鄧淮鈺，李 倩，郭園藝，張?bào)K驁，郭宏波＊＊，麻鵬達(dá)＊＊

（1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院 咸陽(yáng) 712100；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)院 咸陽(yáng) 712100）

丹參（Salvia miltiorrhizaBunge）是唇形科鼠尾草屬的藥用植物，被譽(yù)為治療心腦血管類疾病的重要中藥材之一，其干燥根及根莖通常作為藥材被使用，富有諸多有效藥用成分如丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、二氫丹參酮和丹參酮ⅡA 等脂溶性成分，以及丹酚酸A、迷迭香酸以及丹酚酸B 等水溶性成分[1]。但是丹參中有效藥用物質(zhì)的含量受各種因素影響，不同產(chǎn)地來(lái)源的丹參藥用成分含量的差異高達(dá)10 倍[2-3]。近年來(lái)大多研究集中在提高丹參藥用成分含量和開發(fā)利用丹參資源等方面，對(duì)代謝過(guò)程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行調(diào)控是重要方法之一，丹參重要藥用活性成分丹參酮和丹酚酸類物質(zhì)合成通路中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子家族包括bHLH 家族[4-5]、MYB 家族、ERF 家族、WRKY 家族以及AREB/ABFs 家族等[6]，一方面可以過(guò)表達(dá)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)相應(yīng)代謝物質(zhì)的積累，如提高轉(zhuǎn)錄因子SmMYB36 表達(dá)量能有效促進(jìn)丹參酮積累[7]，過(guò)表達(dá)SmMYB98 能使丹參酮和丹酚酸的含量升高[8]，另一方面可以對(duì)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行修飾來(lái)提高藥用成分含量，但是轉(zhuǎn)錄因子如何調(diào)控丹參酮及酚酸類次生代謝物質(zhì)合成通路并不完全清楚，泛素化修飾轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控丹參活性物質(zhì)合成的研究也較少。

泛素化修飾是植物細(xì)胞中蛋白質(zhì)翻譯后表達(dá)修飾的重要部分，主要通過(guò)在一組酶的作用下使得泛素分子靶向修飾底物即靶蛋白從而使其穩(wěn)定性和亞細(xì)胞定位發(fā)生變化后改變植物生長(zhǎng)發(fā)育以及次生代謝過(guò)程。其廣泛參與細(xì)胞生命體各個(gè)活動(dòng)，如通過(guò)參與ABA 信號(hào)來(lái)促進(jìn)或抑制植物種子萌發(fā)[9]、介導(dǎo)植物冷脅迫相關(guān)激素信號(hào)通路響應(yīng)冷脅迫[10]、參與對(duì)水分脅迫和干旱脅迫處理的負(fù)調(diào)節(jié)作用如與野生型水稻相比，Ubi：RNAi-OsPUB41敲除突變體和ospub41抑制突變體在蒸騰失水、長(zhǎng)期脫水反應(yīng)中表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗旱性[11]?？梢?jiàn)，泛素化修飾可參與信號(hào)傳導(dǎo)從而調(diào)控植物生命活動(dòng)。蛋白泛素化過(guò)程主要以三種酶完成，即E1 泛素活化酶、E2 泛素激活酶和E3 泛素連接酶。而E3泛素連接酶在泛素化過(guò)程中承擔(dān)主要的作用，其負(fù)責(zé)識(shí)別目標(biāo)蛋白從而使得泛素分子從E2 泛素連接酶上脫離而作用于靶蛋白[12]。E3 泛素連接酶COP1（constitutively photomorphogenic1）具有許多種類，在蛋白質(zhì)泛素化過(guò)程中特異性識(shí)別靶蛋白，并通過(guò)26S 蛋白酶體系統(tǒng)參與靶蛋白的泛素化[13-14]。其是一個(gè)保守的RING 類型E3Ub（ubiquitin）泛素連接酶，通過(guò)Ub 蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)各種光形態(tài)發(fā)生促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子的降解，而其他COP/DET/FUS 蛋白可能協(xié)助這一過(guò)程[15-17]。研究發(fā)現(xiàn)，COP1 可以介導(dǎo)擬南芥中轉(zhuǎn)錄因子MYB 和bHLH 對(duì)植物萌發(fā)生長(zhǎng)、光形態(tài)建成以及次生代謝等生理過(guò)程的調(diào)控[18-19]。擬南芥COP1 受光照負(fù)調(diào)控，其大多與核定位蛋白結(jié)合抑制光形態(tài)建成[20]。如COP1定位細(xì)胞核內(nèi)靶向結(jié)合bHLH 轉(zhuǎn)錄因子HFR1 并通過(guò)26S蛋白酶體途徑進(jìn)行降解，而光照可促進(jìn)COP1從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移而逆轉(zhuǎn)該作用，從而促進(jìn)HFR1 的積累[21]。COP1 也可以與光照共同影響擬南芥中的MYB 轉(zhuǎn)錄因子PAP1 和PAP2 蛋白穩(wěn)定性[22]。蘋果中E3 泛素連接酶MdCOP1 在黑暗條件下會(huì)與MdMYB1互作介導(dǎo)其降解，負(fù)調(diào)控蘋果花青素生物合成[23]。水稻中具有E3泛素連接酶活性的ZFP181過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致GA 信號(hào)途徑中相關(guān)基因表達(dá)量下降，內(nèi)源GA 含量降低，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致氨基酸衍生物和吲哚衍生物的合成途徑相關(guān)蛋白水平降低，說(shuō)明E3泛素連接酶會(huì)影響植物的激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程以及代謝物合成過(guò)程[24]。目前COP1 參與的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在模式植物擬南芥以及其他植物中得到了廣泛研究，但是通過(guò)泛素化修飾丹參酮和酚酸等藥用活性成分代謝途徑中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子從而調(diào)控次生代謝物含量的研究較少。

