李 帥 袁亞宏 岳田利

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712100)

據(jù)最新調(diào)查結(jié)果[1]顯示，中國(guó)高血壓病人約占總?cè)丝诘?3.2%，其中控制率僅有15.3%。預(yù)計(jì)至2025年，全球高血壓人數(shù)將漲到16億左右，而中國(guó)將是位居榜首的國(guó)家[2]。高血壓作為人類的“無(wú)聲殺手”，常導(dǎo)致心肌梗塞、腦出血等嚴(yán)重危害人類生命的心血管和腦疾病[3]。研究[4]表明，人體血壓受到很多系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，其中激肽釋放酶—激肽和腎素—血管緊張素系統(tǒng)作為互相拮抗的兩個(gè)系統(tǒng)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，二者平衡失調(diào)是引起高血壓發(fā)病的主要因素之一。在該系統(tǒng)中，肝源性血管緊張素原被腎素裂解，形成非活性十肽血管緊張素I，繼而被血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)酶解為八肽血管緊張素II(一種有效的血管收縮劑)。此外，ACE代謝九肽的舒緩激肽(bradykinin，BK，一種血管擴(kuò)張劑)，轉(zhuǎn)化為不活躍的BK-(1-7)和BK-(1-5)[5]。因此，由于ACE在血管系統(tǒng)中具有雙重直接作用，抑制其已成為治療高血壓的主要靶點(diǎn)。然而ACE抑制劑藥物具有高效的降血壓作用時(shí)，也會(huì)產(chǎn)生諸多副作用，甚至藥物依賴性[6]。研究[7]表明，很多食物中含有預(yù)防或治療高血壓的生物活性肽，具有安全性高、副作用小的特點(diǎn)，逐漸成為降血壓藥物替代品的首選。迄今為止，乳類[8]、肉類[9]、蛋類[10]、海洋生物[11]、植物[12]均是制備ACE抑制肽的豐富來源。

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)產(chǎn)于南美洲，其蛋白含量豐富且比例平衡，含有全部天然氨基酸，是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推薦的唯一全營(yíng)養(yǎng)食品[13-14]。藜麥作為偽谷物不含麩質(zhì)，易消化吸收，能避免引起胃腸道的過敏反應(yīng)[15-16]。且藜麥?zhǔn)且环N潛在的生物活性肽制備來源，來自藜麥蛋白的肽已被證明能夠發(fā)揮一些有益的作用，如Vilcacundo等[17]發(fā)現(xiàn)藜麥蛋白消化物中釋放的肽在胃十二指腸中抑制DPP-IV、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性，從而表現(xiàn)出有效的體外抗糖尿病特性。并且Vilcacundo等[18]還報(bào)告了上述消化物在結(jié)腸癌細(xì)胞中的抗增殖作用以及抗氧化特性。<5 kDa的肽分離組分表現(xiàn)出更高的抗氧化活性，而含有>5 kDa肽的組分表現(xiàn)出更高的抗增殖活性。此外藜麥水解肽在抗炎、降膽固醇、抗高血壓等方面均表現(xiàn)出積極作用[19-20]。盡管如此，關(guān)于藜麥ACE抑制活性的研究還較少，且目前多采用酶解方式制備降壓肽，微生物發(fā)酵應(yīng)用較少[21]。而利用酶水解時(shí)酶的切割位點(diǎn)較為固定，可采用的商業(yè)酶種類較少，利用復(fù)合酶會(huì)提高經(jīng)濟(jì)成本且在酶解前需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。微生物發(fā)酵法逐漸成為一種有效的水解手段，具有簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)、不會(huì)造成必需氨基酸損失的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)可以提高發(fā)酵物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和感官屬性[22-23]。目前常用的發(fā)酵菌株如乳酸菌、芽孢桿菌屬、釀酒酵母、漢遜酵母等都是富產(chǎn)蛋白酶的菌種，可以利用自身所產(chǎn)的蛋白酶系酶解底物蛋白，制備具有ACE抑制活性的多肽。

