王星文，鄔 蘭，馬婷玉，尹青崗，師玉華，向 麗

（中藥鑒定與安全性評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

Dof（DNA binding with one finger）家族是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，可通過(guò)與啟動(dòng)子結(jié)合或者與特定蛋白相互作用來(lái)調(diào)控基因表達(dá)，參與多種植物生理過(guò)程的調(diào)控[1]。Dof蛋白N-末端共有一個(gè)高度保守的，由52 個(gè)氨基酸組成的Dof 結(jié)構(gòu)域，其中核心基序CX2CX21CX2C與Zn2+共價(jià)結(jié)合形成的單鋅指結(jié)構(gòu)，可以特異性的識(shí)別并結(jié)合下游基因啟動(dòng)子序列中核心基序?yàn)椤癟/AAAAG”的元件，但也有如南瓜AOBP基因，僅可以與“AGTA”核心的基序結(jié)合；Dof蛋白C-端的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域保守性低，氨基酸序列多變，主要作用是蛋白-蛋白結(jié)合互作，因此Dof家族在參與調(diào)控的途徑上存在較大差異，功能也具有多樣性[2-4]。自第一個(gè)Dof 蛋白ZmDof1 在玉米中被鑒定以來(lái)，Dof 家族已在擬南芥、水稻、番茄、白菜、菊花等[5-9]多種植物中被鑒定，主要參與光響應(yīng)調(diào)控[10-11]、光周期調(diào)控[12-13]、植物激素和非生物脅迫信號(hào)通路傳導(dǎo)[14-15]、糖代謝[16]、氮代謝[17]、種子發(fā)育[18]和細(xì)胞周期調(diào)控[19]等復(fù)雜植物生理過(guò)程。如Xu 等研究發(fā)現(xiàn)擬南芥Dof 家族基因AtOBP4（OBF BINDING PROTEIN 4）參與調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，可以抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，致使植株生長(zhǎng)出現(xiàn)矮化、少花等明顯缺陷[19]。另有一類Dof 家族基因AtCDFs（CYCLING DOF FACTOR）廣泛參與到光周期調(diào)控中[13]，過(guò)表達(dá)AtCDF1基因的擬南芥植株表現(xiàn)為早花表型[20]；而在番茄中AtCDFs的同源基因SlCDFs不僅參與光周期開(kāi)花調(diào)控，對(duì)植株在干旱、高鹽等非生物脅迫下的耐受性也有增強(qiáng)作用[12]。AtDAG1（DOF AFFECTING GERMINATION 1）突變的擬南芥種子對(duì)紅光敏感，受光敏色素B（phytochrome B,phyB）基因的調(diào)控，可降低種子萌發(fā)過(guò)程中對(duì)紅光與赤霉素（Gibberellic acid,GA）的需求量，并參與負(fù)調(diào)控光介導(dǎo)的下胚軸生長(zhǎng)過(guò)程[18,21]。AtOBP3（OBF4 BINDING PROTEIN 3）受水楊酸（Salicylic acid, SA）與生長(zhǎng)素的影響，同時(shí)也是phyB下游調(diào)控因子，且受到隱花色素1調(diào)控，其突變體在藍(lán)光下子葉生長(zhǎng)明顯大于野生型[10]。綜上可見(jiàn)，Dof 家族轉(zhuǎn)錄因子是響應(yīng)光和激素脅迫的重要調(diào)控因子，極大的參與到植物生理活動(dòng)中。而植物代謝產(chǎn)物，尤其是作為藥用活性成分的次生代謝產(chǎn)物也多是因響應(yīng)外界逆境信號(hào)而累積[22]。因此，探究轉(zhuǎn)錄水平上植物光和激素的響應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)理解和進(jìn)一步深入研究植物次生代謝產(chǎn)物生物合成機(jī)制尤為重要。

