許迪雅 張海曼 張 新 張雅丹 王 芳 張 琳

(1. 特醫(yī)食品加工湖南省重點(diǎn)實驗室，湖南 長沙 410000；2. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410000；3. 食品安全監(jiān)測與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實驗室，湖南 長沙 410117；4. 湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗研究院，湖南 長沙 410117)

銅是人體內(nèi)必不可少的微量金屬元素，其需求量僅次于鐵和鋅[1]。但體內(nèi)銅離子(Cu2+)含量過多又會對臟器造成負(fù)擔(dān)，還會導(dǎo)致許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如阿爾茨海默癥[2]、威爾遜氏病[3]、唐氏綜合征[4]等。金屬銅被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，而生產(chǎn)中的廢銅若未經(jīng)過處理直接排放會污染環(huán)境。動植物能夠從環(huán)境中吸收Cu2+，又通過食物鏈富集到人體[5]。此外，人體對于Cu2+的攝入還來源于飲用水。世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定，Cu2+在飲用水中的含量不能超過2 mg/L[6]，成年人銅的攝取量不應(yīng)超過10～12 mg/d。目前，Cu2+的檢測方法主要分為直接檢測法和間接檢測法。直接檢測法是利用Cu2+本身的物理、化學(xué)特性進(jìn)行檢測，主要包括原子吸收法[7]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法和生物傳感器法[8]等。在利用原子吸收光譜法進(jìn)行測定時，不同光源燈對應(yīng)著不同的元素，對樣品進(jìn)行測量時需要及時更換光源燈。并且原子吸收光譜法的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性范圍比較窄，靈敏度低和抗干擾性弱等[9]。電感耦合等離子體質(zhì)譜法檢測離子的方法簡單、速度快，但儀器價格昂貴[10]。間接檢測法主要是利用Cu2+與熒光探針的特定化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行檢測。例如：熒光光譜法、比色法、免疫分析法、酶分析法等。其中，熒光光譜法因為其高靈敏度、強(qiáng)選擇性、操作簡單和響應(yīng)速度快的優(yōu)點(diǎn)[11]，可以快速、大批量地檢測樣品中Cu2+的含量，近年來被廣泛關(guān)注。

熒光探針分析法是一種建立在熒光分析光譜和探針熒光強(qiáng)度變化上的識別方法[12]。熒光分子探針技術(shù)對目標(biāo)物進(jìn)行檢測的工作機(jī)制主要包括分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移[13]、光致電子轉(zhuǎn)移[14]、熒光共振能量轉(zhuǎn)移[15]、聚集誘導(dǎo)發(fā)光[16]及激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移[17]。近年來，大量有機(jī)分子熒光探針被用于Cu2+的檢測，但有機(jī)分子熒光探針的合成過程中會使用到大量有毒有害的試劑，污染環(huán)境，且水溶性差?；谒苄暂^好的多肽熒光探針因具有結(jié)構(gòu)簡單、生物相容性好等特點(diǎn)[18]受到關(guān)注。而熒光基團(tuán)標(biāo)記探針合成較為復(fù)雜，且副產(chǎn)物多。因此采用內(nèi)源性熒光的多肽熒光探針能簡化合成步驟，提高探針的水溶性，降低成本。

高通量檢測技術(shù)是指可以一次檢測多個樣品或者對同一種樣品進(jìn)行多種檢測的技術(shù)[19]，被廣泛應(yīng)用于食品安全、藥物/菌種篩選等領(lǐng)域[20]。高通量檢測多基于酶聯(lián)免疫測定技術(shù)、多重PCR技術(shù)、基因芯片檢測技術(shù)等實現(xiàn)單次多個樣品的同時檢測。其中多功能酶標(biāo)儀因為擁有多種檢測模式(吸光度、熒光強(qiáng)度、時間分辨熒光等)、操作簡單、樣品消耗量少、成本低等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于高通量檢測中。

研究擬開發(fā)組氨酸—色氨酸—谷氨酸—組氨酸—組氨酸(HWEHH)熒光探針，其中色氨酸(W)具有強(qiáng)熒光，組氨酸(H)可以與Cu2+絡(luò)合，谷氨酸(E)可以增加多肽的水溶性和穩(wěn)定性。根據(jù)Cu2+與多肽熒光探針絡(luò)合后探針熒光強(qiáng)度的變化，實現(xiàn)對Cu2+的檢測，并結(jié)合酶標(biāo)儀實現(xiàn)多肽熒光探針對水中Cu2+的高通量檢測，為實現(xiàn)水溶液中的Cu2+快速檢測提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HWEHH(圖1)多肽熒光探針：分析純，探針序列由實驗室設(shè)計，由上海強(qiáng)耀生物集團(tuán)有限公司合成并純化；