研究擬以藜麥為原料，采用微生物發(fā)酵法制備藜麥ACE抑制發(fā)酵液，通過比較ACE抑制活性篩選出優(yōu)勢(shì)益生菌，并對(duì)其制備條件進(jìn)行優(yōu)化；同時(shí)對(duì)發(fā)酵液中的肽進(jìn)行液質(zhì)鑒定，并對(duì)篩選出的肽進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)，以期篩選出有望用于降血壓功能食品或者藥品研發(fā)的高效肽。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

藜麥：繁峙縣懿康土特產(chǎn)有限公司；

原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)、Wistar-Kyoto大鼠(WKY)：北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；

MRS肉湯：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

來自兔肺(A6778-1UN)的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、N-馬尿酰-L-組氨酰-L-亮氨酸水合物(HHL)：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

三氟乙酸：色譜級(jí)，上海麥克林生化科技有限公司；

乙腈：色譜級(jí)，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆?/p>

卡托普利：濟(jì)南永寧制藥股份有限公司；

NIFRPFAPEL、AALEAPRILNL：≥95%，上海三工生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：FW-400AD型，天津鑫博得儀器有限公司；

恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱：TS-100B型，上海善志儀器設(shè)備有限公司；

立式高壓蒸汽滅菌器：LDZX-50L-I型，上海申安醫(yī)療器械廠；

高速冷凍離心機(jī)：HC-3018R型，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：HSQ-1型，上海智城分析儀器有限公司；

高效液相色譜儀：LC-20A型，日本島津公司；

無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)：CODATMMonitor型，美國(guó)Kent Scientific公司。

1.1.3 試驗(yàn)菌株

18株乳酸菌(動(dòng)物雙歧桿菌BifidobacteriumanimalisB15、動(dòng)物雙歧桿菌BifidobacteriumanimalisB16、兩歧雙歧桿菌BifidobacteriumbifidumB17、嗜酸乳桿菌BifidobacteriumbifidumB18、短乳桿菌LactobacillusbrevisL1、副干酪乳桿菌LactobacillusparacaseiL2、鼠李糖乳桿菌LactobacillusrhamnosusL8、類植物乳桿菌LactobacillusparaplantarumsL13、嗜酸乳桿菌LactobacillusacidophilusYTL1、鼠李糖乳桿菌LactobacillusrhamnosusYTL2、短乳桿菌LactobacillusbrevisYTL3、消化乳桿菌DigestionofLactobacillusYTL4、植物乳桿菌LactobacillusparaplantarumsYTL5、植物乳桿菌LactobacillusparaplantarumsYTL6、發(fā)酵乳桿菌LactobacillusfermentumYTL7、戊糖乳桿菌LactobacilluspentosusYTL8、副干酪乳桿菌LactobacillusparacaseiYTL9、干酪乳桿菌LactobacilluscaseiYTL10)和12株酵母菌(異常畢赤PichiaanomalaH2、H5、H7、H10，釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeHansenWF1、WF17、WF38、WF58、WLS21、PF14、YN6、4#)：西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院健康食品制造與安全控制研究實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化 將保存在-80 ℃，30%甘油中的乳酸菌和酵母按1%的比例分別接種在無(wú)菌MRS肉湯和YPD培養(yǎng)基中，使乳酸菌和酵母單獨(dú)復(fù)蘇并繁殖，并在37 ℃下培養(yǎng)24 h。每種益生菌進(jìn)行兩次傳代培養(yǎng)，得到發(fā)酵種子液。

1.2.2 藜麥發(fā)酵液的制備 將藜麥種子用粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，得到藜麥面粉。藜麥面粉在密封容器中于121 ℃干熱滅菌15 min[24-25]。向面粉中按10 mL/100 g的接種量加入發(fā)酵種子液，將面粉與無(wú)菌水以m面粉∶V無(wú)菌水為1∶2 (g/mL)的比例混合后，接種乳酸菌的面粉在37 ℃培養(yǎng)箱中固態(tài)發(fā)酵72 h；酵母在28 ℃培養(yǎng)箱中固態(tài)發(fā)酵72 h。發(fā)酵結(jié)束后，將藜麥發(fā)酵物在蒸餾水中以m發(fā)酵物∶V無(wú)菌水為1∶10 (g/mL)的比例稀釋，然后在室溫[(25±2) ℃]下攪拌1 h。將獲得的混合物于4 ℃、5 400 r/min離心10 min，上清液經(jīng)Whatman定性濾紙過濾，于-20 ℃貯藏供下一步分析[26]。

