孫朋朋 王 薇 李若彤 朱 紅 任圓圓

(長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

泥鰍，又稱(chēng)鰍魚(yú)，是中國(guó)極具特色的淡水魚(yú)類(lèi)，有“水中人參”之美譽(yù)[1]。據(jù)《中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》[2-4]顯示，2013—2017年泥鰍的養(yǎng)殖量分別為32.15萬(wàn)，34.31萬(wàn)，36.62萬(wàn)，37.26萬(wàn)，39.47萬(wàn)t，以平均每年5.7%的速度持續(xù)增加。但泥鰍等淡水魚(yú)與海水魚(yú)相比，其魚(yú)糜的凝膠性能相對(duì)較差，因此其深加工程度較低，目前以鮮活銷(xiāo)售為主。

肌原纖維蛋白是一類(lèi)具有重要生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)蛋白，因其出色的水結(jié)合能力和凝膠形成能力，決定著魚(yú)糜制品的保水性、質(zhì)構(gòu)等品質(zhì)特性。在肌原纖維蛋白的熱誘導(dǎo)凝膠化過(guò)程中，肌原纖維蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)遭到破壞而發(fā)生伸展，蛋白質(zhì)分子之間相互聚集，形成高黏彈性的三維網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)對(duì)魚(yú)糜制品的品質(zhì)特性非常重要[5]。目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)肌原纖維蛋白改性的研究較多，包括物理改性、化學(xué)改性、生物改性以及新型技術(shù)的改性等[6]。此外，利用肌原纖維蛋白和高分子化合物(如：多糖、蛋白質(zhì)等)形成復(fù)合物也是提高其凝膠特性的方法之一。呂旭琴等[7]探討了不同種類(lèi)多糖對(duì)肌原纖維蛋白凝膠特性的影響，包括陰/陽(yáng)離子多糖、中性多糖及改性多糖。Lin等[8]探究了植物蛋白混合物對(duì)紅鯛魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠特性的影響。

大豆分離蛋白與卡拉膠是常用的凝膠改良劑，常被用于魚(yú)糜凝膠制品的食品加工中，以提升產(chǎn)品的凝膠性、持水性以及肉制品的口感。然而，目前關(guān)于使用大豆分離蛋白和卡拉膠對(duì)泥鰍肌原纖維蛋白進(jìn)行改性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。研究擬以泥鰍肌原纖維蛋白為研究對(duì)象，探究大豆分離蛋白及卡拉膠對(duì)其凝膠特性的影響，以期為開(kāi)發(fā)泥鰍類(lèi)魚(yú)糜制品提供理論參考，提高泥鰍的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

鮮活泥鰍：市售；

大豆分離蛋白、卡拉膠：北京索萊寶科技有限公司；

所有分析用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV-2600型，日本島津公司；

質(zhì)構(gòu)儀：TMS-PRO型，美國(guó)Food Technology Corporation (FTC)公司；

色差儀：Hunterlab型，昆山蘊(yùn)科機(jī)電科技有限公司；

掃描電子顯微鏡：Tescan Vega 3型，捷克泰斯肯(Tescan)公司；

紅外光譜儀：VECTOR22型，德國(guó)BRUKER公司。

1.2 方法

1.2.1 泥鰍肌原纖維蛋白的提取 參考Pan等[9]的方法并加以改進(jìn)。將鮮活泥鰍去頭、尾、內(nèi)臟、魚(yú)皮及骨刺后，清洗瀝干，獲得泥鰍肉。向其中加入事先預(yù)冷(4 ℃)的0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(含0.01 mol/L Na2HPO4·12H2O、0.01 mol/L NaH2PO4·2H2O、0.1 mol/L Triton-X 100)[m泥鰍肉∶V緩沖溶液=1∶4 (g/mL)]，高速勻漿，在4 ℃、9 982 r/min條件下離心15 min收集沉淀，重復(fù)上述步驟兩次。向所得沉淀中加入事先預(yù)冷(4 ℃)的0.1 mol/L NaCl溶液[m泥鰍肉∶VNaCl溶液=1∶4 (g/mL)]，高速勻漿，雙層紗布過(guò)濾。所得濾液在4 ℃、9 982 r/min條件下離心15 min 收集沉淀，重復(fù)上述步驟兩次，最終得到的沉淀即為泥鰍肌原纖維蛋白(MP)，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 凝膠的制備 用0.6 mol/L NaCl溶液將MP質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)至70 mg/mL，分別加入0%，1%，2%，3%，4%，5%的大豆分離蛋白及卡拉膠(以MP含量計(jì))，混勻，40 ℃加熱60 min，90 ℃加熱30 min，立即取出冷卻至室溫，置于4 ℃冰箱中平衡過(guò)夜，得到復(fù)合物凝膠。