青蒿來(lái)源于菊科植物黃花蒿（Artemisia annua）的干燥地上部分，是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥，具有清虛熱、除骨蒸等功效，其主要活性成分青蒿素及其衍生物是聯(lián)合國(guó)推薦的抗瘧一線藥物。而除治療瘧疾外，青蒿素及其衍生物在治療紅斑狼瘡等免疫性疾病方面也有突出作用[23]。黃花蒿是青蒿素提取的主要原料藥材，目前對(duì)于青蒿素的生物合成途徑也已有了許多研究，其中非生物脅迫及生物脅迫均對(duì)其具有促進(jìn)作用[24-25]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在紅光和藍(lán)光處理后，黃花蒿中青蒿素的含量明顯提升[26]。GA 和紫外線B（UV-B）處理也對(duì)青蒿素生物合成具有正向影響作用，協(xié)同促進(jìn)了植株體內(nèi)青蒿素的積累[22]。Dof 家族蛋白廣泛參與植物響應(yīng)非生物脅迫的復(fù)雜調(diào)控過(guò)程，但在黃花蒿中還未被系統(tǒng)鑒定與分析?；谄浼易骞δ苓M(jìn)行推測(cè)，AaDof 家族極有可能通過(guò)光與激素等響應(yīng)途徑影響黃花蒿體內(nèi)青蒿素的生物合成。因此，本研究基于黃花蒿基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)黃花蒿中Dof 家族進(jìn)行鑒定，并對(duì)其理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育、保守結(jié)構(gòu)、GA 和UV-B 脅迫下的基因表達(dá)模式等進(jìn)行分析，以期為深入探索Dof 家族功能、進(jìn)一步解析青蒿素生物合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用黃花蒿種質(zhì)為課題組于海南收集的野生黃花蒿品種。種子播種后在光周期16/8 h，溫度25°C 的溫室中培養(yǎng)4 周。以100 μmol·L-1GA 和2 W/m2UV-B 燈（275-320 nm，Huaqiang）進(jìn)行脅迫處理，對(duì)照組不進(jìn)行任何處理。GA、UV-B 處理及GA+UV-B協(xié)同處理6 h 后采集幼苗的所有地上部分，每10 株混合為一個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理取三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。材料經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 黃花蒿Dof家族鑒定及序列分析

本研究基于黃花蒿（Artemisia annua）基因組數(shù)據(jù)（PRJNA416223）。經(jīng)在線網(wǎng)站iTAK（http://itak.feilab.net/）檢索后獲得候選AaDof 蛋白序列，通過(guò)Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pfam.sanger.ac.uk/search）鑒定各序列結(jié)構(gòu)域模型完整性，去除重復(fù)及結(jié)構(gòu)不完整序列。然后利用ExPASy Proteomic Server （http://expasy. org/tools/protparam.html）對(duì)序列蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并通過(guò)在線軟件ProtComp 9.0（http://linux1.softberry.com/berry. phtml? topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc）進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。

1.3 多序列比對(duì)及進(jìn)化分析

將鑒定的AaDof 序列與擬南芥全部36 個(gè)AtDof 序列及水稻和番茄中部分同源Dof蛋白序列進(jìn)行聚類分析[5,8]，采用MEGA X 中CLUSTALW 工具進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，利用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap 重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1000次。AaDof 序列自身以同樣方法建樹(shù)分析。以EvolView（https://www. evolgenius. info/evolview/#login）進(jìn)行可視化修飾。

1.4 基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)DNAMAN 對(duì)AaDof 蛋白進(jìn)行序列比對(duì)分析，并 通 過(guò)MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）和NCBI-CDD（https://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）對(duì)AaDof 家族成員蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行檢索。使用TBtools提取基因結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行可視化分析。

1.5 啟動(dòng)子序列結(jié)合元件分析

提取基因組中AaDof基因上游2000bp 序列，提交至 PlantCARE （http://bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行分析，篩選并合并響應(yīng)元件標(biāo)簽后應(yīng)用TBtools軟件進(jìn)行可視化。

1.6 基因表達(dá)模式分析與實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

基因表達(dá)模式分析所用數(shù)據(jù)為課題組前期獲得的GA 和UV-B 處理前后黃花蒿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[22]。采用TBtools 軟件對(duì)AaDof基因在GA、UV-B 及GA+UV-B協(xié)同脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行熱圖分析，并以GA+UVB 組和對(duì)照組的AaDof基因表達(dá)量（FPKM 值）數(shù)據(jù)差異倍數(shù)≥2.0為閾值篩選差異表達(dá)基因。

以AaActin[26]為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證。樣品總RNA 提取方法參照EASYspin Plus Plant RNA Kit（Aidlab Biotechnologies）試劑盒步驟，總RNA 反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA 使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（TransGen Biotech）試劑盒方法。qRT-PCR 引物通過(guò)Primer Premier 3.0 軟件設(shè)計(jì)（表1），并利用Primer-BLAST（http://ncbi.nlm.nih.gov./tools/primer-BLAST）進(jìn)行引物序列特異性分析。qRT-PCR體系參照TransStart Green qPCR SuperMix UDG（Transgene）體系：Mix10.0 μL，正向引物0.3 μM，反向引物0.3 μM，cDNA 1.0 μL，ddH2O 8.4 μL。qRT-PCR在Rotor-GeneQ（Qiagen）儀器上進(jìn)行，程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性10 min；95℃、10 s，60℃、15 s，72℃、20 s，40 個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析程序：95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s。