1.2.3 ACE抑制活性的測(cè)定 參考Deng等[6]的方法，修改如下：將50 μL發(fā)酵液與30 μL HHL混合預(yù)熱5 min，添加ACE開始反應(yīng)。在37 ℃下保持反應(yīng)30 min，然后添加80 μL 1 mol/L HCl以停止反應(yīng)。溶液過0.45 μm的濾膜，將10 μL反應(yīng)溶液注入配備安捷倫TC-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)的RP-HPLC中，以測(cè)量馬尿酸(HA)的濃度。色譜條件：流動(dòng)相乙腈/超純水(0.1% TFA)的比例為25/75，等度洗脫，流速為0.5 mL/min，柱溫為30 ℃。按式(1)計(jì)算ACE抑制活性。

(1)

式中：

R——ACE抑制活性，%；

A——空白對(duì)照組測(cè)定得到的馬尿酸峰面積；

B——添加樣品后測(cè)定得到的馬尿酸峰面積。

在測(cè)定條件下抑制50% ACE活性所需的樣品濃度定義為IC50。

1.2.4 高ACE抑制菌株的篩選 將18株乳酸菌和12株酵母菌分別發(fā)酵藜麥制備降壓肽，以無(wú)菌接種的面粉為對(duì)照組，對(duì)得到的發(fā)酵液進(jìn)行ACE抑制活性測(cè)定，篩選出具有高抑制活性的乳酸菌或酵母菌株。

1.2.5 單因素試驗(yàn) 選取接種量(5.0%，7.5%，10.0%，12.5%，15.0%)(固定水平為10.0%)、發(fā)酵時(shí)間(24，48，72，96，120 h)(固定水平為72 h)、發(fā)酵溫度(31，34，37，40，43 ℃)(固定水平為37 ℃)3個(gè)因素的5個(gè)水平進(jìn)行單因素試驗(yàn)，通過對(duì)各個(gè)條件下制備的藜麥發(fā)酵液的ACE抑制率進(jìn)行測(cè)定，選取較優(yōu)的條件進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.2.6 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取3個(gè)試驗(yàn)因素中各自較優(yōu)的3個(gè)水平，以ACE抑制率為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最佳發(fā)酵工藝。

1.2.7 發(fā)酵液中肽的液質(zhì)鑒定及篩選 使用配備有納流毛細(xì)管液相色譜Easy-nLC 1200的三合一超高分辨組合液質(zhì)聯(lián)用儀鑒定ACE發(fā)酵液中的肽段。將凍干樣品溶解在含有0.1%甲酸的去離子水中，進(jìn)行納米液相色譜分離。流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的超純水，流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的乙腈—超純水(V乙腈∶V超純水=4∶1)。梯度洗脫過程：B相在50 min內(nèi)由4%線性增加到50%，在隨后的4 min內(nèi)B相增加到100%，并保持6 min。洗脫肽的序列鑒定采用MS/MS分析，標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量30%；掃描范圍m/z375～1 500。質(zhì)譜原始文件使用Proteome Discovered 2.2 檢索NCBI和BIOPEP藜麥蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選。

1.2.8 體內(nèi)試驗(yàn) 將24只11周齡雄性SHR，18只WKY在標(biāo)準(zhǔn)條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。SHR隨機(jī)分成數(shù)量相等的生理鹽水組、NIFRPFAPEL組、AALEAPRILNL組和卡托普利組4組。同樣的，WKY隨機(jī)分成數(shù)量相等的NIFRPFAPEL、AALEAPRILNL和生理鹽水3組。各組均以10 mg/kg·BW的劑量標(biāo)準(zhǔn)灌胃，然后采用CODATM Monitor測(cè)定大鼠灌胃0，2，4，6，8 h時(shí)尾動(dòng)脈的收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP)，以觀察血壓變化。根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院第85-23號(hào)出版物，修訂版)，所有動(dòng)物都接受了人道護(hù)理。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)中ACE抑制活性的測(cè)定均進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過SPSS 18.0版對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并使用軟件Origin 2018繪圖。使用方差分析(ANOVA)中的Duncan檢驗(yàn)來測(cè)試平均值之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 高ACE抑制活性菌株的篩選