1.2.3 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定 將凝膠切成大小均勻一致的圓柱狀(Φ30 mm×10 mm)，利用質(zhì)構(gòu)儀對(duì)其凝膠強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定。使用P/0.5型號(hào)圓柱探頭，設(shè)定探頭位移速度為0.5 mm/s，初始高度為11 mm，下壓比例30%，觸發(fā)力0.1 N。

1.2.4 保水性的測(cè)定 采用離心法測(cè)定凝膠的保水性。準(zhǔn)備一根干燥潔凈的離心管，取一定質(zhì)量的凝膠放入離心管中，在4 ℃、9 982 r/min條件下離心10 min，傾倒上清液，用濾紙吸干凝膠表面水分，再次稱(chēng)量離心后凝膠與離心管的質(zhì)量。按式(1)計(jì)算凝膠的保水性(Water Holding Capacity，WHC)。

(1)

式中：

WHC——保水性，%；

W——離心管的質(zhì)量，g；

W1——離心管與初始凝膠的質(zhì)量，g；

W2——離心管與離心后凝膠的質(zhì)量，g。

1.2.5 蒸煮損失的測(cè)定 取一定質(zhì)量的凝膠樣品，在40 ℃條件下加熱1 h，再轉(zhuǎn)入90 ℃加熱30 min 后取出，冷卻至室溫，擦干表面水分后再次稱(chēng)量凝膠的質(zhì)量。按式(2)計(jì)算凝膠的蒸煮損失(Cooking Loss，CL)。

(2)

式中：

CL——蒸煮損失，%；

M1——凝膠的初始質(zhì)量，g；

M2——蒸煮后凝膠的質(zhì)量，g。

1.2.6 白度的測(cè)定 將凝膠切成10 mm厚的圓片，利用色差儀測(cè)定其表面的色差(L*，a*，b*)，測(cè)前先用標(biāo)準(zhǔn)白板進(jìn)行校正。按式(3)計(jì)算凝膠的白度(Whiteness，W)。

(3)

式中：

W——白度；

L*——亮度值；

a*——紅度值；

b*——黃度值。

1.2.7 微觀結(jié)構(gòu)測(cè)定 將凝膠切成3 mm×3 mm×3 mm的塊狀，在2.5%的戊二醛溶液中固定過(guò)夜，然后用0.2 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液清洗3次，再依次用30%，60%，70%，80%，90%，100%的乙醇溶液梯度脫水，每次脫水30 min。最后經(jīng)真空冷凍干燥(真空度為1 Pa，冷阱溫度為-70 ℃，運(yùn)行時(shí)間為24 h)及噴金處理后，用掃描電子顯微鏡進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)的觀察[10]。

1.2.8 傅里葉紅外光譜的測(cè)定 將真空冷凍干燥后的凝膠與KBr以m凝膠∶mKBr為1∶150進(jìn)行混合研磨，壓成薄片，利用傅立葉紅外光譜儀對(duì)其進(jìn)行掃描。掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為16次。使用MONIC軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行去卷積，PeakFit 軟件對(duì)1 700～1 600 cm-1區(qū)域進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)峰值擬合[11]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，并采用Microsoft Excel計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，SPSS 23.0軟件中的Duncan 法進(jìn)行顯著性分析，Origin 2019軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝膠強(qiáng)度

由圖1可知，隨著大豆分離蛋白含量的增加(1%～5%)，MP凝膠硬度呈先降低后升高的趨勢(shì)，而凝膠彈性整體上則先升高后降低。當(dāng)大豆分離蛋白含量為1%時(shí)，MP凝膠硬度最大(1.95 N)，比對(duì)照組增加81.39%(P<0.05)，而MP凝膠彈性最小，比對(duì)照組減小10.63%(P<0.05)；添加3%的大豆分離蛋白，MP凝膠硬度最低(1.5 N)，但仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，此時(shí)的凝膠彈性最大。這可能是由于大豆分離蛋白本身具有較好的乳化性能，可使單位體積凝膠分子數(shù)量增加，促進(jìn)分子間相互作用[12]。與大豆分離蛋白不同，不同含量(1%～5%)的卡拉膠對(duì)MP凝膠硬度和彈性均有減弱作用。當(dāng)卡拉膠含量為1%時(shí)，MP凝膠彈性較好，但仍低于對(duì)照組(P<0.05)；當(dāng)卡拉膠含量為2%和4%時(shí)，MP凝膠硬度低達(dá)0.3 N，比對(duì)照組降低了72.09%。作為一種凝膠多糖，卡拉膠具有優(yōu)良的凝膠特性，可與蛋白質(zhì)絡(luò)合提升產(chǎn)品質(zhì)量。但試驗(yàn)中，卡拉膠并未提高泥鰍肌原纖維蛋白的凝膠品質(zhì)，與孫澤坤等[13]的研究結(jié)果相反。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 大豆分離蛋白及卡拉膠對(duì)泥鰍肌原纖維蛋白凝膠硬度和彈性的影響Figure 1 Effects of soybean protein isolate and carrageenan on gel hardness and springiness of myofibrillar protein from loach