2 結(jié)果

2.1 黃花蒿Dof家族鑒定及理化性質(zhì)分析

本研究從黃花蒿基因組數(shù)據(jù)中提取黃花蒿CDS序列，經(jīng)iTAK在線網(wǎng)站檢索后初步獲得91條AaDof候選序列。以Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定后去除冗余，最終共鑒定出51 個(gè)AaDof 蛋白，均具有完整的zf-Dof 結(jié)構(gòu)域（表2）。特征分析發(fā)現(xiàn)，AaDof家族蛋白氨基酸長(zhǎng)度在115 aa-453 aa，分子量為12.8-49.4 KDa，理論等電點(diǎn)在4.43-10.31，親水指數(shù)均為負(fù)數(shù)，顯示為親水性蛋白，不 穩(wěn) 定 系 數(shù) 除AaDof21、AaDof24、AaDof29、AaDof38 外均大于40，表明大部分AaDof 為不穩(wěn)定蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，39個(gè)基因定位于細(xì)胞核，占大多數(shù)。12 個(gè)基因定位在細(xì)胞外，分布在除C2.1外的所有亞族中，其中C3亞族的所有序列均顯示為細(xì)胞外定位，這可能與其參與調(diào)控的功能機(jī)制密切相關(guān)[27]。

表2 黃花蒿Dof家族基本信息

2.2 黃花蒿Dof家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

將AaDof 蛋白序列與36 個(gè)擬南芥Dof 序列及部分水稻和番茄[5,8]中報(bào)道的Dof 序列進(jìn)行同源對(duì)比，并以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。聚類結(jié)果顯示AaDof序列易與自身聚為一支，具有較高的保守性，此外較多與番茄Dof 序列聚為一支，顯示二者進(jìn)化更為相似。依據(jù)Lijavetzky 等[5]分類方法將AaDof 分為A、B、C1、C2.1、C2.2、C3、D1、D2 8 個(gè)亞族，并基于亞族順序進(jìn)行重命名。A 亞族成員有13 個(gè)，相比擬南芥中3 個(gè)，水稻中4個(gè)，黃花蒿中A 亞族可能發(fā)生了復(fù)制事件。B 亞族成員共有7個(gè)，C1、C2.1、C2.2和C3亞族成員分別有4個(gè)、5 個(gè)、4 個(gè)和3 個(gè)，D1 和D2 亞族成員則分別有9 個(gè)和7個(gè)。同一亞族的Dof 蛋白功能具有相似性，依據(jù)進(jìn)化樹(shù)聚類可預(yù)測(cè)其功能。

2.3 黃花蒿Dof家族的結(jié)構(gòu)分析

多序列對(duì)比顯示AaDof 蛋白中Dof 結(jié)構(gòu)域非常保守（圖2），除固定的C2-C2結(jié)構(gòu)外，結(jié)構(gòu)域中其他氨基酸分布也極為相似，與前人研究結(jié)果一致[8]。經(jīng)CDD數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析，AaDof 家族除了zf-Dof 結(jié)構(gòu)域外，AaDof46與AaDof49序列N-端還分別存在鋅指超家族N-端和SRPBCC 超家族C-端的部分結(jié)構(gòu)域、AaDof44序列C-端存在Dimer_Tnp_hAT 結(jié)構(gòu)域，其是HAT 超家族C-端二聚化結(jié)合域，在蛋白結(jié)合互作途徑上可能具有參考意義。經(jīng)MEME 進(jìn)行保守motif 分析共檢索到12 個(gè)motif，其中所有AaDof 序列均含有motif1，為Dof 保守結(jié)構(gòu)域，其余motif 大部分都在C-端，基序多變但在亞族間相對(duì)保守，推測(cè)為不同蛋白結(jié)合域。C2.2 亞組均含有motif5，C3 亞族均含有motif4、motif7、motif8 和motif9，C1 亞族大部分共有motif12，D1 亞族大部分共有motif2 和motif4，D2 大部分共有motif3，這些保守結(jié)構(gòu)使亞族間功能趨于相似?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示AaDof基因存在內(nèi)含子較少，基本僅含有0-2 個(gè)，AaDof46含有3 個(gè)。其中AaDof21和AaDof4中均含有一個(gè)異常的大內(nèi)含子，還需通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證（圖3）。