由圖1可知，作為對(duì)照的未經(jīng)益生菌發(fā)酵的藜麥，其ACE抑制率為(52.06±3.60)%，表明藜麥本身就具有較好的ACE抑制活性。其中25株菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的藜麥發(fā)酵液的ACE抑制率較對(duì)照組顯著提高(P<0.05)，抑制效果最好的菌株為L(zhǎng)actobacillusparacaseiL2(副干酪乳桿菌)，發(fā)酵液的ACE抑制率高達(dá)(86.50±0.25)%，顯著高于除LactobacillusrhamnosusL8(鼠李糖乳桿菌)以外的菌株發(fā)酵液的(P<0.05)，其次為鼠李糖乳桿菌L8，其ACE抑制率為(85.74±0.62)%。3株菌固態(tài)發(fā)酵藜麥后的ACE抑制率與對(duì)照組無(wú)顯著差異，分別為釀酒酵母4#、WF38和嗜酸乳桿菌B18，2株菌固態(tài)發(fā)酵藜麥后的ACE抑制率顯著降低(P<0.05)，分別為短乳桿菌YTL3和發(fā)酵乳桿菌YTL7，表明大多益生菌能夠在生長(zhǎng)繁殖過程中，利用自身的酶分解藜麥產(chǎn)生具有ACE抑制活性的物質(zhì)，而少數(shù)菌則利用一些ACE抑制活性物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致發(fā)酵液的ACE抑制率下降。藜麥發(fā)酵液的ACE抑制活性因菌株的不同而顯現(xiàn)出不同的效果。Ayyash等[24-25]利用雙歧桿菌、乳酸菌羅伊氏乳桿菌K777和植物乳桿菌K779，對(duì)奎奴亞藜采用固態(tài)發(fā)酵法進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，也表現(xiàn)出ACE抑制活性增強(qiáng)作用。試驗(yàn)中的副干酪乳桿菌L2的ACE抑制作用高于Ayyash等[24-25]報(bào)道的幾株菌，表明副干酪乳桿菌L2是一株潛在的利用藜麥蛋白的優(yōu)勢(shì)菌株。因此，選取該菌株作為后續(xù)研究的目標(biāo)菌株。

字母不同表示有顯著性差異(P<0.05)圖1 30株益生菌發(fā)酵藜麥制備的發(fā)酵液的ACE抑制率Figure 1 ACE inhibition rate of fermentation broth prepared by fermenting quinoa with 30 probiotic strains

2.2 發(fā)酵藜麥制備ACE抑制肽的單因素試驗(yàn)

2.2.1 接種量對(duì)制備ACE抑制肽的影響 由圖2可以看出，藜麥發(fā)酵液的ACE抑制率隨接種量的變大先增后降，在接種量為7.5%時(shí)藜麥發(fā)酵液的ACE抑制率最高。這是由于接種量較低時(shí)，菌株無(wú)法充分分解藜麥，產(chǎn)生的ACE抑制活性物質(zhì)較少，致使ACE抑制活性較低；而接種量較高時(shí)，菌株會(huì)利用分解得到的ACE抑制活性物質(zhì)為其生長(zhǎng)繁殖提供營(yíng)養(yǎng)，從而造成ACE抑制率下降。故將7.5%作為制備降壓藜麥發(fā)酵液最佳的接種量。

字母不同表示有顯著性差異(P<0.05)圖2 接種量對(duì)制備ACE抑制肽的影響Figure 2 Effects of inoculum on preparation of ACE inhibitory peptides

