寇林利，趙明君，魏明明，李瑩超

(1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712021)

慢性心力衰竭(Chronic heart failure,CHF)是心內(nèi)科常見疾病，各種心臟疾患晚期均會出現(xiàn)心功能失代償相關(guān)表現(xiàn)，CHF是目前威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題，全球心力衰竭患者已超過6000萬例，且心衰的發(fā)病率與年齡呈正相關(guān)，每增加10歲發(fā)病率隨之翻一番，且預后差，病死率高[1-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學認為CHF發(fā)病以心室重構(gòu)為主要機制，臨床對其干預措施主要為減緩心室重構(gòu)進程，緩解患者癥狀，提高生活質(zhì)量。中醫(yī)認為“心衰”系心病日久，心絡(luò)“虛”“瘀”相兼，久則發(fā)為以“心悸兼喘息不能平臥，咳吐痰涎，尿少水腫”為主癥的脫證。臨床研究表明，苓桂術(shù)甘湯通過多機制、多靶點改善心衰患者癥狀及預后，臨床應(yīng)用廣泛[4-8]。二維斑點追蹤技術(shù)(Two dimensional speckle tracking echocardiography，2D-STE)通過測量標準動態(tài)二維圖像的應(yīng)變，建立二維灰階圖像分析聲學斑點運動軌跡來定量評價局部和整體心肌功能的無創(chuàng)檢測技術(shù)[9]。本課題旨在通過引入二維斑點追蹤成像技術(shù)定量評價苓桂術(shù)甘湯治療慢性心力衰竭大鼠模型的心肌運動情況，探討苓桂術(shù)甘湯改善慢性心力衰竭大鼠心室重構(gòu)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SPF級SD大鼠[許可證號SCXK(川)2020-030),成都達碩實驗動物公司]5～7周，共44只，體重190～220 g。納入實驗的大鼠均在陜西中醫(yī)藥大學動物實驗中心喂養(yǎng)，給予普通飼料及飲用水飼養(yǎng)7 d后開始用于實驗。

1.1.2 實驗主要試劑：苓桂術(shù)甘湯由陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院自制；注射用鹽酸多柔比星(批號2020080714)；地高辛(批號123191105)；ELISA 試劑盒(批號L211021127)；Masson染液套裝(批號G1006)；中性樹膠(批號10004160)。

1.1.3 實驗主要儀器：正置光學顯微鏡及成像系統(tǒng)(日本尼康公司)；脫水機(Diapath公司)；包埋機(武漢俊杰電子有限公司)；高速組織研磨儀(Sercicebio公司)；臺式高速冷凍離心機(大龍公司)；酶標檢測儀(BioTeK公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥品制備：苓桂術(shù)甘湯由茯苓20 g，桂枝、白術(shù)各15 g，炙甘草10 g組成，于12倍純水中浸泡30 min后按照1∶8比例加水，煎煮2次藥液，1000 r/min，10 min離心，取上清，濃縮至濃度為1 g/ml，存放于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 心電圖采集：受檢大鼠連接心電圖，取左側(cè)臥位并調(diào)整導聯(lián)使心率平穩(wěn)后，暴露左室長軸切面，采集心尖四腔及左室短軸乳頭肌，連續(xù)5個心動周期水平切面的二維動態(tài)圖像并保存，幀頻180～200幀/s。

1.2.3 二維超聲心動圖檢查：于心尖四腔心切面使左室最大程度暴露，記錄大鼠各組左室射血分數(shù)(Left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室短軸縮短率(Fraction shortening，F(xiàn)S)、左室舒張末內(nèi)徑(Left ventricular end-diastolic internal diameter，LVIDd)、左室收縮末內(nèi)徑(Left ventricular end-systolic internal diameter，LVIDs)相應(yīng)數(shù)值。

