李力群 劉 強 喬月梅 郭春生 柴 穎 郝 捷

(內(nèi)蒙古昆明卷煙有限責任公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020)

香蘭素是具有濃郁奶香味的香味劑[1-2]，也是人類合成并使用最早的食品賦香劑之一，其產(chǎn)量大、用途廣[3]。香蘭素按照生產(chǎn)方式可分為植物提取法、化學合成法、微生物轉(zhuǎn)化法[4-6]。相比于植物提取法和化學合成法，微生物轉(zhuǎn)化法不受季節(jié)影響、污染少，香氣和純度與天然提取的香蘭素幾乎相同。能夠通過微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)香蘭素的底物較多，如丁香酚、異丁香酚和阿魏酸等[7]。其中，阿魏酸廣泛存在于麩皮和谷殼等農(nóng)副產(chǎn)物中[8]，價格低廉，原料充足，通過一步或兩步轉(zhuǎn)化就可生成香蘭素[9]，而且與其他底物相比，阿魏酸的毒性較小且產(chǎn)率高[10]，是微生物法生產(chǎn)香蘭素的理想底物。

微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香蘭素過程中菌種的選育是關(guān)鍵，優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、穩(wěn)定的菌種是生產(chǎn)效率的決定性因素。阿魏酸可被微生物轉(zhuǎn)化生成異丁香酚或香草酸從而再生成香蘭素[11-13]。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素的菌株有朱砂綠膿桿菌(Pycnoporuscinnabarinus)[14]、黑曲霉(Aspergillusniger)[15]、食酸假單胞菌(Pseudomonasacidovorans)[16]、大腸桿菌(Escherichiacoli)[17]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[18]等。研究擬從白酒大曲中篩選轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素的微生物菌株，進一步通過單因素和正交試驗對菌株利用阿魏酸產(chǎn)香蘭素工藝進行優(yōu)化，以期為開發(fā)具有產(chǎn)濃郁奶香風味強化大曲提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

高溫大曲：內(nèi)蒙古自治區(qū)某濃香型白酒廠。

1.2 試驗試劑

磷酸氫二銨：分析級，天津市智遠化學試劑有限公司；

胰蛋白胨、酵母提取粉、瓊脂、三羥甲基氨基甲烷(Tris-base)：廣東桓凱微生物科技有限公司；

Na2EDTA·2H2O、結(jié)晶紫：分析純，廣東桓凱微生物科技有限公司；

甲醇、三氟乙酸：色譜純，天津市廣大化學試劑有限公司；

香蘭素、香草酸、阿魏酸：色譜純，上海麥克林生化科技有限公司；

細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302-02)：天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 儀器與設備

潔凈工作臺：HCB-1300V型，上海一恒科學儀器有限公司；

恒溫振蕩器：THZ-98C型，上海一恒科學儀器有限公司；

全自動高壓滅菌鍋：SX-500型，上海新普儀器設備有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-9053A型，上海一恒科學儀器有限公司；

真空抽濾裝置：GM-0.5A，天津津騰實驗設備有限公司；

高速離心機：2-16KHL型，德國希格瑪實驗室離心機公司；

液相色譜儀：U3000型，上海賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：7890型，安捷倫科技有限公司；

PCR儀：Veriti96型，上海賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.4 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，酵母提取物3 g/L，瓊脂17 g/L；

平板分離培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，酵母提取物5 g/L，瓊脂17 g/L；

種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，酵母提取物5 g/L；

阿魏酸發(fā)酵培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，酵母提取物3 g/L，阿魏酸1 g/L；

培養(yǎng)基均調(diào)節(jié)pH至7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.5 試驗方法

1.5.1 香蘭素、阿魏酸、香草酸混合標準溶液 利用40%甲醇溶液(超純水、色譜級甲醇)配制質(zhì)量濃度為100，80，60，40，20，2 mg/L的香蘭素、阿魏酸和香草酸混合標準溶液。