2.2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)制備ACE抑制肽的影響 由圖3可以看出，藜麥發(fā)酵液的ACE抑制率隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)先增長(zhǎng)后下降。在發(fā)酵72 h時(shí)，藜麥發(fā)酵液的ACE抑制活性最強(qiáng)。再延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，ACE抑制活性不增反降，可能是由于發(fā)酵液中的菌株過多，藜麥分解成ACE抑制活性物質(zhì)的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及其生長(zhǎng)和繁殖所需的量，從而導(dǎo)致發(fā)酵液中的活性物質(zhì)含量下降，對(duì)ACE的抑制率也隨之降低。故將72 h作為菌株發(fā)酵藜麥最適發(fā)酵時(shí)間。

字母不同表示有顯著性差異(P<0.05)圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)制備ACE抑制肽的影響Figure 3 Effects of fermentation time on preparation of ACE inhibitory peptides

2.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)制備ACE抑制肽的影響 如圖4所示，發(fā)酵液ACE抑制率隨發(fā)酵溫度的升高先緩慢增加后下降，在34 ℃達(dá)到最大。這可能是由于在34 ℃時(shí)，該菌株能夠適應(yīng)生長(zhǎng)，且是所產(chǎn)蛋白酶的最適酶解溫度，隨著溫度的繼續(xù)增加，菌株偏離適宜生長(zhǎng)溫度和蛋白酶最適酶解溫度，降壓活性物質(zhì)制備量減少，ACE抑制率下降。故將34 ℃作為制備降壓藜麥發(fā)酵液的最佳發(fā)酵溫度。

字母不同表示有顯著性差異(P<0.05)圖4 發(fā)酵溫度對(duì)制備ACE抑制肽的影響Figure 4 Effects of fermentation temperature on preparation of ACE inhibitory peptides

2.3 發(fā)酵藜麥制備ACE抑制肽的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定正交試驗(yàn)的因素與水平取值見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 藜麥發(fā)酵條件正交試驗(yàn)因素及水平Table 1 Orthogonal test factors and levels of quinoa fermentation conditions

表2 L9(34)正交試驗(yàn)Table 2 L9(34) Orthogonal test

根據(jù)表2可知，各因素對(duì)藜麥發(fā)酵液的ACE抑制率影響大小依次為C>B>A，制備藜麥發(fā)酵液的最優(yōu)組合為C2B2A2。如表3所示，基于藜麥發(fā)酵液ACE抑制率建立的模型P值<0.05，表明該模型顯著，說明該模型擬合程度較好。根據(jù)結(jié)果表明，3個(gè)因素對(duì)藜麥發(fā)酵液ACE抑制率均有顯著影響。通過各因素水平間的方差分析表明，接種量為5%和7.5%時(shí)，ACE抑制率顯著高于10%；發(fā)酵時(shí)間為48 h和72 h時(shí)，ACE抑制率顯著高于24 h；發(fā)酵溫度為34 ℃和37 ℃時(shí)，ACE抑制率顯著高于31 ℃。結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果，C2B2A1和C2B2A2均可作為最優(yōu)水平組合。

表3 正交試驗(yàn)方差分析表?Table 3 Orthogonal test ANOVA table

通過對(duì)兩個(gè)最優(yōu)組合的發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C2B2A1和C2B2A2的ACE抑制率分別為(90.41±0.16)%，(89.55±0.18)%，故選取C2B2A1作為最優(yōu)藜麥發(fā)酵條件，即接種量為5%，發(fā)酵時(shí)間為48 h，發(fā)酵溫度為34 ℃。

2.4 發(fā)酵液中肽的液質(zhì)鑒定及篩選

通過質(zhì)譜對(duì)發(fā)酵液鑒定后，得到的肽段較多無(wú)法全部合成檢驗(yàn)其降壓效果。比對(duì)BIOPEP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出了最具有潛在降壓能力的肽段AALEAPRILNL和與文獻(xiàn)[27]的NIFRPF有一段相同序列的肽段NIFRPFAPEL進(jìn)行了合成，通過體外活性測(cè)定其IC50值分別為(79.72±0.21)，(49.02±0.54) μmol/L，ACE抑制活性較好。兩條肽的質(zhì)譜圖見圖5。

圖5 ACE抑制肽NIFRFAPEL和AALEAPRILNL的MS/MS譜圖Figure 5 MS/MS spectrum of ACE inhibitory peptides NIFRPFAPEL and AALEAPRILNL

2.5 體內(nèi)試驗(yàn)