圖2 黃花蒿Dof家族保守結(jié)構(gòu)域分析

圖3 黃花蒿Dof家族結(jié)構(gòu)域與基因結(jié)構(gòu)分析

續(xù)表

圖1 黃花蒿Dof家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.4 黃花蒿Dof家族啟動(dòng)子結(jié)合元件分析

對(duì)AaDof啟動(dòng)子區(qū)序列進(jìn)行分析，其中AaDof12和AaDof47基因啟動(dòng)子區(qū)域因基因組拼接問(wèn)題不足2000 bp（圖4）。所有啟動(dòng)子區(qū)域均存在SA、GA、脫落酸（Abscisic acid, ABA）、茉莉酸（Jasmonic acid, JA）等多種激素響應(yīng)元件以及低溫、干旱等環(huán)境因子響應(yīng)元件，尤其如D 亞族AaDof40、AaDof41等基因啟動(dòng)子區(qū)域響應(yīng)元件較多，可能參與到復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中。A亞族、C2.1、C2.2 和C3 亞族基因的啟動(dòng)子區(qū)富含如GBox（CACGTT）、GT1-motif（GGTTAA）等參與光相關(guān)調(diào)控的元件，其功能可能也與光調(diào)控相關(guān)。另外AaDof啟動(dòng)子區(qū)還存在MYB轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合域，細(xì)胞周期及種子發(fā)育等功能相關(guān)響應(yīng)元件，有待進(jìn)一步分析。本結(jié)果將為AaDof基因的功能預(yù)測(cè)提供支持。

圖4 黃花蒿Dof基因啟動(dòng)子作用元件分析

注：A：基因表達(dá)熱圖分析；B：差異基因的qRT-PCR驗(yàn)證，±SD，n=3，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.5 黃花蒿Dof家族基因的表達(dá)模式分析

課題組前期研究結(jié)果表明GA 與UV-B 處理都對(duì)黃花蒿中青蒿素含量具有提升作用，其中6 h 時(shí)GA+UV-B 處理作用最明顯，測(cè)得青蒿素含量最高[22]。因此基于GA、UV-B 及GA+UV-B 協(xié)同處理下6h 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)AaDof的表達(dá)模式進(jìn)行分析（圖5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，41 個(gè)AaDof基因有表達(dá)且受UV-B 脅迫影響明顯。A 亞族除AaDof1和AaDof13外均在UV-B 脅迫下表達(dá)下調(diào)，C1 亞族和C2.1 亞族的大部分成員在UV-B 脅迫下表達(dá)上調(diào)。B 與D 亞族表達(dá)模式復(fù)雜，但大部分基因也都響應(yīng)UV-B 調(diào)控，尤其AaDof14和AaDof49，僅在UV-B 脅迫下表達(dá)有上調(diào)。此外，部分基因也響應(yīng)GA 脅迫，AaDof26、AaDof46在GA 脅迫下表達(dá)上調(diào)，AaDof15、AaDof22、AaDof40、AaDof41在GA 脅迫下表達(dá)下調(diào)，均可能密切參與到GA 激素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中。而AaDof28、AaDof48基因僅在GA+UV-B 協(xié)同處理下高表達(dá)，這些Dof基因可能參與更加復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程。余下10 個(gè)AaDof基因未檢測(cè)到表達(dá)，其中A 亞族基因2 個(gè)，D2 亞族基因3 個(gè)。C2.2 和C3 兩亞族均只有1 個(gè)基因檢測(cè)到微量表達(dá)，分別為AaDof32和AaDof34?；贕A+UV-B 脅迫處理下表達(dá)量數(shù)據(jù)和具體FPKM 進(jìn)行篩選，A 亞 族AaDof1、B2 亞 族AaDof17和D1 亞 族AaDof443 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)倍數(shù)大于2。qRT-PCR 驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這3 個(gè)基因在UV-B 處理下表達(dá)量顯著上調(diào)，而在GA 處理下表達(dá)量也有上升，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)定數(shù)據(jù)存在一定差異但趨勢(shì)一致。