本研究克隆丹參泛素連接酶SmCOP1 基因，并對(duì)其序列及所編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行一定的生物信息學(xué)分析，通過(guò)與丹參酮和酚酸類物質(zhì)合成通路中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的互作初步篩選E3 泛素連接酶泛素化修飾的底物，預(yù)測(cè)丹參E3泛素連接酶通過(guò)介導(dǎo)植物激素信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程參與次生代謝物質(zhì)的合成，重點(diǎn)說(shuō)明泛素化在植物次生代謝途徑中所起到的關(guān)鍵作用，為采用遺傳轉(zhuǎn)化策略提高丹參藥用成分含量以及改良丹參品質(zhì)提供新的思路和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 所需材料

1.1.1 所需植物材料

無(wú)菌丹參苗，其種子于商洛基地的天士力公司獲得。

1.1.2 所需試劑與酶

植物基因組RNA 提取試劑盒和普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購(gòu)自Tiangen Biotechnology(Beijing)公司；工具酶PrimeSTAR? Max DNA Polymerase 和高效cDNA 鏈合成試劑盒購(gòu)自Takara 公司；pMD18-T 克隆載體購(gòu)自Takara公司；E.coli DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；AH109 酵母感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA 公司；Gateway 系統(tǒng)BP 反應(yīng)酶和LR 反應(yīng)酶購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；引物合成和測(cè)序由上海生工、西安奧科和Invitrogen 公司完成。

1.1.3 所需引物

使用Primer Premier 5.0 生物軟件設(shè)計(jì)，送由TsingkeBiotechnology 公司合成，本實(shí)驗(yàn)所需引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2 丹參cDNA的獲得

先取少許種子用自來(lái)水于干凈盆中浸泡12 h，接著流動(dòng)自來(lái)水小水流沖洗12 h；將預(yù)處理的種子于超凈臺(tái)中滅菌消毒。首先提前準(zhǔn)備無(wú)菌水、無(wú)菌槍頭、0.1% HgCl2、75%乙醇以及0.1%瓊脂水等滅菌材料。將丹參種子先于75%乙醇浸泡1 min，接著無(wú)菌水懸浮3-4 次；然后0.1% HgCl2 懸浮浸泡15 min，用無(wú)菌水沖洗7 次。注意在懸浮過(guò)程中要晃動(dòng)溶液，保證種子與消毒液以及無(wú)菌水充分接觸，避免消毒不徹底；最后用滅菌過(guò)的鑷子將種子均勻放置于MS 培養(yǎng)基，結(jié)束后將其培養(yǎng)于溫度和光照周期適宜的組培間。選擇三周齡長(zhǎng)勢(shì)良好的丹參組培苗，取適量完整葉片，使用植物基因組提取RNA試劑盒將其進(jìn)行液氮研磨提取丹參無(wú)菌苗的總RNA。提取結(jié)束后通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳看其RNA是否完整無(wú)降解，并采用核酸定量?jī)x檢測(cè)所提取RNA 濃度和純度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將上述RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并用核酸定量?jī)x檢測(cè)所提取cDNA的質(zhì)量并記錄。