對(duì)NIFRPFAPEL、AALEAPRILNL體內(nèi)降壓效果進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見圖6。

由圖6(a)和圖6(b)可知，灌胃NIFRPFAPEL對(duì)SHR有顯著的降壓效果，0～4 h時(shí)，SHR的SBP、DBP均逐漸降低，在4 h時(shí)達(dá)到最低，分別下降了(2.67±0.21)，(3.46±0.01) kPa；4 h后藥效減弱，血壓逐漸回升，在8 h時(shí)基本回升至初始血壓，表明NIFRPFAPEL體內(nèi)降壓效果顯著。灌胃AALEAPRILNL對(duì)SHR的降血壓趨勢(shì)與灌胃NIFRPFAPEL類似，在灌胃4 h時(shí)血壓下降最多，分別下降了(29.36±0.54)，(22.33±0.77) kPa，表明AALEAPRILNL也是一種具有較好的體內(nèi)降壓效果的肽段。

NIFRPFAPEL和AALEAPRILNL均能在體內(nèi)發(fā)揮一定的降壓作用，4 h時(shí)二者的血壓下降至最低，然而二者的降血壓效果卻有所差異。相同劑量下，AALEAPRILNL的SBP降血壓效果比NIFRPFAPEL好，而其DBP降血壓效果比NIFRPFAPEL略差。這與兩個(gè)肽的體外抑制效果表現(xiàn)出了不同的情況，說明肽進(jìn)入體內(nèi)還會(huì)因其不同生化性質(zhì)導(dǎo)致效果發(fā)生變化，因此進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)是驗(yàn)證其活性大小最有效的方法。在對(duì)比8 h時(shí)的數(shù)據(jù)可以看出NIFRPFAPEL和AALEAPRILNL的SBP、DBP血壓下降值均回升至初始血壓值附近，表明兩種肽的降壓持久性相似。

在灌胃卡托普利之后，SHR的SBP和DBP均持續(xù)降低，在6 h時(shí)降到最低，分別降低了44.38，55.69 kPa，在第8 h時(shí)SHR的血壓有所回升。與之相比，NIFRPFAPEL和AALEAPRILNL能夠在短時(shí)間內(nèi)使SHR血壓下降到最低值。說明NIFRPFAPEL和AALEAPRILNL具有顯著的降壓作用，但降壓效果和持久性不如卡托普利。

圖6(c)和圖6(d)分別為灌胃WKY同等劑量的NIFRPFAPEL、AALEAPRILNL和生理鹽水8 h內(nèi)大鼠的SBP和DBP變化情況，經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)，分別灌胃NIFRPFAPEL和AALEAPRILNL后WKY的SBP和DBP值與0 h WKY的無(wú)明顯差異(P>0.05)，表明NIFRP-FAPEL和AALEAPRILNL對(duì)WKY血壓無(wú)影響。

圖6 灌胃各樣品后大鼠8 h內(nèi)的血壓變化圖Figure 6 Changes of blood pressure in rats within 8 hours after gavage of each sample

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，LactobacillusparacaseiL2菌株發(fā)酵藜麥制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制發(fā)酵液的最佳發(fā)酵條件為接種量5%，發(fā)酵時(shí)間48 h，發(fā)酵溫度34 ℃，在此條件下血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制率最高達(dá)(90.41±0.16)%。通過液質(zhì)鑒定和篩選得到的兩條抑制效果較好的肽NIFRPFAPEL和AALEAPRILNL，其原發(fā)性高血壓大鼠體內(nèi)試驗(yàn)均能夠在大鼠體內(nèi)顯現(xiàn)出顯著的降血壓作用，且均對(duì)Wistar-Kyoto大鼠的血壓不產(chǎn)生影響。綜上，藜麥?zhǔn)且环N優(yōu)良的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制發(fā)酵液制備來源，能夠作為降血壓功能食品的原料。根據(jù)體內(nèi)試驗(yàn)推測(cè)，NIFRPFAPEL和AALEAPRILNL不會(huì)對(duì)正常人群的血壓造成影響，在降血壓功能食品或者藥品研發(fā)方面有重要的潛力。