潘明敏，王啟陽(yáng)，楊麗萍

(河南中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)學(xué)科， 河南 鄭州 450046)

隨著RNA甲基化免疫共沉淀高通量測(cè)序(m6A-specific methylated RNA immunoprecipitation with next generation sequencing, MeRIP-seq)技術(shù)的出現(xiàn)，大量可逆的化學(xué)修飾開(kāi)始被深入鑒定和研究，尤其是6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)修飾。m6A修飾作為mRNA上最為常見(jiàn)的甲基化修飾形式，可以調(diào)控真核生物mRNA的剪接、出核、穩(wěn)定和翻譯，同時(shí)參與了干細(xì)胞分化，精子發(fā)生、腦發(fā)育等多種生物學(xué)功能。m6A修飾受甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和結(jié)合蛋白的協(xié)同調(diào)控。甲基化酶包括METTL3(methyltransferase like 3)、METTL14(methyltransferase like 14)、WTAP(Wilms’ tumor 1-associating protein)，去甲基化酶包括FTO(fat mass and obetity associated protein)和ALKBH5(alkB homolog 5)，結(jié)合蛋白主要是YTH結(jié)構(gòu)域蛋白，包括YTHDF1(YTH domain family member 1)、YTHDF2(YTH domain family member 2)、YTHDF3(YTH domain family member 3)、YTHDC1(YTH domain containing 1)和YTHDC2(YTH domain containing 2)，當(dāng)參與m6A修飾的酶或結(jié)合蛋白表達(dá)異常，可導(dǎo)致發(fā)育受阻并產(chǎn)生多種疾病。

本文對(duì)首次鑒定提出的m6A去甲基化酶FTO及其介導(dǎo)的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行闡述，以期能深入了解FTO在生長(zhǎng)發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的變化規(guī)律。

1 FTO

1999年在對(duì)插入突變產(chǎn)生的具有融合腳趾(fused toes，F(xiàn)T)表型小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)to基因是突變所致缺失的一個(gè)最長(zhǎng)基因，涵蓋超過(guò)400 kb的基因組序列，其不僅在成年小鼠組織中廣泛表達(dá)，在胚胎發(fā)育過(guò)程中也起著重要作用[1-2]。2007年全基因組關(guān)聯(lián)分析提示它與人體體質(zhì)指數(shù)(BMI)增加和肥胖密切相關(guān)，并將其命名為脂肪含量和肥胖相關(guān)基因(fat mass and obesity associated protein)[3]。對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)FTO具有Fe2+和α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶特征，屬于ALKB蛋白家族中的一員，大多定位于細(xì)胞核[4]。2010年體外研究首次證明FTO是一種類似于ALKB的DNA/RNA脫甲基酶，對(duì)單鏈DNA中的3-甲基胸腺嘧啶和單鏈RNA中的3-甲基尿嘧啶有強(qiáng)烈的偏好性，同時(shí)暗示其對(duì)RNA可能有去甲基化作用[5]。深入探究表明FTO在單鏈和雙鏈RNA中均以m6A為靶點(diǎn)發(fā)揮去甲基化作用，因此正式將FTO蛋白功能定義為m6A去甲基化酶[6]。至此，開(kāi)啟了FTO與甲基化研究的序幕。

在已鑒定到的150多種RNA化學(xué)修飾中，m6A是mRNA上豐度最高、最常見(jiàn)的甲基化修飾形式[7]。m6A修飾分布存在一定的規(guī)律性，主要分布在mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′untranslated region，3′UTR)、轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(transcription start site，TSS)和序列編碼區(qū)(coding sequence，CDS)。尤其在3′UTR的前部及CDS的終止密碼子區(qū)產(chǎn)生大量富集[8]。修飾的區(qū)域決定了m6A的不同調(diào)控功能，如調(diào)控腦發(fā)育和記憶的形成、造血干細(xì)胞的定向分化、精源細(xì)胞生成、胚胎發(fā)育、腫瘤生成等。m6A修飾作用的發(fā)揮需要甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和結(jié)合蛋白的協(xié)同參與。m6A甲基轉(zhuǎn)移酶包括METTL3、METTL14和WTAP復(fù)合物等，主要作用是催化mRNA的腺苷酸發(fā)生m6A修飾；去甲基化酶是FTO和ALKBH5，作用是對(duì)已發(fā)生m6A修飾的堿基進(jìn)行去甲基化；結(jié)合蛋白主要是具有YTHDF結(jié)構(gòu)域的蛋白，用來(lái)識(shí)別發(fā)生m6A修飾的堿基，激活下游的調(diào)控通路，調(diào)控mRNA的剪接、出核、定位、穩(wěn)定和翻譯[9]。而在整個(gè)動(dòng)態(tài)修飾過(guò)程中FTO的作用尤為突出，F(xiàn)TO具有較高的催化活性，其沉默和過(guò)表達(dá)與mRNA上m6A的增加和減少直接相關(guān)[10]。同時(shí)研究表明FTO參與了各種發(fā)育過(guò)程，與體脂發(fā)育、胚胎發(fā)育、腦發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育等緊密相關(guān)。