2.2 凝膠保水性

由圖2可知，低含量(1%)的大豆分離蛋白不利于MP凝膠保水性，而高含量(≥2%)的大豆分離蛋白可以提高其保水性。當(dāng)大豆分離蛋白含量為4%時(shí)，MP凝膠保水性高達(dá)88.97%，比對(duì)照組提高了6.67%(P<0.05)。這可能是由于大豆分離蛋白可以為周?chē)肿犹峁└嗟臍滏I結(jié)合位點(diǎn)，增強(qiáng)氫鍵和二硫鍵[14-15]，使蛋白質(zhì)交聯(lián)程度增大。張鈺嘉等[16]也發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白可以提高草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠的保水能力。與大豆分離蛋白不同，卡拉膠的添加對(duì)MP凝膠保水性的影響沒(méi)有一定規(guī)律。當(dāng)卡拉膠含量為2%，4%時(shí)，MP凝膠保水性低于對(duì)照組，而在其他添加量時(shí)則高于對(duì)照組。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 大豆分離蛋白及卡拉膠對(duì)泥鰍肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響Figure 2 Effects of soybean protein isolate and carrageenan on gel water holding capacity of myofibrillar protein from loach

2.3 凝膠蒸煮損失

由圖3可知，隨著大豆分離蛋白和卡拉膠含量(1%～5%)的增加，MP凝膠蒸煮損失呈先降低后升高的趨勢(shì)，且均低于對(duì)照組，表明這兩種添加物都可以不同程度地降低MP凝膠的蒸煮損失率。這可能是由于在加熱過(guò)程中，大豆分離蛋白、卡拉膠及肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)被充分打開(kāi)，分子間相互作用增強(qiáng)，使得凝膠網(wǎng)絡(luò)持水能力增強(qiáng)，從而減少蒸煮損失率[17]。值得注意的是，添加相同含量(≤4%)的大豆分離蛋白及卡拉膠，后者的MP凝膠蒸煮損失均較小，說(shuō)明卡拉膠對(duì)MP凝膠蒸煮損失的降低效果比大豆分離蛋白的好。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 大豆分離蛋白及卡拉膠對(duì)泥鰍肌原纖維蛋白凝膠蒸煮損失的影響Figure 3 Effects of soybean protein isolate and carrageenan on gel cooking loss of myofibrillar protein from loach

2.4 凝膠白度

由圖4可知，與對(duì)照組相比，不同含量(1%～5%)的大豆分離蛋白對(duì)MP凝膠白度均有一定的降低作用(P<0.05)，而卡拉膠對(duì)MP凝膠白度整體上呈增大作用。當(dāng)卡拉膠含量為5%時(shí)，MP凝膠白度最大，較對(duì)照組增加3.77%(P<0.05)。這主要是因?yàn)榇蠖狗蛛x蛋白外觀呈暗黃色，而卡拉膠為白色粉末，因而大豆分離蛋白的添加會(huì)降低整個(gè)體系的白度，而卡拉膠則與之相反。趙澤潤(rùn)等[12]在研究大豆分離蛋白對(duì)低鹽木質(zhì)化雞肉糜凝膠特性的影響時(shí)也得到類(lèi)似結(jié)論。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 大豆分離蛋白及卡拉膠對(duì)泥鰍肌原纖維蛋白凝膠白度的影響Figure 4 Effects of soybean protein isolate and carrageenan on gel whiteness of myofibrillar protein from loach

2.5 凝膠微觀結(jié)構(gòu)

