宋 文 武霞霞 婁海偉 方惠敏

(1. 河南工業(yè)大學(xué)食品糧油學(xué)院，河南 鄭州 450001；2. 鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001)

脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)廣泛存在于各種動植物與微生物中[1]，能夠催化甘油酯水解為甘油和脂肪酸。作為重要的工業(yè)用酶，脂肪酶已被廣泛應(yīng)用于食品、油酯化工等傳統(tǒng)工業(yè)領(lǐng)域[2-3]。在乳制品加工過程中添加脂肪酶，可使奶酪中的酸、酯類(十四酸乙酯除外)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，如辛酸、己酸、癸酸等含量明顯增加[4]；脂肪酶和雙乙酰酒石酸單雙甘油酯可改善面團(tuán)持氣穩(wěn)定性，顯著增大面包比容和挺立度[5]。

疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(Thermomyceslanuginosuslipase，TLL)因催化活性高、熱穩(wěn)定性好、pH值范圍寬，是一種良好的食品和工業(yè)催化用酶。但是，由于工業(yè)加工過程中條件不穩(wěn)和或加工時間過長，仍需降低生產(chǎn)成本、提高催化活性、延長半衰期及抵抗蛋白酶解等[6]。

脂肪酶屬于α/β水解酶家族。不同起源的脂肪酶序列相似度不高，但其折疊方式和活性中心卻非常相似，均具有典型的α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)，包含8條平行排列的β折疊片，其中β2折疊片與其余7條折疊片反向平行，β3～β8折疊片通過分布在折疊片中心兩側(cè)的α螺旋相連[7]。脂肪酶活性部位被一個稱為“蓋子”螺旋片段遮擋，當(dāng)有底物存在時，酶的構(gòu)象發(fā)生變化，“蓋子”打開，具有活性的疏水部分被暴露出來[8]。脂肪酶的兩個末端并不直接參與催化作用，尤其是C-末端是一段無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，且兩個末端空間距離較近，如果通過Linker將脂肪酶的N-末端與C-末端連接，理論上應(yīng)該不會影響其催化活性，但卻有可能增加其穩(wěn)定性和蛋白酶耐受性。

將線性蛋白(或肽)的C-端和N-端通過酰胺鍵進(jìn)行首尾環(huán)合形成環(huán)狀分子稱為蛋白質(zhì)環(huán)化。自然界中存在天然環(huán)化結(jié)構(gòu)的環(huán)肽類物質(zhì)，與線性蛋白相比，末端環(huán)化能夠降低蛋白折疊域與非折疊域的構(gòu)象熵，因此可能具有較高的熱穩(wěn)定性和較穩(wěn)的結(jié)構(gòu)，但其功能和活性往往不受影響[9]。

Butelase 1發(fā)現(xiàn)于常見藥用植物Clitoriaternatea(也稱為蝴蝶豌豆)的豆莢中，它特異識別目標(biāo)蛋白C末端三肽氨基酸序列Asn / Asp(Asx)-His-Val，以KALVINHV作為模型肽評估其與XIGGIR和LXGGIR的連接效率，發(fā)現(xiàn)Butelase 1能夠有效環(huán)化來自各種生物的非天然肽，包括植物CyclotidekalataB1(kB1)、SFTI、芋螺毒素，昆蟲抗菌肽Thanatin和人唾液抗菌肽Histatin[10]。Butelase1催化動力學(xué)非常高，催化效率高達(dá)542 000 L/(mol·s)，是目前已知效率最高的蛋白連接(水解)酶[11]；Butelase 1也可以環(huán)化大于200個氨基酸殘基的重組蛋白，已報道的有白介素-1受體拮抗劑(IL1-Ra)、綠色熒光蛋白(GFP)、人生長激素(hGH)等[12]。

研究擬在梳棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(TLL)的C-端和N-端分別添加Butelase 1連接酶識別序列和柔性接頭，利用Butelase 1連接酶對TLL進(jìn)行末端環(huán)化，分析線性和環(huán)化酶蛋白的基本酶學(xué)性質(zhì)、環(huán)化提升酶蛋白熱穩(wěn)定性，旨在為提升工業(yè)酶的加工及應(yīng)用范圍提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

表達(dá)載體pCold I、大腸桿菌TG1、BL21(DE3)：實(shí)驗(yàn)室保存；

限制性內(nèi)切酶：寶生物工程(大連)有限公司；

DNA marker、2×Taq Mix Master：蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司；

DNA同源重組連接酶：南京諾唯贊生物科技股份有限公司；

HRP標(biāo)記的Anti-His Tag 抗體：蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司；

無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒：上海生工生物工程有限公司；

DNA膠回收試劑盒、去內(nèi)毒素DNA質(zhì)粒大提試劑盒：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；