1.5.2 轉(zhuǎn)化香蘭素微生物的篩選及純化 根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫確定香蘭素合成代謝中的關(guān)鍵酶進而追溯到可以合成11種關(guān)鍵酶的潛在微生物大多為芽孢桿菌屬微生物。因此，確定芽孢桿菌屬為目標微生物類群。四分法取樣稱取大曲20 g，研磨后，用180 mL生理鹽水洗滌，在振蕩培養(yǎng)箱150 r/min混勻30 min，混勻后在80 ℃水浴鍋中恒溫30 min。水浴后吸取5 mL曲液接種于50 mL富集培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min搖床中富集培養(yǎng)24 h。富集培養(yǎng)結(jié)束后，用移液槍吸取1 mL菌懸液至盛有9 mL生理鹽水的試管中稀釋，然后依次稀釋成10-2，10-3，10-4，10-5，10-6倍菌懸液。吸取稀釋后的菌懸液涂布于平板分離培養(yǎng)基平板中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察菌落形態(tài)，挑取單一菌落接種于平板培養(yǎng)基中，37 ℃再培養(yǎng)24 h，將純化后的單一菌落保藏于試管斜面培養(yǎng)基中，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 產(chǎn)香蘭素微生物的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 取純化后的單菌落置于盛有5 mL種子培養(yǎng)基的試管中，于37 ℃，180 r/min培養(yǎng)16 h。采用天根DP302-02試劑盒方法提取菌株的基因組DNA。選擇25 μL聚合酶鏈反應體系，利用通用引物進行PCR擴增。PCR程序為：在94 ℃ 10 min后，循環(huán)30個95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，最后72 ℃ 10 min，4 ℃保藏備用。聚合酶鏈反應結(jié)束后，取1 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。根據(jù)測序得到的16S rDNA序列，利用NCBI在線數(shù)據(jù)庫進行同源序列檢索。作最大同源性比較分析，使用軟件MEGA-X中的鄰接法(Neighbor-Joining Method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，同時進行重復次數(shù)為1 000次的Bootstrap測試，確定目標菌株的分類地位。

1.5.4 香蘭素及其他轉(zhuǎn)化產(chǎn)物檢測方法 參照鄭璇等[19]的方法。

1.5.5 菌體生長量的測定 以發(fā)酵液在600 nm處的吸光值來反映菌體生長量。

1.5.6 產(chǎn)香蘭素條件優(yōu)化

(1) 菌株的培養(yǎng)和發(fā)酵：將菌種接種于裝液量為40%的搖瓶(250 mL)中，于恒溫震蕩培養(yǎng)箱中(180 r/min，37 ℃)培養(yǎng)24 h。將10%的種子液接種于盛有阿魏酸發(fā)酵培養(yǎng)的搖瓶(裝液量為20%)中，在恒溫震蕩培養(yǎng)箱中(180 r/min，37 ℃)發(fā)酵培養(yǎng)4 d后測定發(fā)酵液中香蘭素、阿魏酸和香草酸的含量。

(2) 發(fā)酵時間對菌株產(chǎn)香蘭素的影響：將培養(yǎng)24 h的種子液按10%的接種量接種于裝液量為20%、pH為7.0的阿魏酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，在恒溫震蕩培養(yǎng)箱中(180 r/min，37 ℃)發(fā)酵培養(yǎng)，每隔1 d取樣測定發(fā)酵液中香蘭素、阿魏酸和香草酸的含量。

(3) 溫度對菌株產(chǎn)香蘭素的影響：將培養(yǎng)24 h的種子液按10%的接種量接種于裝液量為20%、pH為7.0的阿魏酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，在恒溫震蕩培養(yǎng)箱中(180 r/min；溫度分別為30，35，37，40，45，50 ℃)發(fā)酵培養(yǎng)4 d。

(4) pH對菌株產(chǎn)香蘭素的影響：將培養(yǎng)24 h的種子液按10%的接種量接種于pH分別為5，6，7，8，9，10，11，12的阿魏酸發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，在恒溫震蕩培養(yǎng)箱中(180 r/min，37 ℃)發(fā)酵培養(yǎng)4 d。