2 FTO及其介導(dǎo)的m6A/mRNA修飾與發(fā)育的關(guān)系

2.1 調(diào)節(jié)脂肪生成和體脂代謝

FTO在調(diào)節(jié)脂肪生成和能量穩(wěn)態(tài)平衡中起著重要作用。Fto過(guò)表達(dá)的小鼠會(huì)出現(xiàn)身體和脂肪質(zhì)量的依賴性增加從而導(dǎo)致肥胖，而Fto缺乏的小鼠會(huì)在出生后出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩和食物攝取量減少，并伴隨脂肪組織減少，死亡率增加[11]。自噬是控制脂肪細(xì)胞分化、促進(jìn)脂肪生成的重要途徑，F(xiàn)TO可通過(guò)其介導(dǎo)的m6A修飾影響自噬過(guò)程，控制脂肪生成。敲除Fto可導(dǎo)致自噬相關(guān)因子ATG5和ATG7 mRNA的m6A修飾水平升高，mRNA降解和蛋白表達(dá)下降，脂肪生成減少[12]。前脂肪細(xì)胞3T3-L1中敲低Fto可抑制前脂肪細(xì)胞分化，使脂肪組織生成減少，反之過(guò)表達(dá)Fto則促進(jìn)其分化過(guò)程，使脂肪組織生成增加。究其原因發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Fto能夠使脂肪細(xì)胞內(nèi)m6A水平降低，脂肪誘導(dǎo)分化水平提高，脂肪組織生成增加[13]。同時(shí)脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加，與脂肪組織Fto的mRNA水平和細(xì)胞分化階段Fto的mRNA表達(dá)呈正相關(guān),與脂肪細(xì)胞編碼基因mRNA的m6A水平成負(fù)相關(guān)。過(guò)表達(dá)去甲基化酶FTO可以顯著降低脂肪細(xì)胞mRNA的m6A水平，使與脂肪分解相關(guān)的三酰甘油脂肪酶(adipose triacylglyceride lipase，ATGL)和激素敏感脂肪酶(hormone-sensitive lipase,HSL)基因的表達(dá)水平下降，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)脂肪的沉積。其作用機(jī)制為FTO可通過(guò)調(diào)節(jié)剪接位點(diǎn)附近的m6A水平進(jìn)而控制外源性脂肪生成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(RUNX1T1)的剪接，從而在剪接位點(diǎn)周圍積累富含絲氨酸/精氨酸SR蛋白(SRSF2)，產(chǎn)生長(zhǎng)型和短型兩種亞型的RUNX1T1蛋白質(zhì)，而FTO則主要通過(guò)增加RUNX1T1的短型，促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化，調(diào)控脂肪生成[14]。綜上所述，脂肪細(xì)胞中的FTO通過(guò)動(dòng)態(tài)調(diào)控m6A修飾參與脂肪生成調(diào)控基因子集的剪接和基因表達(dá)，進(jìn)而影響脂肪組織生成。

2.2 調(diào)節(jié)胎盤和胚胎發(fā)育

FTO在胎盤中高表達(dá)，其參與胎盤和胚胎發(fā)育的機(jī)制包括兩個(gè)方面：直接FTO效應(yīng)(與胎盤生長(zhǎng)調(diào)節(jié)無(wú)關(guān)而直接與胎兒大小有關(guān))和間接FTO效應(yīng)(通過(guò)影響胎盤重量和胎盤功能)。早期學(xué)者大多認(rèn)同直接效應(yīng)，認(rèn)為Fto可直接參與并控制胎兒體質(zhì)量增加[15]，胎盤中Fto的表達(dá)水平增高，新生兒的頭圍大小和增長(zhǎng)速度增加，胎兒身長(zhǎng)也會(huì)增加[16]。而近年來(lái)學(xué)者研究提出，胎盤Fto基因的mRNA表達(dá)水平與產(chǎn)婦的胎盤質(zhì)量密切相關(guān)，胎盤中FtomRNA的表達(dá)水平可通過(guò)影響胎盤特定氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)進(jìn)而影響胎盤質(zhì)量，調(diào)控胎兒發(fā)育。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：仔豬低出生體質(zhì)量(low birth weight,LBW)的胎盤中FTO蛋白表達(dá)水平降低，m6A修飾水平升高，胎盤中血管生成和脂質(zhì)代謝基因的表達(dá)降低，特別是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)mRNA的蛋白水平下降，胎盤血管和營(yíng)養(yǎng)體轉(zhuǎn)運(yùn)功能受阻，從而產(chǎn)生LBW胎盤[17]。研究也發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)激狀態(tài)下，孕鼠胎盤中m6A水平升高，F(xiàn)TO表達(dá)水平下降，胎盤血管生成因子功能受損，胎盤重量降低，活胎數(shù)減少?？梢?jiàn)，胎盤中FTO通過(guò)影響胎盤血管發(fā)育及營(yíng)養(yǎng)物轉(zhuǎn)運(yùn)體功能而調(diào)節(jié)胎盤及胚胎發(fā)育。

