1]?？谇话┑膫鹘y(tǒng)治療依賴于手術(shù)、放射治療(外束放射治療和/或近距離放射治療)及化療(順鉑等)，但口腔癌早期癥狀隱蔽，大部分患者確診時已是中晚期，錯過最佳手術(shù)時機。雖然以上治療方式可提高患者生存率，但不良反應較多，還會產(chǎn)生耐藥性，限制臨床療效。近年來，傳統(tǒng)中藥由于不良反應少、安全性高、作用多靶點，且能夠有效抑制癌細胞增殖，促進癌細胞凋亡，在口腔癌的治療中表現(xiàn)突出。姜黃，味辛、苦，溫，歸脾、肝經(jīng)，具有破血行氣，通經(jīng)止痛功效；《本草綱目》曰其主治“風痹臂痛”。姜黃素是從中藥姜黃根莖中提取的多酚類化合物，具有多酚植物化學特性。各項研究表明，姜黃素及其衍生物具有廣泛的生物活性，有神經(jīng)保護、抗癌、抗炎等多種功效，且在治療口腔癌[2]、直腸癌[3]、胃癌[4]等惡性腫瘤中療效較好?；诖耍狙芯窟x取人口腔上皮癌Ca9-22細胞為研究對象，探究不同濃度姜黃素對Ca9-22細胞增殖的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞：人口腔上皮癌Ca9-22細胞購自上海鈺博生物科技有限公司。

1.1.2 實驗藥物與儀器：姜黃素(批號LD-1109680，國藥集團化學試劑有限公司)；胎牛血清(批號1658396，美國Hyclone公司)；MEM培養(yǎng)基(批號1760237，美國Hyclone公司)；DMSO培養(yǎng)液(批號BCBR6170V，美國Sigma公司)；胰酶(批號2750018，美國Gibco公司)；MTT溶液(批號A1720090，美國Aladdin公司)；碘化丙啶(批號B07T00102，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)；0.05%胰酶-EDTA(批號25300-054，美國Life Technologies公司)；磷酸鹽緩沖液(批號20140918，北京索萊寶科技有限公司)；Bcl-2(批號sc-7382，美國Cell Signaling公司)；Bax(批號sc-4239，美國Cell Signaling公司)；β-catenin(批號8480，美國Cell Signaling公司)；兔抗Wnt1多克隆抗體(批號251822，成都正能生物有限公司)；C-myc多克隆抗體(批號EPR17924，英國Abcam公司)；Caspase-3、Caspase-9活性檢測試劑盒(批號AC030、AC062，Beyotime公司)；細胞裂解液(批號031020200604，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；硝酸纖維素膜(批號FFN03，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；β-巰基乙醇(批號20160322，白鯊生物公司)；青霉素(批號25465787，上海國藥集團)；鏈霉素(批號5465687，上海國藥集團)；Bradford蛋白定量試劑盒(批號053117171218，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；實時熒光定時PCR系統(tǒng)(型號Light Cycler480，瑞士Roche公司)；酶標儀(型號VICTOR X5，美國Perkinelmer公司)；BX53MRF-S顯微鏡(日本Olympus公司)；垂直電泳儀(型號DYY-6C，北京六一生物科技有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(型號MIR-162-PC/MIR-262-PC，日本松下公司)；流式細胞儀(型號FACSCantoⅡ，BD Biosciences公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組：取對數(shù)期生長的Ca9-22細胞在MEM培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)，并添加10%胎牛血清、新鮮完全培養(yǎng)液100 μl，培養(yǎng)液中含100 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素。所有細胞均置于飽和濕度、37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.2.2 MTT法檢測細胞存活率：將處于生長對數(shù)期的Ca9-22細胞經(jīng)胰酶消化后，以3×105細胞密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞完全貼壁，加入姜黃素使最終濃度分別為5、10、20、40 μmol/L，設(shè)為姜黃素處理組，0 μmol/L為對照組，每組3個復孔。干預24、48、72 h后，培養(yǎng)基中加入0.5 mg/ml的MTT溶液，37 ℃避光孵育3 h。洗滌細胞，然后向培養(yǎng)孔中加入1 ml的0.04 mol/L鹽酸異丙醇溶液，繼續(xù)孵育15 min。最后，將200 μl反應混合物轉(zhuǎn)移到96孔平底板的孔中，在450 nm處測量吸光度，計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(實驗組D450nm/對照組D450nm)×100%。實驗重復3次，取平均值。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率：將Ca9-22細胞接種到T25燒瓶中，分別用5、10、20、40 μmol/L的姜黃素處理，37 ℃暴露48 h。暴露后，使用0.05%胰蛋白酶和0.01%EDTA從燒瓶中分離細胞，離心，用磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，將沉淀懸浮在300 μl的PBS中，并與0.5 μl膜聯(lián)蛋白V-FITC和10 μl碘化丙啶室溫避光15 min。使用來自BD Biosciences的FACSCantoⅡ流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.2.4 Caspase-3、Caspase-9活性檢測：PBS漂洗對照組及5、10、20、40 μmol/L姜黃素處理48 h后的人口腔上皮癌Ca9-22細胞，加入細胞裂解液后振蕩、離心5 min，吸取上清，按照Caspase-3、Caspase-9活性檢測試劑盒操作步驟測蛋白濃度。然后在405 nm波長處測光密度值，通過標準曲線法計算Caspase-3、Caspase-9活性。

