伍依琪 梁志森 陳玉珍 周 睿 林曉君

(1. 廣州檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)有限公司，廣東 廣州 511447；2. 國(guó)家加工食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心〔廣東〕，廣東 廣州 511447)

黃酮類化合物廣泛分布在自然界中，是植物在長(zhǎng)期自然選擇過程中產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物[1]。其中，4’-羥基漢黃岑素、去甲漢黃岑素、黃岑素、漢黃岑素和漢黃岑苷是黃岑等植物提取物的主要活性成分，具有護(hù)肝[2]、抗氧化[3-4]、抗糖尿病[5]、抗炎、保護(hù)神經(jīng)[6]、抗纖維化[7]、抗病毒、抗癌[8]等作用。白楊素又稱白楊黃素，具有多種藥理作用，如抗腫瘤活性[9]、改善體重和脂質(zhì)代謝作用[10]、抗抑郁作用[11]、神經(jīng)保護(hù)作用[12]、治療皮膚病[13]等。由于黃岑素類化合物對(duì)預(yù)防各類疾病的功效優(yōu)異，因此容易被不法商家用作保健食品的虛假功效宣傳。另一方面，隨著黃酮類化合物在保健食品中的開發(fā)和利用，過量攝入相關(guān)成分對(duì)人體的危害尚未明確，這些產(chǎn)品可能會(huì)帶來潛在健康風(fēng)險(xiǎn)，因而對(duì)黃芩素含量的測(cè)定研究對(duì)保健食品價(jià)值的評(píng)價(jià)具有重要意義[14]。

目前黃岑素類化合物測(cè)定的方法主要集中在高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法[15-18]，其分離效能高，靈敏度高，應(yīng)用范圍廣，檢測(cè)成本低，操作簡(jiǎn)單，適用于常規(guī)的日常檢測(cè)工作。黃酮類化合物的提取方法中，較多使用超聲提取法，該方法較常規(guī)提取方法具有溫度低、效率高、能耗低、節(jié)省溶劑等優(yōu)點(diǎn)[19]，但往往提取雜質(zhì)較多，嚴(yán)重影響分析結(jié)果。研究擬采用HPLC技術(shù)，建立對(duì)漢黃岑苷、4’-羥基漢黃岑素、去甲漢黃岑素、黃岑素、漢黃岑素、白楊素6種黃酮類化合物含量同時(shí)測(cè)定的方法，并驗(yàn)證上述6種黃酮類成分在不同類別保健食品中的方法學(xué)數(shù)據(jù)，以期為后續(xù)保健食品中黃酮類化合物的分析研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

保健食品(維生素片和膠原鈣片各5份)：市售；

4’-羥基漢黃岑素(CAS 57096-02-3)、去甲漢黃岑素(CAS 4443-09-8)、漢黃岑素(CAS 632-85-9)：純度≥98%，武漢天植生物技術(shù)有限公司；

黃岑素(CAS 491-67-8)：純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；

白楊素(CAS 480-40-0)、漢黃岑苷(CAS 51059-44-0)：純度≥98%，上海吉至生化科技有限公司；

乙腈、甲醇、丙酮：色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

甲酸、乙酸：分析純，美國(guó)Sigma Aldrich公司；

二甲亞砜：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；

C18固相萃取小柱(60 mg，3 mL)：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

Atiantis T3(150 mm×4.6 mm，5 μm)：沃特世科技(上海)有限公司；

Thermo C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)：賽默飛世爾科技有限公司；

Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)：美國(guó)飛諾美公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：Waters Alliance E2695型，沃特世科技(上海)有限公司；

超純水系統(tǒng)：Milli-Q Advantage A10型，法國(guó)Merck Millipore公司；

超聲波清洗器：KQ3200V型，昆山市超聲儀器有限公司；

離心機(jī)：4k-15型，美國(guó)西格瑪公司；

渦旋混勻器：IKA Vortex4型，德國(guó)IKA公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的前處理 樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎、混勻，分裝于潔凈盛樣袋中待用。稱取樣品2.00 g于50 mL離心管中，加入10 mL丙酮，渦旋混勻，超聲提取10 min，渦旋，8 000 r/min離心，取2 mL樣液加入10 mL純化水，混勻后全部移入C18固相萃取小柱，再用5 mL丙酮洗脫，收集流出液，40 ℃氮吹近干，用丙酮復(fù)溶，并準(zhǔn)確定容至1 mL，過0.22 μm尼龍膜，待測(cè)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取黃岑素、漢黃岑素、漢黃岑苷、白楊素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于10 mL棕色容量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度，準(zhǔn)確稱取4’-羥基漢黃岑素、去甲漢黃岑素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于10 mL棕色容量瓶，用二甲亞砜溶解并稀釋至刻度，均配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4 ℃下避光保存，有效期1個(gè)月。分別移取1 mL上述6種目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至10 mL容量瓶中，用50%乙腈水溶液配制成100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。選取不含6種目標(biāo)化合物的保健食品(維生素片和膠原鈣片)，按照1.2.1的方法制備樣品空白基質(zhì)溶液。取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用維生素片和膠原鈣片樣品空白基質(zhì)溶液分別配制質(zhì)量濃度為0.0，1.0，2.0，4.0，8.0，12，20 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.3 色譜條件 色譜柱為Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為2%乙酸溶液。梯度洗脫程序：0～2 min，20% A；2～5 min，20%～40% A；5～11 min，40% A；11～28 min，40%～43% A；28～30 min，20% A。流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