1.2.4 2D-STE檢查：于上述1.2.2采集的二維動態(tài)圖像中勾勒出心尖左心長軸切面上左室心內(nèi)膜、中段及心外膜大致輪廓，若與實情不符，則可手動調(diào)整心內(nèi)膜及心外膜邊緣曲線，使其寬度盡量與實際一致。自動分析左室室間隔的興趣區(qū)域，使用軟件分析心尖四腔心切面圖像,測量并計算各節(jié)段平均總應(yīng)變值,獲得左心室室間隔二維應(yīng)變參數(shù)(絕對值)、二維斑點縱向應(yīng)變絕對值(GLS)等相關(guān)指標以評估左室收縮功能。上述檢查均由兩位經(jīng)驗豐富的超聲醫(yī)師根據(jù)美國超聲心動圖協(xié)會制定的超聲心動圖規(guī)范化操作流程[10]完成，所有數(shù)據(jù)均重復測量3次，取平均值。

1.3 心衰模型建模方法 配比液：將10 mg注射用鹽酸多柔比星于5 ml滅菌注射用水中混勻，加入0.9%氯化鈉溶液稀釋濃度至2 mg/ml。對需要建模的大鼠給予2 mg/kg的配比液腹腔注射，2次/周，共4周?？瞻捉M給予同體積0.9%氯化鈉溶液。定期觀察并記錄大鼠的行為、毛發(fā)色度、液體出入量等變化，初步評判CHF造模是否成功。造模1周之內(nèi)各組分別行心臟超聲，取得病理學切片，Masson染色后鏡下對比觀察，進一步明確CHF模型是否成功建立。

1.4 分組及干預 將大鼠隨機分成空白組、模型組、地高辛組、苓桂術(shù)甘湯組，各11只。根據(jù)人與大鼠體表面積換算公式，苓桂術(shù)甘湯組、地高辛組分別以6.25 g/(kg·d)、0.027 mg/(kg·d)為劑量標準灌胃,空白組、模型組給予等體積0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)灌胃4周。每周稱重1次并記錄，同時為盡量排除晝夜節(jié)律的影響因素采取固定時間灌胃。

1.5 血液學指標檢測 各組大鼠在灌胃4周后于心尖部取血，靜置30 min，2000 r/min，離心30 min，取上清，-80 ℃儲存。ELISA實驗中取適量樣本，室溫解凍，以ELISA試劑盒檢測，記錄各組大鼠血漿B型腦鈉肽(B brain natriuretic peptide，BNP)、血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，Ang-Ⅱ)及內(nèi)皮素1(Endothelin 1，ET-1)水平。

1.6 Masson染色心肌組織 采血完成后盡快取出心臟，0.9%氯化鈉溶液灌流至組織表面顏色灰白，固定于4%多聚甲醛過夜，常規(guī)無水乙醇、包埋、切片，Masson染色，鏡下對比觀察各組大鼠心肌纖維化程度，采集圖像保存分析。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 造模過程中發(fā)現(xiàn)空白組大鼠精神狀態(tài)佳，毛色正常無脫落，食水量、二便均正常，活潑好動，由于互相撕咬死亡2只，重新分籠后無死亡發(fā)生。模型組大鼠在造模第1周時出現(xiàn)飲食、飲水量逐漸減少，造模第2周活動逐漸減少，表現(xiàn)為安靜、嗜臥，部分大鼠毛發(fā)逐漸粗糙、變黃及脫落；造模第3周時出現(xiàn)體重下降，四肢末梢冰涼，皮膚蒼白，毛發(fā)脫落，尤以雙耳后及頸部毛發(fā)脫落較甚，大便較稀軟，大鼠鼻部及眼角出現(xiàn)紅色分泌物；造模第4周模型組大鼠出現(xiàn)腹部膨隆表現(xiàn)。各組直至灌胃給藥結(jié)束后大鼠存活情況：空白組9只，模型組7只，地高辛組、苓桂術(shù)甘湯組，每組6只。