3 討論

本文對(duì)黃花蒿基因組進(jìn)行分析，共鑒定出51 個(gè)Dof 家族轉(zhuǎn)錄因子。研究報(bào)道擬南芥中Dof 家族基因有36 個(gè)[5]、白菜中有76 個(gè)[7]、菊花中有20 個(gè)[7]，可見(jiàn)Dof家族在不同植物中數(shù)目差異較大。特征分析發(fā)現(xiàn)AaDof 家族蛋白大部分為親水不穩(wěn)定蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果則發(fā)現(xiàn)有23%的AaDof基因未定位在細(xì)胞核，而是定位分泌在細(xì)胞外，或可能于過(guò)氧化物酶體、葉綠體、高爾基體等細(xì)胞器中表達(dá)，這些基因的功能或許也存在特異性[27]。對(duì)Dof 家族蛋白保守結(jié)構(gòu)和基因結(jié)構(gòu)的分析顯示，AaDof 家族進(jìn)化過(guò)程非常保守，Dof 結(jié)構(gòu)域核心基序在不同物種間也極為相似。蛋白保守基序具有多樣性，但在亞族間相對(duì)一致，這也是亞族中基因功能具有相似性的基礎(chǔ)。此外，一些AaDof 蛋白如AaDof1、AaDof6 雖然含有保守的Dof 結(jié)構(gòu)域，但是氨基酸長(zhǎng)度小于200aa，仍需要進(jìn)一步克隆驗(yàn)證。根據(jù)Lijavetzky 等[5]分類方法將AaDof 家族分為A、B、C1、C2.1、C2.2、C3、D1、D2 8 個(gè)亞族，其中A 亞族與B 亞族均有一支被分出且沒(méi)有與擬南芥Dof 序列聚類，而是與水稻和番茄Dof序列相似度更高，這些基因顯示出不同的進(jìn)化趨勢(shì)，在功能上可能也與原亞族有一定區(qū)別。進(jìn)一步根據(jù)蛋白序列同源性對(duì)其功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)AaDof家族基因可能參與細(xì)胞周期、光和激素等多種調(diào)控過(guò)程中。光敏色素A（phytochrome A,phyA）和phyB基因受紅光和遠(yuǎn)紅光誘導(dǎo)表達(dá)，參與調(diào)控幼苗的去黃化以及種子中GA和ABA激素調(diào)控等生理過(guò)程。擬南芥中AT1G29160.1（AtCOG1）參與phyA和phyB信號(hào)通路下游調(diào)控。D1 亞族中AaDof44 與其聚為一支，可能為黃花蒿中COG1 的同源基因并具有類似功能[11]。其余D1 亞族成員則與AtCDFs 聚為一支，可能參與到光周期及非生物脅迫相關(guān)調(diào)控中[12]。AT2G46590.1（DAG1）也為phyB下游調(diào)控因子，在種子萌發(fā)過(guò)程中起重要作用，C2.1 亞族AaDof29 與其聚為一支，因此AaDof29 功能可能與紅光響應(yīng)和種子發(fā)育相 關(guān) 調(diào) 控 有 關(guān)[18,21]。 而AaDof18 與AT3G55370.1（AtOBP3）聚為一支，推測(cè)其功能與AtOBP3相似，可能也響應(yīng)SA 和紅藍(lán)光，參與植株下胚軸與子葉的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)過(guò)程中[10]。啟動(dòng)子區(qū)的響應(yīng)元件分析也是預(yù)測(cè)基因功能的重要手段。通過(guò)對(duì)AaDof序列上游2000 bp的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)AaDof基因可能廣泛參與到植物激素和光等調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中。其中，A、C2.1、C2.2和C3亞族基因啟動(dòng)子序列富含光調(diào)控元件，其亞族功能可能也與光密切相關(guān)。