由圖5可知，對(duì)照組MP凝膠為不均勻的、疏松的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這是由于肌原纖維蛋白受熱而變性展開(kāi)，又因降溫時(shí)的聚合作用相互交聯(lián)形成。隨著大豆分離蛋白含量的增加，MP凝膠出現(xiàn)較多孔洞，且孔徑越來(lái)越大。當(dāng)大豆分離蛋白含量≥4%時(shí)，疏松的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)明顯變得更加緊實(shí)，可能是由于大豆分離蛋白填充到肌原纖維蛋白凝膠的微觀空隙中造成的。由于大分子的填充以及蛋白質(zhì)分子間的相互作用使得復(fù)合凝膠的硬度增大，但網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)趨向于剛性結(jié)構(gòu)，造成彈性下降[18]。研究[19]表明，肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)與其保水性有關(guān)，若凝膠網(wǎng)絡(luò)均勻致密，則凝膠保水性高。這與試驗(yàn)結(jié)果相吻合。與大豆分離蛋白不同，添加1%的卡拉膠后，MP凝膠由疏松多孔的結(jié)構(gòu)變?yōu)閷哟畏置鞯木W(wǎng)絡(luò)狀；隨著卡拉膠添加量的繼續(xù)增加，MP凝膠又出現(xiàn)規(guī)則有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

圖5 大豆分離蛋白及卡拉膠對(duì)泥鰍肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Figure 5 Effects of soybean protein isolate and carrageenan on gel microstructure of myofibrillar protein from loach

2.6 凝膠二級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的紅外光譜特征譜帶主要由酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶組成。利用PeakFit軟件對(duì)酰胺Ⅰ帶進(jìn)行基線校正、去卷積和峰擬合，然后根據(jù)各擬合峰位置及峰面積可以對(duì)泥鰍肌原纖維蛋白凝膠二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量進(jìn)行分析。由圖6(a)可知，與對(duì)照組相比，添加大豆分離蛋白后，肌原纖維蛋白凝膠中β-折疊結(jié)構(gòu)有所下降，僅在添加量為3%時(shí)略高于對(duì)照組；無(wú)規(guī)則卷曲及a-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量均低于對(duì)照組，而轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)則較對(duì)照組顯著增加。這可能是由于大豆分離蛋白與肌原纖維蛋白復(fù)合物在形成凝膠的過(guò)程中產(chǎn)生了共價(jià)相互作用，促使肌原纖維蛋白的a-螺旋展開(kāi)，形成更多的轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)[20]。也有可能是因?yàn)榇蠖狗蛛x蛋白與肌原纖維蛋白是非共價(jià)結(jié)合，而大豆分離蛋白本身作為一種蛋白質(zhì)，對(duì)肌原纖維蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生了一定的影響[21]。

圖6 大豆分離蛋白及卡拉膠對(duì)泥鰍肌原纖維蛋白凝膠二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Figure 6 Effects of soybean protein isolate and carrageenan on gel secondary structure of myofibrillar protein from loach

與大豆分離蛋白不同，卡拉膠的添加使肌原纖維蛋白凝膠中無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)消失，β-折疊結(jié)構(gòu)大幅度上升，表明更多的蛋白質(zhì)分子之間靠氫鍵發(fā)生交聯(lián)，蛋白質(zhì)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得更加有序[22]，見(jiàn)圖6(b)。但a-螺旋及轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量呈不規(guī)律的變化，在添加量為1%，3%，5%時(shí)兩者的相對(duì)含量都增加，其余添加量時(shí)則相反，說(shuō)明凝膠的質(zhì)地性質(zhì)不僅僅與肌原纖維的β-折疊結(jié)構(gòu)有關(guān)，可能還取決于其a-螺旋和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。梁惲紅等[23]認(rèn)為，蛋白質(zhì)中a-螺旋向有序的β-折疊轉(zhuǎn)化時(shí)，更有利于形成規(guī)則有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。因此，推測(cè)凝膠網(wǎng)絡(luò)的有序性與β-折疊的數(shù)量呈正相關(guān)，與卡拉膠對(duì)泥鰍肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果一致。

3 結(jié)論

利用大豆分離蛋白和卡拉膠對(duì)泥鰍肌原纖維蛋白進(jìn)行改性，采用質(zhì)構(gòu)儀、色差儀、掃描電鏡和紅外光譜等探究其對(duì)泥鰍肌原纖維蛋白凝膠特性的影響。結(jié)果顯示，隨著大豆分離蛋白含量的增加，泥鰍肌原纖維蛋白凝膠硬度先降低后升高，彈性先升高后降低，保水性增加，蒸煮損失降低，凝膠網(wǎng)絡(luò)孔洞越來(lái)越大，各二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量發(fā)生變化；而卡拉膠對(duì)凝膠硬度和彈性有減弱作用，對(duì)白度及蒸煮損失有較好的改善作用，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)規(guī)則有序且無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)消失。