圖1 HWEHH結(jié)構(gòu)Figure 1 The structure of HWEHH

各金屬陽離子：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

濃硫酸、濃鹽酸：分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；

4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)：分析純，美國Sigma公司；

試驗用水為去離子水；

自來水：中南林業(yè)科技大學(xué)神農(nóng)樓；

飲用水：中南林業(yè)科技大學(xué)神農(nóng)樓直飲水系統(tǒng)。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光分光光度計：F-4600型，日本高新技術(shù)公司；

紫外分光光度計：UV-2600型，日本島津公司；

多功能酶標(biāo)儀：Spectra Max i3x型，上海美谷分子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制 將凍干多肽探針(HWEHH)粉末直接溶于10 mmol/L NaOH溶液中，制成濃度約為1 mmol/L 的探針儲備液，并將其稀釋至2 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。用紫外分光光度計檢測多肽溶液的濃度。各金屬離子溶液采用其陰離子所對應(yīng)的酸配制成濃度為1 mmol/L 的離子溶液。

1.3.2 紫外可見分光光度法 掃描范圍200～800 nm，以10 mmol/L HEPES緩沖溶液為空白背景調(diào)零，紫外分光光度計對儲備液稀釋液進(jìn)行檢測。根據(jù)朗伯比爾定律[21]按式(1)測定可溶性多肽的濃度。

A=Σbc，

(1)

式中：

A——吸光度；

Σ——色氨酸的摩爾吸光系數(shù)，5 400 L/(mol·cm)；

b——吸收池的厚度，cm；

c——溶液的摩爾濃度，mol/L。

1.3.3 熒光分光光度法

(1) 測定多肽熒光探針光譜：以280 nm為激發(fā)波長，發(fā)射波長為290～450 nm，室溫下對HWEHH多肽探針溶液進(jìn)行熒光測量。狹縫設(shè)置10.0 nm，電壓500 V。對HEPES溶液、探針溶液、含有Cu2+的多肽探針溶液進(jìn)行3次熒光測量。

(2) 溫度對探針穩(wěn)定性的影響：選取不同的溫度(25，30，35，40，45，50，55，60 ℃)孵育2 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液10 min后進(jìn)行熒光測量，記錄不同溫度下多肽探針的熒光強(qiáng)度。

(3) pH對多肽熒光探針的影響：使用HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)HEPES緩沖溶液的pH分別為2.0，4.0，6.0，7.4，8.0，10.0。采用不同pH緩沖溶液稀釋儲備液得2 μmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)行熒光測量記錄溶液的熒光強(qiáng)度，再向其中滴加Cu2+，使溶液中Cu2+最終濃度為1.5 μmol/L，計算不同pH下多肽探針的熒光變化率。

(4) 標(biāo)準(zhǔn)曲線：

① 單個樣品檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線：向多肽探針溶液中滴加Cu2+進(jìn)行熒光測量，直至熒光強(qiáng)度不再變化，記錄每次滴加Cu2+的體積、濃度及熒光強(qiáng)度，繪制Cu2+標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按式(2)計算解離常數(shù)[22]。

ΔF=F0-FL=[(F0-Fα)/2M0]{(L+M0+Kd)-[(L+M0+Kd)2-4M0L]1/2}，

(2)

式中：

F0——無Cu2+存在下的熒光強(qiáng)度，AU；

FL——Cu2+存在下的熒光強(qiáng)度，AU；

Fα——Cu2+飽和的熒光強(qiáng)度，AU；

M0——多肽與Cu2+結(jié)合的實際濃度，μmol/L；

L——游離的Cu2+濃度，μmol/L；

Kd——解離常數(shù)，mol/L。

② 高通量樣品檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線：配置含有不同濃度Cu2+的多肽熒光探針溶液(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.8，1.0，1.2，1.5 μmol/L)，加入384孔板中，于酶標(biāo)儀中進(jìn)行熒光測量，激發(fā)波長280 nm；發(fā)射波長310～450 nm；記錄熒光強(qiáng)度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(5) 選擇性試驗：標(biāo)準(zhǔn)工作液中滴加不同的金屬陽離子，使其最終濃度均為1.5 μmol/L，對其進(jìn)行熒光測量，再向含有不同金屬陽離子的工作液中滴加Cu2+，使Cu2+濃度為1.5 μmol/L。記錄熒光變化強(qiáng)度，并與只含Cu2+工作液的熒光變化強(qiáng)度進(jìn)行對比。