2.2 各組大鼠心肌組織病理學形態(tài)改變 通過Masson三色法染色分析，并計算膠原纖維面積占左心室組織面積的百分比后發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組、地高辛組、苓桂術(shù)甘湯組纖維化程度均較高；與模型組比較，地高辛組、苓桂術(shù)甘湯組纖維化程度均低；苓桂術(shù)甘湯組纖維化程度低于地高辛組(圖1)。

A：空白組；B：模型組；C：地高辛組；D：苓桂術(shù)甘湯組圖1 各組大鼠心肌組織病理學形態(tài)(Masson染色，×200)

2.3 各組大鼠二維超聲結(jié)果比較 造模結(jié)束1周后對各組大鼠行心臟二維B超。與空白組比較，模型組大鼠的LVEF、FS、LVIDd、LVIDs均明顯改變，主要表現(xiàn)為LVEF、FS的顯著降低和LVIDd、LVIDs升高(圖2)。

A：空白組；B：模型組圖2 造模1周后二維超聲判定建模成功

給藥4周后，各組大鼠超聲檢查結(jié)果，見表1。模型組大鼠LVEF、FS值均低于空白組,LVIDd、LVIDs則高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。苓桂術(shù)甘湯組、地高辛組LVEF、FS值均高于模型組，LVIDd、LVIDs均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。LVEF、FS、LVIDd、LVIDs在地高辛組與苓桂術(shù)甘湯組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

表1 各組大鼠超聲心動圖相關(guān)指標比較

二維超聲結(jié)果提示，模型組大鼠心功能受損，左室舒張功能及收縮功能均受到一定程度損害，藥物治療后的大鼠心功能均得到一定程度改善，但較空白組仍有差距。

2.4 各組大鼠血清BNP、Ang-Ⅱ及ET-1比較 見表2。模型組大鼠BNP、Ang-Ⅱ、ET-1均高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。地高辛組、苓桂術(shù)甘湯組BNP、Ang-Ⅱ、ET-1均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。苓桂術(shù)甘湯組ET-1低于地高辛組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清BNP、Ang-Ⅱ及ET-1水平比較(ng/L)

2.5 各組大鼠2D-STE應(yīng)變參數(shù)比較 見表3。模型組室間隔二維應(yīng)變參數(shù)各節(jié)段絕對值均低于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。地高辛組、苓桂術(shù)甘湯組室間隔二維應(yīng)變參數(shù)各節(jié)段絕對值均高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。地高辛組室間隔二維應(yīng)變參數(shù)基底段、心尖段絕對值均高于苓桂術(shù)甘湯組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。各組大鼠給藥4周后給予二維斑點結(jié)果，與空白組相比，模型組GLS的絕對值較低；與模型組相比，地高辛組、苓桂術(shù)甘湯組GLS絕對值較高；與苓桂術(shù)甘湯組比較，地高辛組GLS絕對值升高(圖3)。

表3 各組大鼠心臟室間隔2D-STE應(yīng)變參數(shù)比較

A：空白組；B：模型組；C：地高辛組；D：苓桂術(shù)甘湯組圖3 各組大鼠給藥4周后二維斑點結(jié)果圖

2.6 各指標相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，BNP與GLS之間存在顯著相關(guān)性(r=-0.9447,P<0.01)；Ang-Ⅱ與GLS之間存在顯著相關(guān)性(r=-0.9251,P<0.01)，ET-1與GLS之間存在顯著相關(guān)性(r=-0.9186,P<0.01)。