2.3 調(diào)節(jié)大腦的發(fā)育和功能

FTO廣泛分布于大腦不同區(qū)域，如下丘腦、海馬區(qū)、前額葉皮質(zhì)區(qū)以及小腦區(qū)域等，F(xiàn)to的表達(dá)水平與大腦發(fā)育和功能密切相關(guān)[18]。Fto缺乏會(huì)導(dǎo)致大腦體積的縮小，同時(shí)也會(huì)降低體內(nèi)成年神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，進(jìn)而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙[19]。與野生型小鼠相比，F(xiàn)to缺失型小鼠在學(xué)習(xí)能力和短時(shí)記憶能力表現(xiàn)較差[20]?？謶钟洃涀鳛橐环N獨(dú)特的負(fù)性記憶與FTO的關(guān)系尤為緊密。成年神經(jīng)元中FTO缺失會(huì)導(dǎo)致m6A水平上升，突觸可塑性改變，增強(qiáng)恐懼記憶[21]。不同腦區(qū)中FTO缺失均可導(dǎo)致恐懼記憶的持續(xù)存在，在野生型小鼠背側(cè)海馬區(qū)利用CRISPR/Cas9技術(shù)特定敲除FTO，可使mRNA的m6A水平升高，恐懼記憶增強(qiáng)[22]；靶向注射shRNA敲除小鼠腦內(nèi)前額葉皮質(zhì)中的FTO，m6A總水平升高，小鼠在訓(xùn)練后24 h測(cè)得的恐懼記憶也會(huì)明顯增強(qiáng)[22]。機(jī)制研究表明，F(xiàn)TO主要通過(guò)影響抗記憶基因mRNA不同位點(diǎn)的去甲基化從而抑制記憶前轉(zhuǎn)錄本的翻譯，進(jìn)而增強(qiáng)恐懼記憶?？梢?jiàn)FTO可通過(guò)調(diào)控m6A水平進(jìn)而影響靶mRNA的降解或翻譯，使小鼠條件恐懼記憶增強(qiáng)。這表明mRNA甲基化可能是調(diào)控記憶能力的一個(gè)普遍機(jī)制。

圖1 FTO在大腦不同區(qū)域分布圖Fig 1 Distribution of FTO in different regions of the brain

2.4 調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育

FTO調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育的途徑主要通過(guò)參與調(diào)控下游mRNA加工代謝的各個(gè)過(guò)程，包括mRNA的加工、翻譯和降解等[23]。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，幾乎存在于所有神經(jīng)元中，它具有去極化神經(jīng)元和誘導(dǎo)同步放電的功能。谷氨酸的功能主要通過(guò)離子型N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體發(fā)揮。NMDAR1是一種離子型谷氨酸受體，NMDAR1高表達(dá)會(huì)損害神經(jīng)元并導(dǎo)致其凋亡。多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞中FTO水平上升，m6A修飾下降，可增強(qiáng)NMDAR1 mRNA的穩(wěn)定性，導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[24]。神經(jīng)元軸突內(nèi)的FTO能對(duì)軸突部位特定mRNA上的m6A進(jìn)行去甲基化修飾，在軸突內(nèi)對(duì)Fto進(jìn)行特異性抑制或沉默會(huì)導(dǎo)致靶基因GAP-43的m6A/mRNA修飾水平升高，進(jìn)而影響GAP-43mRNA的翻譯，導(dǎo)致GAP-43減少和抑制軸突延長(zhǎng)?？梢?jiàn)FTO能改變靶mRNA的m6A修飾，進(jìn)而影響靶mRNA的翻譯和功能執(zhí)行[25]。綜上所述FTO參與下游mRNA加工過(guò)程可能是m6A修飾參與神經(jīng)元發(fā)育的普遍模式。

3 問(wèn)題與展望

盡管眾多學(xué)者對(duì)FTO進(jìn)行了深入探索，但其具體作用機(jī)制仍未明了，比如：1)由于技術(shù)的限制，大多數(shù)研究對(duì)整體RNA進(jìn)行了檢測(cè)，但并未區(qū)分不同的RNA類型，也未說(shuō)明在m6A作用過(guò)程中FTO是否存在底物種類的偏好性或特異性；2)在大多數(shù)的結(jié)構(gòu)研究中認(rèn)為FTO的作用位點(diǎn)是m6A，但最近有學(xué)者提出FTO似乎優(yōu)先作用于2′-O-二甲基腺苷(m6Am)，這就需要更加精準(zhǔn)的檢測(cè)手段確定其具體的作用位點(diǎn)；3)在目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的甲基化酶、去甲基化酶中，F(xiàn)TO可單獨(dú)作用還是需要與其他甲基化酶協(xié)同作用以發(fā)揮其功能仍待探究。相信這些問(wèn)題的解決將加深人們對(duì)FTO的認(rèn)識(shí)，為深入了解發(fā)育過(guò)程、開(kāi)發(fā)藥物或治療疾病提供更加有效的手段。