植物響應(yīng)外界環(huán)境信號(hào)進(jìn)而調(diào)控體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物合成積累，Dof 家族作為光與植物激素響應(yīng)調(diào)控途徑上重要轉(zhuǎn)錄因子家族，也極有可能參與到黃花蒿體內(nèi)青蒿素等次生代謝產(chǎn)物的合成調(diào)控中。目前已證實(shí)水稻OsDof3基因參與赤霉素靶基因的調(diào)控，Yamamoto 等進(jìn)一步將其鑒定為Dof蛋白P-box 結(jié)合因子（PBF），其可與bZIP 轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同互作，調(diào)控水稻種子中蛋白儲(chǔ)存[28-29]。草莓中FaDOF2通過(guò)與MYB 轉(zhuǎn)錄因子FaEOBII結(jié)合參與果實(shí)中苯丙烷途徑中丁香酚含量的調(diào)控，并受到果實(shí)中ABA 和生長(zhǎng)素水平的調(diào)節(jié)[30]。本研究通過(guò)對(duì)黃花蒿GA 和UV-B 及二者協(xié)同處理下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大部分AaDof基因都在脅迫下表達(dá)，尤其對(duì)UV-B 處理敏感，在GA+UVB 協(xié)同處理時(shí)UV-B 處理對(duì)基因表達(dá)影響占主導(dǎo)。A亞族大部分成員表達(dá)量響應(yīng)UV-B 脅迫而下調(diào)，C1 亞族和C2.1亞族大部分成員表達(dá)量響應(yīng)UV-B脅迫而上調(diào)，這些亞族基因均參與到UV-B響應(yīng)調(diào)控過(guò)程中，與啟動(dòng)子序列分析結(jié)果較一致。同時(shí)也有部分基因僅響應(yīng)GA 脅迫。此外，C2.2 和C3 亞族基本無(wú)表達(dá)，目前研究表明C3 亞族基因功能與植物分枝和種皮發(fā)育等有關(guān)，同時(shí)參與到擬南芥苯丙烷代謝途徑中，可以沉默類黃酮成分生物合成相關(guān)基因表達(dá)，并促進(jìn)下胚軸和花蕾中羥基肉桂酸的積累[31-32]，本文分析可為黃花蒿中相關(guān)通路后續(xù)研究提供參考依據(jù)。對(duì)差異基因進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證結(jié)果顯示AaDof1、AaDof17、AaDof44均響 應(yīng)GA 和UV-B 處理，并在UV-B 脅迫下相對(duì)表達(dá)量顯著上升。綜合化學(xué)含量變化分析，這三個(gè)基因可能與黃花蒿中青蒿素生物合成有關(guān)，并起到正向調(diào)節(jié)作用。其中AaDof1 在進(jìn)化分析中與AtOBP4同聚在A 亞族，功能可能與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)，并可能參與到ABA 應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)中[33]。B 亞族AaDof17 與擬南芥PEAR（PHLOEM EARLY DOF）類蛋白序列較為相似，該類蛋白可在胞間短距離移動(dòng)，功能特異性調(diào)控細(xì)胞平周分裂并參與植物形成層發(fā)育[34]。D1 亞族AaDof44 與AtCOG 聚為一支，其響應(yīng)GA 和UV-B 脅迫的表達(dá)模式與AtCOG 報(bào)道功能有一定相關(guān)性。這些基因序列均與擬南芥等模式植物基因存在較大差異，推測(cè)在黃花蒿中功能更具有特異性，并可能會(huì)更多參與到黃花蒿體內(nèi)萜類代謝的復(fù)雜調(diào)控中[35-36]。而在GA+UV-B 協(xié)同處理時(shí)相對(duì)表達(dá)量較UV-B 處理時(shí)有所下降的情況，可能與UV-B和GA間復(fù)雜的調(diào)控抑制關(guān)系有關(guān)[37]。

青蒿素的生物合成途徑涉及復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，是不同光質(zhì)、JA、SA、ABA、GA 等激素共同作用的結(jié)果[38]。基于模式植物研究對(duì)一些基因在黃花蒿中同源序列功能的研究，也可能為青蒿素合成途徑的進(jìn)一步解析提供理論依據(jù)。如Zhuo 等[15]研究表明AtDof2.1（AT2G28510.1）是JA 激素調(diào)控途徑的上游調(diào)控因子，可以直接結(jié)合MYC2的啟動(dòng)子，影響下游基因表達(dá)。Ma 等[39]發(fā)現(xiàn)了黃花蒿中涉及ABA 與JA 激素途徑的兩條轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其下游調(diào)控因子AaTCP14/15對(duì)黃花蒿中青蒿素合成具有促進(jìn)作用，而擬南芥中AtDof6被驗(yàn)證可與黃花蒿AaTCP14的同源基因AtTCP14互作[40]。本文從基因組水平系統(tǒng)鑒定了黃花蒿Dof 家族并對(duì)其特征和表達(dá)模式進(jìn)行分析，為黃花蒿Dof家族基因功能與相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的進(jìn)一步研究提供支持，并為轉(zhuǎn)錄水平上黃花蒿中青蒿素及其他次生代謝產(chǎn)物生物合成調(diào)控機(jī)制的解析提供參考。