1.2.5 免疫印跡法檢測Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因及蛋白表達：取對數(shù)生長期Ca9-22細胞，接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔2 ml，于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至90%融合，隨機分為對照組和不同濃度的姜黃素處理組(5、10、20、40 μmol/L)，置于培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。24、48、72 h后常規(guī)消化收集于離心管，2500 r/min離心5 min，棄上清，加入100 ml預冷的蛋白裂解液冰上裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min離心30 min，提取細胞總蛋白。蛋白質(zhì)濃度由Bradford法測定。將20～60 μg的混合物添加到含有10%β-巰基乙醇的等量上樣緩沖液中，并通過7%～15%丙烯酰胺凝膠遷移。電泳分離后，將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，在24 ℃的5%脫脂牛奶溶液中封閉1 h，然后在適當濃度抗體的培養(yǎng)箱中放置過夜，最后通過ECL成像系統(tǒng)進行條帶檢測。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對人口腔上皮癌Ca9-22細胞增殖的影響 使用5、10、20、40 μmol/L姜黃素處理人口腔上皮癌Ca9-22細胞24、48、72 h后，采用MTT法檢測細胞存活率，細胞存活率隨姜黃素濃度的升高和處理時間的延長而降低，且呈濃度及時間依賴性，見圖1。

圖1 姜黃素對人口腔上皮癌Ca9-22細胞存活率的影響

2.2 姜黃素對人口腔上皮癌Ca9-22細胞凋亡的影響 對照組、5 μmol/L姜黃素處理組、10 μmol/L姜黃素處理組、20 μmol/L姜黃素處理組及40 μmol/L姜黃素處理組48 h細胞凋亡率逐漸上升，且不同濃度姜黃素處理組的細胞凋亡率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 姜黃素對人口腔上皮癌Ca9-22細胞凋亡率的影響(%)

2.3 姜黃素對人口腔上皮癌Ca9-22細胞Bax mRNA、Bcl-2 mRNA表達及Caspase-3、Caspase-9活性的影響 見表2。與對照組比較，不同濃度姜黃素處理組Bax mRNA表達及Caspase-3、Caspase-9活性均升高，Bcl-2 mRNA表達均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且其作用效果與姜黃素濃度呈劑量依賴性。

表2 姜黃素對人口腔上皮癌Ca9-22細胞Bax mRNA、Bcl-2 mRNA表達及Caspase-3、Caspase-9活性的影響

2.4 姜黃素對人口腔上皮癌Ca9-22細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響 與對照組比較，不同濃度姜黃素處理組β-catenin、C-myc、Wnt1蛋白表達均降低(P<0.05)，見圖2。

A：對照組；B：5 μmol/L姜黃素處理組；C：10 μmol/L姜黃素處理組；D：20 μmol/L姜黃素處理組；E：40 μmol/L姜黃素處理組圖2 姜黃素對人口腔上皮癌Ca9-22細胞β-catenin、C-myc、Wnt1蛋白表達的影響

