宋煒，王佳，王飛娟，馬軍偉

肽基精氨酸脫亞胺酶4（peptidylarginine deiminase 4，PADI4）是一種翻譯后修飾酶，可在鈣離子存在的情況下將精氨酸殘基轉(zhuǎn)化為瓜氨酸殘基，瓜氨酸化后的蛋白質(zhì)分子構(gòu)象常發(fā)生改變，從而導(dǎo)致其生化活性改變。PADI4在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）患者血清中含量明顯升高，患者機(jī)體產(chǎn)生抗PADI4抗體，且PADI4瓜氨酸化多種蛋白質(zhì)可引起機(jī)體自身的免疫反應(yīng)，從而參與RA的發(fā)生與發(fā)展。近年來(lái)其他研究表明，PADI4也參與了腫瘤、潰瘍性結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化癥的發(fā)?。?-2］。目前已知鳥苷酸結(jié)合蛋白1（guanylatebinding protein 1，GBP1）在乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中具有抗腫瘤作用，其主要介導(dǎo)干擾素（interferon，IFN）的通路激活，從而促使數(shù)量眾多的IFN誘導(dǎo)基因表達(dá)，廣泛參與抗腫瘤以及抗病原微生物等過(guò)程［3］。GBP1可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯、修飾，并且已經(jīng)被證實(shí)在胃癌、卵巢癌、肝癌中特異性表達(dá)，可參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程［3-4］。但GBP1是否對(duì)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病有影響尚不明確。本研究旨探究非小細(xì)胞肺癌組織中PADI4、GBP1表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系，以期為臨床針對(duì)PADI4及GBP1進(jìn)行靶向治療提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年1月至2018年1月延安大學(xué)附屬醫(yī)院收治的非小細(xì)胞肺癌患者119例。其中男76例，女43例；年齡41～61歲，平均為（55.2±4.4）歲；病理類型：鱗癌50例，腺癌69例；腫瘤分化程度：高分化31例，中分化61例，低分化27例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移67例；TNM分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期41例，Ⅲ期37例，Ⅳ期14例。本研究經(jīng)延安大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（201403），所有患者簽署知情同意書。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合非小細(xì)胞肺癌相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］；（2）經(jīng)細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)檢查確診者；（3）臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴有活動(dòng)性感染及中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移者；（2）術(shù)前進(jìn)行全身化療、局部放射治療等其他抗腫瘤治療者。

1.3 研究方法 選取兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的檢驗(yàn)科醫(yī)生作為操作者。取所有患者非小細(xì)胞肺癌組織、癌旁組織進(jìn)行研究，具體操作如下：（1）將組織采用甲醛溶液固定、干燥、脫蠟水化、切片后放入含有抗原修復(fù)液的大燒杯中進(jìn)行抗原修復(fù)。（2）取出切片，甩掉并擦干切片上組織周圍的液體，滴加非特異性染色阻斷劑A液（常用3% H2O2），避光孵育10～15 min，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，然后用磷酸鹽緩沖液清洗3次，5 min/次；滴加非特異性染色阻斷劑B液50～100 μl（PADI4抗體與GBP1抗體均以1∶100稀釋），充分覆蓋標(biāo)本，置于濕盒內(nèi)，室溫孵育1 h，然后采用磷酸鹽緩沖液清洗3次，5 min/次；以未經(jīng)免疫的兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）代替PADI4作為陰性對(duì)照；滴加50～100 μl的二抗液（EnVision/HRP二抗），濕盒內(nèi)室溫孵育15～30 min，然后采用磷酸鹽緩沖液清洗3次，5 min/次；滴加新鮮配制的DAB顯色液，光鏡下控制顯色時(shí)間并以自來(lái)水終止顯色反應(yīng)。將已知的宮頸鱗癌組織PADI4及GBP1陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。每批染色在相同實(shí)驗(yàn)條件下設(shè)陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照。PADI4、GBP1陽(yáng)性表達(dá)均定位于細(xì)胞質(zhì)。染色強(qiáng)度分為無(wú)染色（0分）、染色淡黃（1分）、染色黃（2分）、染色棕黃（3分）。陽(yáng)性細(xì)胞百分比分為陰性（0分）、≤10%（1分）、＞10%且≤50%（2分）、＞50%且≤80%（3分）、＞80%（4分）。計(jì)算染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比之積，以0～4分為陰性，5～12分為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PADI4與GBP1在非小細(xì)胞肺癌患者不同組織中的表達(dá)情況 非小細(xì)胞肺癌組織中PADI4、GBP1陽(yáng)性率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 PADI4與GBP1在非小細(xì)胞肺癌患者不同組織中的表達(dá)情況比較〔n（%）〕Table 1 Comparison of expressions of PADI4 and GBP1 in different tissues of patients with non-small cell lung cancer