(5) 裝液量對菌株產(chǎn)香蘭素的影響：將培養(yǎng)24 h的種子液按10%的接種量接種于裝液量分別為10%，20%，30%，40%，50%的阿魏酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，在恒溫震蕩培養(yǎng)箱中(180 r/min，37 ℃)發(fā)酵培養(yǎng)4 d。

(6) 轉(zhuǎn)速對菌株產(chǎn)香蘭素的影響：將培養(yǎng)24 h的種子液按10%的接種量接種于裝液量為20%阿魏酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，在恒溫震蕩培養(yǎng)箱中(轉(zhuǎn)速分別為120，140，160，180，200，220 r/min，37 ℃)發(fā)酵培養(yǎng)4 d。

(7) 正交試驗優(yōu)化：通過分析發(fā)酵時間、溫度、pH、裝液量和轉(zhuǎn)速等對所篩菌株產(chǎn)香蘭素的影響，篩選具有顯著影響的因素，利用正交試驗進一步優(yōu)化菌株的轉(zhuǎn)化香蘭素的發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)香蘭素微生物的篩選及鑒定

從大曲中初篩芽孢桿菌屬微生物后，通過添加底物阿魏酸，進行復篩，獲得24株能夠轉(zhuǎn)化阿魏酸為香蘭素的菌株。其中菌株B2-12產(chǎn)香蘭素的能力最高，達22.15 mg/L?；跍y序結(jié)果，構(gòu)建菌株B2-12的16S rDNA基因系統(tǒng)進化樹，確定其親緣關(guān)系。由圖1可知，菌株B2-12與BacillussubtilisAKKVG-2-18(MK346328.1)處在同一分支上，在GenBank數(shù)據(jù)庫比對過程中發(fā)現(xiàn)，菌株B2-12與Bacillussubtilis(MK346328.1)的16S rDNA基因序列相似度為98%，由此推斷菌株B2-12為芽孢桿菌屬中的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

圖1 菌株B2-12系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 1 Phylogenetic tree of strains B2-12

2.2 發(fā)酵液中香蘭素定量分析

在香蘭素的轉(zhuǎn)化過程中，會產(chǎn)生和積累一些中間代謝物，且香蘭素還會進一步降解，如阿魏酸、香草酸、愈創(chuàng)木酚、香草醇和原兒茶酸等。阿魏酸是香蘭素合成的重要前體物，香草酸是香蘭素進一步轉(zhuǎn)化的主要產(chǎn)物(圖2)。因此，通過HPLC法測定發(fā)酵液中阿魏酸、香蘭素和香草酸含量的變化，來進一步探究各因素對菌株生長、細胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)香蘭素的影響。

圖2 阿魏酸、香蘭素和香草酸轉(zhuǎn)化關(guān)系Figure 2 The relationship of ferulic acid, vanillin and vanillic acid

采用高效液相色譜法(HPLC)測定發(fā)酵液中的香草酸、香蘭素、阿魏酸含量，發(fā)現(xiàn)在280 nm，0.5 mL/min流速下混合標準品分離效果良好，香草酸的保留時間為11.357 min，香蘭素的保留時間為13.443 min，阿魏酸的保留時間為17.592 min[見圖3(a)]。發(fā)酵液中香草酸、香蘭素、阿魏酸與其他雜峰分離效果良好，且保留時間與混標相差15 s以內(nèi)[見圖3(b)]，表明該方法良好，可以用來定性分析發(fā)酵液中的香蘭素等物質(zhì)。

圖3 香草酸、香蘭素、阿魏酸色譜圖Figure 3 Chromatogram of vanillic acid, vanillin and ferulic acid

用40%甲醇溶液配制的香草酸、香蘭素和阿魏酸的混合標準溶液在2～100 mg/L線性范圍內(nèi)，阿魏酸、香蘭素和香草酸的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1，其線性關(guān)系均良好，可以用來定量分析發(fā)酵液中香蘭素等物質(zhì)(圖4)。

表1 混標中各物質(zhì)線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear regression equation and correlation coefficient of each substance in mixed standard

圖4 香草酸、香蘭素、阿魏酸混標標準曲線Figure 4 Standard curve of mixed standard of vanillic acid, vanillin and ferulic acid