3 討 論

心肌損傷是CHF發(fā)生發(fā)展的主要環(huán)節(jié)，而抵抗各種損傷的修復機制主要表現(xiàn)為心室重構(gòu)[11-12]；目前認為心室重構(gòu)主要包括心肌肥大和心肌纖維化[13-14]，是心肌針對機械或者神經(jīng)刺激做出的代償性反應(yīng)，微觀方面表現(xiàn)為心室心肌細胞及間質(zhì)的重構(gòu)，宏觀方面以心室擴張和心功能衰退為主[15]。數(shù)據(jù)顯示僅以心衰“金四角”，即ACEI/ARNI、β受體阻滯劑、MRA和 SGLT2抑制劑為主要方案的西醫(yī)治療對心衰的反復住院率及遠期療效并不明顯[16-19]。而中醫(yī)認為心陽不足是心衰的主要病機，且心陽乃陽中之太陽，可振奮一身之陽[20-21]。因此，心陽虛可逐漸導致肺、脾、腎三臟陽氣皆虛，影響其相應(yīng)生理功能，首當其沖是全身津液代謝失調(diào)發(fā)為水腫，苓桂術(shù)甘湯作為經(jīng)典的健脾利水、溫陽蠲飲方劑，在CHF治療中效果可觀，方中重用茯苓健脾利水滲濕，為君藥；配伍桂枝溫心陽以制腎水，助心陽以平?jīng)_降逆,通心陽以消陰翳之痰飲，同時達到溫補肺、脾、腎三臟，且能祛除里實；白術(shù)合茯苓加強培土制水之功,為佐藥；并使以炙甘草辛甘化陽，助藥效發(fā)散。全方共奏助陽化氣之功,使邪從小便而利[22]。

當左心室負荷量及心臟形態(tài)改變時應(yīng)用二維超聲心動圖對心臟結(jié)構(gòu)與功能的評價存在一定局限[23]。本研究所用的2D-STE可以對心肌組織進行定量分析，通過獲取興趣范圍的心肌組織灰階并自動逐幀追蹤此區(qū)域內(nèi)聲學斑點位置、心動周期中的信息對目標位置心肌運動情況進行分析，并對大鼠心肌組織進行圖像創(chuàng)建，最終獲得牛眼圖。此圖像中主要涉及到心肌組織的運動、形變及應(yīng)變角度、位移、速度等多方面心肌力學參數(shù)，精準辨別心肌不同節(jié)段的異常運動情況[24-26]。此結(jié)果可最大程度排除心臟整體運動、室壁運動夾角、聲束方向等因素的干預。在心動周期中，心肌發(fā)生的應(yīng)變顯著表現(xiàn)在徑向、縱向及圓周運動三個矢量方向，通常以心肌縱向應(yīng)變?yōu)橹饕獏⒖糩27-28]。2D-STE檢查目前仍存在一定技術(shù)局限：其一，心肌運動一般在三維空間觀察其形態(tài)變化，而該檢查技術(shù)僅檢測了心肌縱向、徑向及周向的二維形變情況，而無法全面跟蹤斑點運動軌跡的空間位置[29-31]；其二，該診斷技術(shù)對圖像質(zhì)量要求極其嚴苛，必須采取完整的心肌內(nèi)、中、外三層膜，而通常高分辨率的二維圖像可以將心肌節(jié)段運動進行有效追蹤，并掌握整個檢查時間段患者的心肌運動情況[32-34]。

本研究結(jié)果提示，慢性心衰大鼠經(jīng)地高辛、苓桂術(shù)甘湯治療后心功能均得到改善，但地高辛組和苓桂術(shù)甘湯組血清學LVEF、FS、LVIDd、LVIDs、BNP、Ang-Ⅱ比較均無統(tǒng)計學意義，而從左心室二維斑點追蹤顯像來看，地高辛組室間隔二維應(yīng)變參數(shù)基底段及心尖段絕對值較高，且GLS絕對值也高于苓桂術(shù)甘湯組；從病理學分析來看，地高辛組總治療效果優(yōu)于苓桂術(shù)甘湯組。通過將血清學指標BNP、Ang-Ⅱ及ET-1與GLS進行Pearson相關(guān)性分析，其結(jié)果驗證了苓桂術(shù)甘湯通過調(diào)控RAAS系統(tǒng)來改善左室心肌收縮功能以減輕心室重構(gòu)，延緩心衰進程。2D-STE技術(shù)對局部心肌運動的定量評價驗證了苓桂術(shù)甘湯調(diào)控神經(jīng)內(nèi)分泌因子改善心肌收縮力，在慢性心力衰竭診斷及療效判定中有重要意義。