對硝基苯基月桂酸酯(pNPL)：美國Sigma-Aldrich公司；

HisTrap FF crude：美國GE Healthcare 公司；

引物：北京金唯智生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建 從GeneBank數(shù)據(jù)庫中獲得鏈霉菌來源的Butelase 1的cDNA序列(GenBank登錄號KF918345)，在N末端加上熒光素酶信號肽，氨基酸序列為MGVKVLFALICIAVAEA，并在C末端加上Flag標(biāo)簽，根據(jù)哺乳動物密碼子偏愛性進(jìn)行密碼子優(yōu)化；在優(yōu)化后DNA的5’端和3’端分別添加EcoR I和NotI酶切位點(diǎn)，并委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行全基因合成，獲得重組質(zhì)粒pUC57-butelase1，經(jīng)雙酶切后連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，重組質(zhì)粒命名為pcDNA-butelase。從GeneBank數(shù)據(jù)庫中獲取TLL的氨基酸序列(GenBank登錄號ABV69591.1)，在N-末端添加Butelase 1連接酶柔性接頭和識別序列(GGGGS)3，并在C-末端加上His標(biāo)簽和識別序列NHV，按上述方法，優(yōu)化和合成TLL基因，并連接到大腸桿菌表達(dá)載體pColdI中，命名為pCold-TLL。

1.2.2 重組rButelase 1和rTLL的表達(dá)與純化 利用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取重組質(zhì)粒pcDNA-butelase，同時培養(yǎng)HEK 293T細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度為70%～80% 時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染體系為：1 μg的pcDNA-butelase質(zhì)粒和1 μL的Lipofectamine 2000分別用25 μL Opti-MEM稀釋后混勻，靜置10 min，加入孔板中輕輕混勻，37 ℃培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞利用凍融法裂解細(xì)胞，收集上清。

構(gòu)建好的重組pCold-TLL轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，陽性菌接種到5 mL含氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)約6 h，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG，15 ℃、180 r/min振蕩誘導(dǎo)表達(dá)24 h，收集菌體，利用超聲破碎儀進(jìn)行菌體破碎，收集上清。

將上述獲得的重組Butelase 1(rButelase)和重組脂肪酶TLL(rTLL)表達(dá)上清，分別利用Flag親和層析柱和His Trap層析柱，通過AKTA蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化，純化蛋白進(jìn)行電泳、Western Blot檢測和活性研究。

1.2.3 重組rTLL的環(huán)化 根據(jù)文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行rTLL的環(huán)化。環(huán)化反應(yīng)結(jié)束后，通過AKTA蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化并透析脫鹽。取少量純化后的樣品加入5倍非還原上樣緩沖液處理后進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot檢測。

1.2.4 重組rTLL和cTLL的酶學(xué)活性分析 按GB/T 23535—2009執(zhí)行，并根據(jù)文獻(xiàn)[13]的方法計算酶活力。

純化rTLL和cTLL分取500 μL，分別置于40，45，50，55，60，65，70，75 ℃水浴1 min，然后測定酶活。

1.2.5 DLS測量蛋白粒徑 按GB/T 19007—2016執(zhí)行。

1.2.6 重組rTLL和cTLL蛋白酶抵抗 分別取3 mg rTLL和cTLL，各分成3等份，分別加入羧肽酶Y、亮氨酸氨基肽酶、羧肽酶Y+亮氨酸氨基肽酶進(jìn)行蛋白質(zhì)游離末端水解，25 ℃反應(yīng)30 min，隨后快速置于100 ℃水浴30 min，使羧肽酶Y和亮氨酸氨基肽酶失活；冷卻，采用SDS-PAGE鑒定rTLL和cTLL的蛋白酶解情況。

1.2.7 重組rTLL和cTLL熱穩(wěn)定性 將溶于1×PBS緩沖液的純化酶蛋白(約2.5 μg) 分別于70 ℃孵育0，30，60，90，120，150，180 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清，取少量上清用于SDS-PAGE分析降解和沉淀情況，其余樣品以對硝基苯基月桂酸酯(pNPL)為底物進(jìn)行酶活測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 Butelase1在哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)與純化

由圖1可知，細(xì)胞破碎上清中檢測到重組Butelase 1目的蛋白，可獲得單一條帶的目的蛋白，Western Blot檢測證實(shí)，此條帶為重組Butelase 1酶。

M. 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1. 293T/pcDNA-butelase細(xì)胞破碎上清 2. 親和層析空出液 3. 親和層析洗脫液 4. Western Blot圖1 Butelase 1的表達(dá)與純化Figure 1 Expression and purification of Butelase 1

2.2 重組TLL酶在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)與純化

由圖2可知，誘導(dǎo)表達(dá)的菌體破碎后的上清液中，在40 kD左右處有大量蛋白表達(dá)，與重組TLL理論大小相同，說明目的蛋白TLL在BL21(DE3)中得到了高效的可溶性表達(dá)。由于表達(dá)的重組蛋白上含有His-Tag，因此可以通過Ni柱親和層析進(jìn)行純化，并透析除鹽，經(jīng)密度掃描分析顯示純化的目的蛋白純度可達(dá)95%左右。