2.3 發(fā)酵條件的影響

2.3.1 發(fā)酵時間的影響 由圖5可以看出，發(fā)酵液中香草酸濃度隨發(fā)酵時間的增加不斷升高，發(fā)酵第7天香草酸發(fā)生跳躍式增加，質(zhì)量濃度達到了28.3 mg/L，隨后濃度基本保持穩(wěn)定不變，一方面有可能是在第7天時發(fā)酵液各酚類物質(zhì)積累量起到了一定的誘導作用，促進了香草酸的產(chǎn)生。另一方面菌體生長量在第7天時也急劇升高，說明菌株B2-12具有較強的產(chǎn)香草酸的能力。發(fā)酵液中殘留的阿魏酸隨發(fā)酵時間的推移呈現(xiàn)M型變化趨勢，有可能是產(chǎn)生的其他酚類物質(zhì)(如4-乙烯基愈創(chuàng)木酚)又轉(zhuǎn)化生成了阿魏酸。隨發(fā)酵時間的不斷推移，發(fā)酵液中香蘭素的含量逐漸增加，發(fā)酵第4天，發(fā)酵液中的香蘭素質(zhì)量濃度達到最大(25.4 mg/L)。當發(fā)酵時間超過4 d時，香蘭素濃度逐漸降低。因此，選擇發(fā)酵4 d為菌株B2-12轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素的最適發(fā)酵時間。

圖5 發(fā)酵時間對B2-12菌株轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素的影響Figure 5 The effects of fermentation time on the fermentation of B2-12 strain to produce vanillin by ferulic acid

2.3.2 溫度的影響 根據(jù)圖6可知，在30，35 ℃時，大部分阿魏酸轉(zhuǎn)化成了香草酸，香蘭素濃度較低。當溫度為37～45 ℃時，發(fā)酵液中產(chǎn)生了大量的香蘭素，香草酸含量降低。在40 ℃時香蘭素的質(zhì)量濃度達到最大(23.8 mg/L)，其菌體生長量也迅速升高。在45 ℃時菌體生長量達到最大(OD600 nm=0.744)。當溫度超過45 ℃時，發(fā)酵液中香蘭素和香草酸含量減少，發(fā)酵液中剩余的阿魏酸基本不變。由此可以看出，菌株B2-12最適轉(zhuǎn)化溫度范圍為37～45 ℃，產(chǎn)香蘭素的最佳轉(zhuǎn)化溫度為40 ℃。此結(jié)果與王潔[20]34所研究的食甲醇芽孢桿菌轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素的最適發(fā)酵溫度一致，說明在40 ℃左右芽孢桿菌更容易轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素。

圖6 溫度對B2-12菌株轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素的影響Figure 6 The effects of temperature on the transformation of ferulic acid by strain B2-12 to produce vanillin

2.3.3 pH的影響 由圖7可知，初始pH為5，6，7，8時，發(fā)酵液中剩余的阿魏酸較多，并隨pH的增大而增大。當pH>8時，發(fā)酵液中殘留的阿魏酸減少并趨于穩(wěn)定在5.2 mg/L，主要是因為隨pH的不斷增大，發(fā)酵液中的阿魏酸大部分以阿魏酸鈉的形式存在。香草酸在酸性條件下的含量大于堿性條件下，主要是因為在堿性條件下，香草酸被中和成香草酸鈉溶液。菌體生長量隨pH的增高而不斷升高，當?shù)孜飌H升高至9時，菌體生長量達到最大，OD600 nm為0.472。當pH為10時，菌體生長量迅速降低，隨后并保持恒定，同時香蘭素質(zhì)量濃度達到最大33.07 mg/L，與王潔[20]30-33研究的食甲醇芽孢桿菌產(chǎn)香蘭素的最適pH相吻合。由此推斷，在堿性環(huán)境下更有利于阿魏酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)香蘭素，但是對菌體生產(chǎn)具有負面影響。選擇pH 10作為最適初始pH值。

圖7 初始pH對B2-12菌株轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素的影響Figure 7 The effects of substrate pH on the production of vanillin by B2-12 strain transformed with ferulic acid