3 討 論

口腔癌屬中醫(yī)“牙巖”“上石疽”“失榮癥”“口菌”等范疇，病因分為內(nèi)因和外因，內(nèi)因為中氣損傷，氣血失常，虛火上浮；外因為邪氣侵犯唇口，導致腎虛唇繭，牙齦潰爛作痛，痰濕聚結(jié)[5]。因此，中醫(yī)治療口腔癌以扶養(yǎng)正氣，提高患者免疫功能為主。相關(guān)研究表明，中藥姜黃素不僅具有抗氧化，抑制炎癥，提高機體免疫功能等功效，還可以抑制口腔癌細胞增殖。劉璐瑤等[6]研究顯示，姜黃素通過調(diào)節(jié)口腔鱗狀細胞癌細胞誘導的腫瘤相關(guān)巨噬細胞發(fā)揮抗癌作用。馮儒學等[7]研究證實，姜黃素通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的表達，發(fā)揮抑制口腔鱗狀細胞癌Tca8113細胞增殖并誘導凋亡的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素對人口腔上皮癌Ca9-22細胞的增殖有明顯抑制作用，且其抑制作用與濃度、時間有關(guān)。Semlali等[8]通過體外探索姜黃素類似物(PAC)的抗癌增殖作用，證明PAC有抑制腫瘤細胞增殖，誘導凋亡、自噬、氧化應激的作用，且腫瘤細胞對PAC的敏感性高于人牙齦上皮細胞。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，不同濃度姜黃素處理組Bax mRNA表達及Caspase-3、Caspase-9活性均升高，Bcl-2 mRNA表達均降低。這可能與下調(diào)Bcl-2表達，上調(diào)Bax誘導腫瘤Ca9-22細胞凋亡有關(guān)。線粒體依賴性細胞凋亡是誘導細胞凋亡的最重要途徑之一，Bcl-2是內(nèi)在途徑的中心調(diào)節(jié)因子，Bax被激活后形成多聚體靠近線粒體膜，使線粒體膜通透性增加、細胞色素C的釋放增多并激活線粒體凋亡信號從而發(fā)揮誘導凋亡作用，而Bcl-2下調(diào)則促進線粒體細胞色素C的釋放，與Bax發(fā)揮協(xié)同抗凋亡作用[9-11]。Caspase-3、Caspase-9是Caspase聯(lián)級反應的關(guān)鍵效應分子。Caspase-3不僅能接受與執(zhí)行細胞凋亡信號活化后與特定底物結(jié)合刺激癌癥細胞凋亡蛋白，還可與Caspase-9結(jié)合形成凋亡小體，激活內(nèi)源性細胞凋亡途徑，使聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶片段化、染色質(zhì)凝集，最終導致細胞凋亡[12-13]。

口腔癌變是復雜的多因素過程，涉及遺傳和分子改變，導致細胞增殖失控、DNA修復受損和細胞死亡[14]。在早期階段，口腔黏膜中潛在惡性病變或口腔發(fā)育不良的發(fā)作與原位癌和浸潤性癌的惡性進展率較高有關(guān)[15]。WNT通路涉及多種信號傳導和調(diào)節(jié)通路，如胚胎發(fā)生、細胞增殖、遷移和極性、細胞凋亡、器官發(fā)生[16]。在成人階段，WNT通路未激活或沉默，然而在許多機制和病理過程中，如炎癥、代謝和神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及癌癥，WNT通路可能會失調(diào)。多項研究表明，Wnt/β-catenin是關(guān)鍵的誘導腫瘤發(fā)生的信號通路，其異常激活與口腔癌在內(nèi)的各種癌癥發(fā)生與發(fā)展關(guān)系密切[17-19]。β-catenin蛋白作為細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)分子，可結(jié)合Wnt1信號通路中的靶位點，激活Wnt1信號通路，進而調(diào)節(jié)下游靶蛋白C-myc、Cyclin D1表達。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度姜黃素處理組β-catenin、C-myc、Wnt1表達均低于對照組，提示姜黃素可抑制Wnt/β-catenin信號通路的表達。姜黃素通過抑制Wnt/β-catenin通路的激活，阻止髓母細胞瘤細胞的G2/M階段細胞周期，直接刺激GSK-3β活性，導致核β-catenin水平下降，從而導致C-myc表達下調(diào)。呂君等[20]研究也表明，黃芪多糖通過抑制Wnt/β-catenin信號通路激活，下調(diào)β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白及Bcl-2基因表達，促進肝癌細胞凋亡。