1.2.4 回收率的計(jì)算 按照1.2.1的方法，稱取均勻后的樣品，在樣品中添加3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平平行測(cè)定3次計(jì)算平均回收率。

1.2.5 精密度的計(jì)算 按照1.2.1的方法，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，在24 h內(nèi)，每個(gè)水平測(cè)定6個(gè)平行樣。所得結(jié)果計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 測(cè)量數(shù)據(jù)采用儀器分析軟件進(jìn)行采集和處理，使用Origin 8.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的優(yōu)化 考察了乙腈、甲醇、0.5%甲酸水溶液、2%甲酸水溶液、0.5%乙酸水溶液、2%乙酸水溶液等不同流動(dòng)相體系及不同流動(dòng)相的配比對(duì)目標(biāo)物色譜峰形的影響。結(jié)果表明，需要較大比例的甲醇才能將目標(biāo)物洗脫出來，乙腈比甲醇的洗脫能力更強(qiáng)。因此，用乙腈作為有機(jī)相可使溶劑消耗更小，有利于節(jié)省有機(jī)溶劑的成本，2%乙酸水溶液作為水相比甲酸水溶液體系的目標(biāo)物色譜峰形的分離度更高。

2.1.2 色譜柱的選擇 考察了Atiantis T3(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Thermo C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3種色譜柱對(duì)目標(biāo)物色譜峰形的影響。結(jié)果表明，Atiantis T3色譜柱雖然目標(biāo)物出峰時(shí)間快，但是去甲漢黃岑素、黃岑素的目標(biāo)峰有部分重疊難分開，基線波動(dòng)大，Thermo C18色譜柱目標(biāo)物的峰形比Phenomenex Luna C18色譜柱的差，Phenomenex Luna C18色譜柱的分離效果較為理想，基線平穩(wěn)，因此，采用Phenomenex Luna C18色譜柱進(jìn)行測(cè)定。

以維生素片和膠原鈣片作為空白基質(zhì)溶液，6種目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度均為10 mg/L，根據(jù)上述最優(yōu)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示各峰分離情況良好，如圖1、圖2所示。

1. 漢黃岑苷 2. 4’-羥基漢黃岑素 3. 去甲漢黃岑素 4. 黃岑素5. 漢黃岑素 6. 白楊素圖1 維生素片基質(zhì)中6種黃酮類化合物色譜圖Figure 1 Chromatogram of 6 flavonoids in vitamin tablet matrix

1. 漢黃岑苷 2. 4’-羥基漢黃岑素 3. 去甲漢黃岑素 4. 黃岑素5. 漢黃岑素 6. 白楊素圖2 膠原鈣片基質(zhì)中6種黃酮類化合物色譜圖Figure 2 Chromatographic diagram of 6 flavonoids in collagen calcium tablet matrix

2.2 方法的驗(yàn)證

以目標(biāo)物的濃度(X)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。維生素片、膠原鈣片基質(zhì)中漢黃岑苷、4’-羥基漢黃岑素、去甲漢黃岑素、黃岑素、漢黃岑素、白楊素的線性方程見表1。結(jié)果表明，維生素片和膠原鈣片基質(zhì)中漢黃岑苷、4’-羥基漢黃岑素、去甲漢黃岑素、黃岑素、漢黃岑素、白楊素在0～20 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系。同時(shí)，按照1.2.2 的方法配制目標(biāo)物的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，以外標(biāo)法進(jìn)行定量。選用陰性樣品進(jìn)行低濃度加標(biāo)，根據(jù)儀器的信噪比3倍(S/N=3)和10倍(S/N=10)的標(biāo)準(zhǔn)確定方法檢出限(LOD)和方法定量限(LOQ)[20]，維生素片、膠原鈣片基質(zhì)中漢黃岑苷、4’-羥基漢黃岑素、去甲漢黃岑素、黃岑素、漢黃岑素、白楊素的LOD和LOQ見表1。