2.3.4 裝液量的影響 由圖8可以看出，隨裝液量的增加發(fā)酵液中剩余的阿魏酸含量逐漸增大，香草酸的濃度逐漸減小，菌體生長量也逐漸減小，說明香草酸轉(zhuǎn)化過程中需要較多的氧氣，菌株B2-12是好氧微生物。隨裝液量的不斷增大，香蘭素的濃度隨之增加，當裝液量為40%時，發(fā)酵液中的香蘭素質(zhì)量濃度達到最大22.5 mg/L，隨后緩慢降低。由此可以推斷，B2-12菌株在高氧濃度下轉(zhuǎn)化阿魏酸生成香蘭素的速度小于轉(zhuǎn)化香蘭素生成阿魏酸的速度，在低氧濃度下更有利于生成香蘭素。為了防止香蘭素轉(zhuǎn)化為香草酸，應該控制發(fā)酵液中的溶氧量。因此，選擇最適裝液量為40%。

圖8 裝液量對B2-12菌株轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素的影響Figure 8 The effects of liquid volume on the production of vanillin by B2-12 strain transforming ferulic acid

2.3.5 轉(zhuǎn)速的影響 搖瓶裝液量和轉(zhuǎn)速是影響發(fā)酵液溶氧量的兩個重要因素，同時也影響發(fā)酵液中氧化還原反應和各酚類化合物的轉(zhuǎn)化。由圖9可知，隨轉(zhuǎn)速的不斷增加，發(fā)酵液中剩余的阿魏酸和生成的香草酸呈負相關(guān)，說明隨溶氧量的增加，發(fā)酵液中的阿魏酸更有利于轉(zhuǎn)化成香草酸。發(fā)酵液中的香蘭素和菌體生長量隨轉(zhuǎn)速的增加先增加后減小，香蘭素和菌體生長量均在160 r/min時最大，香蘭素質(zhì)量濃度達到了23.0 mg/L。這表明在160 r/min時，菌株B2-12具有較強的轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素能力。

圖9 轉(zhuǎn)速對B2-12菌株轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素的影響Figure 9 The effects of rotation speed on the production of vanillin by B2-12 strain transforming ferulic acid

2.4 菌株B2-12轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素正交試驗工藝優(yōu)化

在單因素的基礎(chǔ)上對影響菌株生長細胞產(chǎn)香蘭素的主要因素：發(fā)酵溫度、pH、裝液量和轉(zhuǎn)速進行L9(34)正交試驗設計(如表2所示)，確定產(chǎn)香蘭素的最優(yōu)工藝。

表2 菌株B2-12產(chǎn)香蘭素工藝試驗因素水平設計Table 2 Factors of orthogonal experiment for vanillin production process of B2-12

由表3可知，各因素對菌株B4-9產(chǎn)香蘭素的影響大小為A>B>D>C，菌株B2-12轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素的最優(yōu)工藝為A3B2C3D2，即溫度43 ℃、pH 10、裝液量44%、轉(zhuǎn)速160 r/min。

表3 菌株B2-12產(chǎn)香蘭素工藝正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of vanillin production by strain B2-12

在溫度43 ℃、pH 10、裝液量44%、轉(zhuǎn)速160 r/min、接種量10%的最優(yōu)工藝條件下發(fā)酵4 d，菌株B2-12發(fā)酵液中的香蘭素質(zhì)量濃度為(34.5±0.16) mg/L，表明正交試驗得到的工藝條件可靠。

3 結(jié)論

研究通過數(shù)據(jù)庫檢索確定能夠轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素的微生物范圍，以阿魏酸為底物，從大曲中篩選得到轉(zhuǎn)化阿魏酸產(chǎn)香蘭素能力最強菌株B2-12。經(jīng)16S rDNA鑒定其為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對發(fā)酵溫度、pH、裝液量和轉(zhuǎn)速進行正交試驗優(yōu)化了菌株B2-12以阿魏酸為底物產(chǎn)香蘭素的工藝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株B2-12在裝液量44%、pH 10、43 ℃、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min條件下發(fā)酵4 d后，發(fā)酵液中的香蘭素質(zhì)量濃度達到34.5 mg/L。