2.2 非小細(xì)胞肺癌組織中PADI4、GBP1表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 不同性別患者非小細(xì)胞肺癌組織中PADI4陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；鱗癌患者非小細(xì)胞肺癌組織中PADI4陽(yáng)性率高于腺癌患者，有吸煙史患者非小細(xì)胞肺癌組織中PADI4陽(yáng)性率高于無(wú)吸煙史患者，高分化及中分化患者非小細(xì)胞肺癌組織中PADI4陽(yáng)性率分別高于低分化患者，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者非小細(xì)胞肺癌組織中PADI4陽(yáng)性率高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，Ⅱ期及Ⅲ期患者非小細(xì)胞肺癌組織中PADI4陽(yáng)性率分別高于Ⅰ期及Ⅳ期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期患者非小細(xì)胞肺癌組織中GBP1陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；腺癌患者非小細(xì)胞肺癌組織中GBP1陽(yáng)性率高于鱗癌患者，有吸煙史患者非小細(xì)胞肺癌組織中GBP1陽(yáng)性率高于無(wú)吸煙史患者，中分化患者非小細(xì)胞肺癌組織中GBP1陽(yáng)性率高于高分化及低分化患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 非小細(xì)胞肺癌組織中PADI4、GBP1表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系〔n（%）〕Table 2 Relationship between PADI4, GBP1 expression in non-small lung cancer tissues and clinicopathological characteristics of patients

2.3 PADI4與GBP1在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 非小細(xì)胞肺癌組織中PADI4與GBP1的表達(dá)有相關(guān)性（χ2=5.227，P=0.022），見(jiàn)表3。

表3 PADI4與GBP1在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性（例）Table 3 Correlation of PADI4 and GBP1 expression in non-small cell lung cancer tissues

3 討論

隨著臨床醫(yī)療水平提高，早中期非小細(xì)胞肺癌的治療手段逐漸豐富，其中手術(shù)切除為首選治療方法，但是手術(shù)切除具有病灶清除不徹底、術(shù)后復(fù)發(fā)率高的缺點(diǎn)，且患者預(yù)后較差，如何利用新型肺癌相關(guān)生物標(biāo)志物進(jìn)行靶向治療，降低術(shù)后復(fù)發(fā)率是臨床重點(diǎn)關(guān)注的課題［5-7］。PADI4在肺癌及食管癌等惡性腫瘤中特異性表［8］，探究其在肺癌中的作用機(jī)制對(duì)肺癌治療靶點(diǎn)研究有著重要意義。鳥苷酸結(jié)合蛋白家族屬于干擾素誘導(dǎo)的鳥苷三磷酸酶超家族，是一種重要的干擾素刺激基因，其在調(diào)控細(xì)胞增殖和抵抗病原體感染方面具有重要作用［9］。