表1 空白基質(zhì)中6中目標(biāo)物的線性關(guān)系、檢出限和定量限Table 1 Linear relationship, limit of detection and limit of quantification of 6 targets in blank matrix

2.3 儀器測(cè)定精密度試驗(yàn)

分別吸取維生素片和膠原鈣片基質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度為10 mg/L，按1.2.3儀器條件進(jìn)行連續(xù)進(jìn)樣6次的測(cè)定，結(jié)果表明，維生素片基質(zhì)中漢黃岑苷、4’-羥基漢黃岑素、去甲漢黃岑素、黃岑素、漢黃岑素、白楊素的精密度分別為1.38%，0.59%，1.06%，0.80%，0.79%，1.17%，膠原鈣片基質(zhì)中漢黃岑苷、4’-羥基漢黃岑素、去甲漢黃岑素、黃岑素、漢黃岑素、白楊素的精密度分別為1.27%，1.31%，0.74%，0.54%，1.53%，0.42%，表明此方法的精密度良好。

2.4 空白基質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別吸取維生素片和膠原鈣片基質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度為10 mg/L，按1.2.3儀器條件于0，6，12，24，48 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明，維生素片基質(zhì)中漢黃岑苷、4’-羥基漢黃岑素、去甲漢黃岑素、黃岑素、漢黃岑素、白楊素的RSD分別為1.82%，2.95%，1.77%，0.56%，3.08%，3.05%，膠原鈣片基質(zhì)中漢黃岑苷、4’-羥基漢黃岑素、去甲漢黃岑素、黃岑素、漢黃岑素、白楊素的RSD分別為1.27%，1.31%，0.74%，0.54%，1.53%，0.42%，表明這兩種基質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在48 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.5 空白基質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加標(biāo)回收試驗(yàn)

由于保健食品中6種黃酮類化合物含量差異較大，雖然有較多的樣品呈陰性，但為了貼合實(shí)際測(cè)定，選擇經(jīng)1.2.1處理測(cè)定后，漢黃岑素本底含量分別為1.95 mg/kg的維生素片和本底含量為1.88 mg/kg的膠原鈣片樣品進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)。采用外加法，分別向樣品中添加3個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，添加量分別為本底值的0.5，1.0，5.0倍，即1.00，2.00，10.00 mg/kg，每個(gè)水平在同等條件下進(jìn)行3個(gè)平行樣品測(cè)定，回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果見表2、表3。結(jié)果表明，上述兩種基質(zhì)的加標(biāo)回收率在83%～100%，精密度RSD在1.06%～4.63%，該方法的回收率高，穩(wěn)定性好。

表2 維生素片基質(zhì)中6種黃酮類化合物的回收率和精密度Table 2 Recovery and precision of six flavonoids in vitamin tablet matrix

表3 膠原鈣片基質(zhì)中6種黃酮類化合物的回收率和精密度Table 3 Recovery and precision of 6 flavonoids from collagen calcium tablet matrix

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

根據(jù)優(yōu)化后的方法對(duì)市售8個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)定，8個(gè)樣品中有2個(gè)樣品檢出漢黃岑苷，含量分別為882，651 mg/kg，2個(gè)樣品檢出黃岑素，含量分別為436，138 mg/kg，2個(gè)樣品檢出漢黃岑素，含量分別為125，51 mg/kg。4’-羥基漢黃岑素、去甲漢黃岑素、白楊素均未檢出。圖3為維生素片陰性樣品的色譜圖，圖4為維生素片陽性樣品色譜圖，其中漢黃岑素檢出值為51 mg/kg。

圖3 維生素片陰性樣品色譜圖Figure 3 Chromatograms of vitamin tablet-negative samples

圖4 維生素片陽性樣品色譜圖Figure 4 Chromatograms of vitamin tablet-positive samples

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定保健食品中漢黃岑苷、4’-羥基漢黃岑素、去甲漢黃岑素、黃岑素、漢黃岑素、白楊素的高效液相色譜的分析方法，通過優(yōu)化流動(dòng)相體系、梯度洗脫程序和色譜柱等色譜條件，使6種黃酮類化合物在30 min內(nèi)完全出峰，且分離度和峰形均良好；通過維生素片和膠原鈣片這兩種基質(zhì)考察了該方法的精密度、穩(wěn)定性以及不同濃度的加標(biāo)試驗(yàn)，回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果表明該方法能滿足日常檢測(cè)的要求且操作簡(jiǎn)單，回收率高，重現(xiàn)性好，經(jīng)濟(jì)成本較低，方便高效，適用于保健食品中漢黃岑苷、4’-羥基漢黃岑素、去甲漢黃岑素、黃岑素、漢黃岑素、白楊素6種黃酮類化合物的檢測(cè)分析。