1.4 HWEHH熒光探針檢測限的確定

重復(fù)掃描標(biāo)準(zhǔn)工作液20次，按式(3)計算該熒光探針在該濃度下的檢測限[23]。

LOD= 3σ/S，

(3)

式中：

LOD——檢測限，μmol/L；

σ——空白條件下掃描溶液20次的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

S——標(biāo)準(zhǔn)線性方程的斜率。

1.5 實際樣品的測定

對樣品的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測量以排除樣品自有的熒光強(qiáng)度對試驗準(zhǔn)確性的影響。測量含有樣品的工作液的熒光強(qiáng)度，根據(jù)對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中Cu2+濃度，并進(jìn)行樣品加標(biāo)回收試驗檢測該方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 HWEHH的激發(fā)特征及Cu2+對其熒光的淬滅作用

由圖2(a)可知，HWEHH熒光探針在280 nm處有最大吸收峰，吸光度為0.033，此時儲備液濃度為1.22 mmol/L。由圖2(b)可知，HEPES緩沖溶液在354 nm處無熒光峰，HWEHH探針溶液在354 nm處有較強(qiáng)的熒光峰。色氨酸的特征熒光峰約在360 nm[23]，但是多肽中色氨酸的峰會由于周圍原子和電子的影響而發(fā)生偏移，因此HWEHH熒光探針的熒光峰的峰值位于354 nm。當(dāng)向探針溶液中加入Cu2+后，溶液在354 nm處熒光值大幅度降低，從2 136降低至900.5，表明HWEHH熒光的淬滅是由Cu2+引起的。

圖2 HWEHH特征譜圖Figure 2 HWEHH characteristic spectrum

2.2 溫度對HWEHH熒光探針穩(wěn)定性的影響

由圖3可知，在試驗范圍內(nèi)，30 ℃的熒光強(qiáng)度最大，隨著溫度的升高，探針溶液的熒光強(qiáng)度峰值將會降低(由2 485降至1 877)。這是因為溶液溫度(30 ℃以上)越高，介質(zhì)黏度越低，分子之間的熱運(yùn)動越劇烈[24]，從而增加熒光分子同溶劑分子之間的碰撞幾率。由此得出熒光探針的最佳工作溫度為30 ℃。而25，30 ℃的熒光強(qiáng)度差異率為6%，考慮工作時的檢測成本，后續(xù)所有試驗均在25 ℃ 下進(jìn)行。

圖3 HWEHH溶液在不同溫度下的熒光強(qiáng)度Figure 3 Fluorescence intensity of HWEHH solution at different temperatures

2.3 pH對HWEHH熒光探針的影響

由圖4(a)可知，當(dāng)pH為2.0～8.0時，隨著pH的升高，熒光探針溶液在354 nm處的熒光強(qiáng)度也隨之升高。這是因為溶液pH值的變化影響熒光物質(zhì)的電離狀態(tài)，從而影響熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度。由圖4(b)可知，Cu2+加入引起的多肽探針熒光變化率也會受到pH的影響，多肽熒光探針在酸性條件下與Cu2+結(jié)合較弱，熒光淬滅效果不明顯，變化率為0～0.2。增大pH，淬滅效果越來越明顯，變化率達(dá)到0.6以上，說明其靈敏度也升高。當(dāng)pH增大到7.4，8.0時變化率達(dá)到最佳，8.0之后pH越大，靈敏度隨之降低。這是因為酸性條件下，谷氨酸帶正電，與Cu2+產(chǎn)生靜電斥力，難以絡(luò)合，中性環(huán)境下，谷氨酸帶負(fù)電，與Cu2+有靜電吸引作用，使絡(luò)合更加穩(wěn)定[25]。組成多肽的氨基酸等電點(diǎn)均≤7.6，在pH 10時，4個多肽分子均帶較多負(fù)電荷有斥力作用，與Cu2+的結(jié)合能力比pH 7.4，8.0的穩(wěn)定性差。通常情況下液體酸堿值大部分為中性，因此后續(xù)所有試驗均在pH 7.4下進(jìn)行。