M. 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1. 空白菌體破碎上清 2、3. 蛋白洗脫液 4. BL21(DE3)/pCold-TLL菌體破碎上清 5～7. 純化rTLLWestern Blot圖2 rTLL酶的純化Figure 2 Purified rTLL was detected by SDS-PAGE and Western blotting

2.3 cTLL環(huán)化結(jié)果與酶學(xué)活性分析

由圖3可知，cTLL表觀分子量略小于rTLL，與40 kD 的Marker基本平齊，與Hemu等[14]的研究結(jié)論相一致。

M. 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1～3. rTLL 4～6. cTLL圖3 SDS-PAGE分析TLL環(huán)化結(jié)果Figure 3 SDS-PAGE analysis of TLL cyclization results

由圖4可知，當(dāng)溫度為55 ℃時，rTLL和cTLL的酶活達(dá)到最大值；當(dāng)溫度偏離55 ℃最適溫度越多，酶活降低越多，當(dāng)溫度為75 ℃時，酶活僅為最大值的68.6%。

圖4 脂肪酶在不同溫度下的活性Figure 4 Lipase activity at different temperatures

2.4 重組TLL和cTLL蛋白酶解分析

由圖5可知，蛋白酶解30 min后，rTLL蛋白的3種處理均出現(xiàn)不同程度的降解情況，因?yàn)轸入拿竃酶活較弱，因此rTLL降解比例較小，羧肽酶Y和亮氨酸氨基肽酶共同作用時，rTLL蛋白幾乎完全降解；而cTLL的3種處理蛋白降解均不明顯。

M. 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1. cTLL對照 2. cTLL/羧肽酶+亮氨酸氨基肽酶 3. rTLL/羧肽酶+亮氨酸氨基肽酶 4. cTLL/亮氨酸氨基肽酶 5. rTLL/亮氨酸氨基肽酶 6. cTLL/羧肽酶 7. rTLL/羧肽酶圖5 SDS-PAGE分析羧肽酶Y、亮氨酸氨基肽酶降解rTLL和cTLLFigure 5 SDS-PAGE analysis of carboxypeptidase Y and leucineaminopeptidase degradation of rTLL and cTLL

2.5 TLL和cTLL的蛋白粒徑分析

由圖6可知，rTLL蛋白粒徑不均一、分散性較差、蛋白團(tuán)聚明顯，PDI為0.313；環(huán)化后cTLL蛋白粒徑均一、分子量分布均勻，平均粒徑約為160 nm，PDI為0.173。PDI是聚合物分散性指數(shù)，描述聚合物分子量分布；PDI 越大，分子量分布越寬；PDI 越小，分子量分布越均勻。環(huán)化后的cTLL分子量分布越均勻。

圖6 DLS分析蛋白粒徑Figure 6 Protein particle size measured by DLS

2.6 穩(wěn)定性分析

由圖7可知，線性化的rTLL在加熱30 min后，其穩(wěn)定性便迅速下降，處理180 min后已形成大量沉淀，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示可溶部分比例非常少；而對cTLL進(jìn)行70 ℃加熱處理后，蛋白沉淀和降解較弱，直至加熱120 min后，蛋白條帶才有肉眼可見的減少，表明末端連接的分子環(huán)化明顯提升了TLL的熱穩(wěn)定性。

M. 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1～7. 70 ℃加熱0，30，60，90，120，150，180 min圖7 rTLL和 cTLL熱穩(wěn)定性分析Figure 7 Thermal stability analysis of rTLL and cTLL

3 結(jié)論

蛋白質(zhì)是由線形的氨基酸折疊而形成的具有一定的生物學(xué)功能和三維結(jié)構(gòu)，由于蛋白質(zhì)肽鏈的末端容易受到蛋白水解酶類的攻擊，通過人工方法使肽鏈的氨基端和羧基端形成一個肽鍵，從而形成環(huán)形的骨架有利于抵御蛋白水解酶類的攻擊[15]，事實(shí)也證實(shí)大部分蛋白環(huán)化后穩(wěn)定得到了很大提高。Butelase 1具有高催化活性并在反應(yīng)中使用的酶量較少，簡化了所需連接酶的純化步驟；具有廣泛的底物特異性，識別序列短至3個氨基酸，拓寬了酶的應(yīng)用范圍；在連接位點(diǎn)引入極少的殘基，應(yīng)用范圍廣。

研究利用哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)HEK 293T細(xì)胞得到Butelase 1連接酶。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢在于能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，在提供復(fù)雜的N型糖基化和準(zhǔn)確的O型糖基化等多種翻譯后加工功能，因而表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子。同時，在大腸桿菌中高效可溶表達(dá)和純化得到了有活性的重組的疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶，通過Butelase 1催化獲得了環(huán)化的環(huán)狀疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶蛋白，純化后環(huán)狀疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶與重組疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的比活基本相當(dāng)，但有著更好的穩(wěn)定性。但研究僅是對環(huán)化后的脂肪酶進(jìn)行了耐熱性試驗(yàn)，后續(xù)還應(yīng)對其耐離子強(qiáng)度、pH值敏感性等特性進(jìn)行研究，以更好的評估其應(yīng)用前景。