3.1 PADI4在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)的意義 NG等［9］研究表明，瓜氨酸化后的細(xì)胞角蛋白可有效阻斷細(xì)胞凋亡的機(jī)制，主要是其不易被含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶降解，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞不斷增殖，并減少腫瘤細(xì)胞凋亡，此外在角蛋白8、18、19被瓜氨酸化的過(guò)程中抗凝血酶明顯升高，導(dǎo)致與凝血酶活性密切相關(guān)的致癌機(jī)制被觸發(fā)，這是PADI4促使腫瘤細(xì)胞惡性增殖的重要機(jī)制。國(guó)外研究表明，PADI4主要通過(guò)與p53蛋白相互拮抗而發(fā)揮調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的作用，在針對(duì)p53靶基因啟動(dòng)子的研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的PADI4可有效對(duì)抗p53殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，其通過(guò)將組織蛋白H3甲基化位點(diǎn)精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)腫瘤細(xì)胞有利的瓜氨酸而發(fā)揮阻斷甲基化作用［10-11］。本研究結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌組織中PADI4陽(yáng)性率高于癌旁組織，鱗癌患者非小細(xì)胞肺癌組織中PADI4陽(yáng)性率高于腺癌患者，有吸煙史患者非小細(xì)胞肺癌組織中PADI4陽(yáng)性率高于無(wú)吸煙史患者，高分化及中分化患者非小細(xì)胞肺癌組織中PADI4陽(yáng)性率分別高于低分化患者，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者非小細(xì)胞肺癌組織中PADI4陽(yáng)性率高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，Ⅱ期及Ⅲ期患者非小細(xì)胞肺癌組織中PADI4陽(yáng)性率分別高于Ⅰ期及Ⅳ期患者。這證實(shí)了PADI4表達(dá)水平與吸煙史有關(guān)，與腫瘤細(xì)胞增殖調(diào)控以及腫瘤發(fā)生的關(guān)系密切，說(shuō)明PADI4在鱗癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，并且很有可能作為一種判斷癌組織分型、分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期的指標(biāo)。同時(shí)，患者腫瘤的惡性程度越高，非小細(xì)胞肺癌組織中PADI4表達(dá)亦越高，提示PADI4可能與非小細(xì)胞肺癌患者的臨床預(yù)后有關(guān)。

3.2 GBP1在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)的意義 研究表明，GBP1表達(dá)可能與宮頸癌患者肌層浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，其在高、中分化患者和臨床早期患者中均出現(xiàn)大量表達(dá)［12-13］。LI等［14］研究表明，多數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞中的炎癥因子可誘導(dǎo)GBP1大量表達(dá)，GBP1通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老、凋亡及抑制其增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等諸多作用，從而抑制炎癥反應(yīng)和乳腺癌血管形成。GBP1在內(nèi)皮細(xì)胞中的作用與其抗腫瘤作用密切相關(guān)。首先從GBP1生物活性的相關(guān)研究中可以得出其在內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等多個(gè)生理學(xué)效應(yīng)中發(fā)揮了重要作用［15］，有關(guān)研究表明，通常情況下無(wú)法檢測(cè)到GBP1的具體表達(dá)情況，但其在細(xì)胞遷移、生長(zhǎng)過(guò)程中有重要作用，可以在皮膚受到炎癥刺激時(shí)大量表達(dá)，尤其在有害藥物刺激下可提高自身活性，并利用過(guò)度表達(dá)來(lái)緩解刺激造成的生理?yè)p傷［8，16-17］。本研究結(jié)果顯示，腺癌患者非小細(xì)胞肺癌組織中GBP1陽(yáng)性率高于鱗癌患者。說(shuō)明GBP1在腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并且很有可能作為一種判斷癌組織分型的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，有吸煙史患者非小細(xì)胞肺癌組織中GBP1陽(yáng)性率高于無(wú)吸煙史患者，中分化患者非小細(xì)胞肺癌組織中GBP1陽(yáng)性率高于高分化及低分化患者，這證實(shí)了GBP1表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞增殖調(diào)控以及腫瘤發(fā)生的關(guān)系密切，提示GBP1與吸煙史有關(guān)，且可抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、降低致死率。

綜上所述，非小細(xì)胞肺癌組織中PADI4、GBP1表達(dá)與患者病理類型、吸煙史、腫瘤分化程度有關(guān)；此外，非小細(xì)胞肺癌組織中PADI4表達(dá)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，提示PADI4與GBP1在非小細(xì)胞肺癌篩查、診斷、預(yù)后及治療指導(dǎo)方面均有一定意義。但本研究為小樣本量、單中心研究，未來(lái)需要大樣本量、多中心研究進(jìn)一步證實(shí)本研究結(jié)論。

作者貢獻(xiàn)：宋煒、王佳、馬軍偉進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)；宋煒、馬軍偉進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；宋煒、王佳進(jìn)行論文的撰寫、修訂，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；宋煒、王佳、王飛娟進(jìn)行資料收集、整理；馬軍偉負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。