圖4 不同pH下HWEHH熒光探針的熒光強(qiáng)度及熒光變化率Figure 4 Fluorescence intensity and change rate of HWEHH fluorescent probe at different pH value

2.4 HWEHH熒光探針檢測Cu2+的標(biāo)準(zhǔn)曲線、解離常數(shù)和檢測限

由圖5(a)可知，Cu2+對該探針的淬滅效果具有濃度依賴性。由圖5(b)可知，當(dāng)Cu2+濃度為0～1.5 μmol/L時，隨著Cu2+濃度的增加，多肽探針的熒光強(qiáng)度降低，且其熒光強(qiáng)度與Cu2+呈負(fù)相關(guān)，此時解離常數(shù)為7.5×10-7mol/L，絡(luò)合常數(shù)是解離常數(shù)的倒數(shù)，為1.3×106L/mol，證明其絡(luò)合能力較強(qiáng)。其線性方程為Y= -1 135.085 7X+2 048.187 6(R2=0.999)，檢測限為0.036 μmol/L。

a～k中Cu2+濃度依次為：1.5，0.25，1，0.75，0.5，0.4，0.3，0.2，0.1，0.05，0 μmol/L圖5 不同濃度Cu2+的HWEHH溶液熒光光譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 5 Flourescence spectra standard curve of HWEHH containing different concentrations of Cu2+

2.5 HWEHH熒光探針對Cu2+的選擇性

由圖6(a)可知，只有Cu2+能引起探針熒光的顯著變化(0.81)，其他金屬陽離子對該探針無明顯的淬滅效果(0.03～0.05)。由圖6(b)可知，當(dāng)溶液中存在其他金屬陽離子時，不會對HWEHH熒光探針識別Cu2+產(chǎn)生影響。

圖6 含有不同金屬陽離子的多肽溶液的熒光變化率Figure 6 Fluorescence change rate of HWEHH peptide solution containing different metal cations

2.6 HWEHH高通量檢測Cu2+的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖7可知，關(guān)于Cu2+濃度的線性方程為Y=-283 958.437X+680 750.954(R2=0.981)，說明可以利用多肽熒光探針法同高通量檢測技術(shù)結(jié)合來檢測食品中的Cu2+濃度。

圖7 高通量檢測Cu2+濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 7 Standard curve of Cu2+ concentration in high-throughput detection

2.7 實際樣品中Cu2+的測定

自來水、飲用水在310 nm左右有水的拉曼峰，在其他位置無峰出現(xiàn)，說明樣品自身在354 nm處無熒光值，不會影響HWEHH熒光探針對樣品中Cu2+濃度的檢測。由表1可知，自來水和飲用水中的加標(biāo)回收率為93.6%～101.9%，表明該熒光探針可以用于實際樣品中Cu2+含量的檢測。

表1 加標(biāo)回收率Table 1 Standard recovery rate

3 結(jié)論

利用組氨酸—色氨酸—谷氨酸—組氨酸—組氨酸(HWEHH)多肽作為熒光探針，檢測了樣品中Cu2+的含量。結(jié)果表明，當(dāng)樣品中存在Cu2+時，Cu2+與HWEHH絡(luò)合，阻斷多肽分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致HWEHH熒光的淬滅，使探針熒光值降低。當(dāng)熒光探針濃度為2 μmol/L時，其對Cu2+有較高的選擇性，且檢測的線性范圍為0～1.5 μmol/L，線性方程為Y= -1 135.085 7X+2 048.187 6，檢出限為0.036 μmol/L。利用384孔板結(jié)合HWEHH熒光探針可實現(xiàn)對Cu2+的高通量檢測。通過對實際水樣品(自來水、飲用水)中Cu2+進(jìn)行加標(biāo)試驗發(fā)現(xiàn)其回收率較高，可有效實現(xiàn)水溶液中Cu2+的檢測。此外，該探針與Cu2+的絡(luò)合機(jī)制沒有進(jìn)行深入研究，后續(xù)可以采取核磁共振、計算機(jī)模擬等方法對其作用機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步探究。