1.3 COP1基因克隆與測(cè)序

采用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)的引物COP1a-F/R、COP1b-F/R，以上述獲得的cDNA 為模板，采用高保真酶進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)程序：98℃，5min；98℃，10 s；56℃，30 s；72℃，1min；34 個(gè)循環(huán)。PCR 體系為PrimeSTAR Max Premix 使用25 μL 終濃度為1X；分別使用10-15 pmol，終濃度為0.2-0.3 μM 的特異性引物Primer 1和Primer 2，最后使用滅菌蒸餾水將體系補(bǔ)至50 μl。

獲得的PCR 產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶的存在情況并回收，使用加A 反應(yīng)試劑盒獲得目的片段，之后再次使用瓊脂糖凝膠電泳和DNA回收試劑盒對(duì)獲得的特異性片段進(jìn)行檢測(cè)和回收。采用Takara pMD?18-T Vector Cloning Kit 試劑盒將目的片段連接于pMD18-T。首先取0.1-0.3 pmol 的上述所回收目的片段和1 μL pMD18-T 放置于小型離心管中，ddH2O 補(bǔ)至5 μL，最后將反應(yīng)液放置于PCR 擴(kuò)增儀中16℃反應(yīng)1 h。將全部連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 大腸桿菌感受態(tài)，平板上的陽(yáng)性菌落擴(kuò)搖后進(jìn)行菌液PCR，取500 μL 陽(yáng)性菌液送測(cè)。送測(cè)結(jié)果無(wú)誤后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 載體構(gòu)建

采用OMEGA?質(zhì)粒小提試劑盒提取實(shí)驗(yàn)室保存的pDONR207 質(zhì)粒并保存。使用所構(gòu)建載體pMD18-T-COP1a 作為PCR 反應(yīng)模板，采用帶有重組接頭的特異性引物attb-COP1a-F/R 進(jìn)行PCR 反應(yīng)，結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其有無(wú)及位置大小并擴(kuò)大反應(yīng)體系將目的片段進(jìn)行跑膠回收，使用Gateway?BP Clonase?II Enzyme mix試劑盒說(shuō)明書將目的條帶連接于pDONR207 質(zhì)粒構(gòu)建入門載體。使用Gateway?試劑盒，將所構(gòu)建的入門載體和pDEST-GBKT7 表達(dá)載體以3:1反應(yīng)體系進(jìn)行LR反應(yīng)連接。25℃過(guò)夜連接并第2天全部連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，挑菌擴(kuò)搖后進(jìn)行菌液PCR，將陽(yáng)性菌液送測(cè)并將測(cè)序結(jié)果無(wú)誤的單克隆菌液進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.5 E3連接酶SmCOP1的序列生物信息學(xué)分析

首先從NCBI 網(wǎng)站下載擬南芥中的蛋白序列，根據(jù)AtCOP1 蛋白序列在本實(shí)驗(yàn)保存的丹參基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中利用在線軟件HMMER3程序搜索獲得包含COP1蛋白相對(duì)保守結(jié)構(gòu)域的序列，并使用在線程序SMART分析獲得SmCOP1 基因家族序列。利用ExPASy 數(shù)據(jù)庫(kù)中的在線ProtParam 軟件分析丹參SmCOP1 蛋白的氨基酸數(shù)、分子量大小、不穩(wěn)定系數(shù)以及等電點(diǎn)等基本相關(guān)信息，通過(guò)Protscale（https://web.expasy.org/protscale/）在線程序進(jìn)行親疏水性分析，通過(guò)ScanProsi在線軟件預(yù)測(cè)其所包含的保守結(jié)構(gòu)域，通過(guò)Netphos3.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）在線軟件對(duì)SmCOP1蛋白序列進(jìn)行激酶磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)，通過(guò)NetOGlyc4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）在線軟件進(jìn)行糖基化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)，通過(guò)SingalP5.0 在線程序?qū)ζ渌男盘?hào)肽預(yù)測(cè)，通過(guò)TMHMM 在線軟件預(yù)測(cè)其所含的跨膜結(jié)構(gòu)域，通過(guò)Psort Prediction 在線軟件預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位，通過(guò)MEGA7.0 采用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（neighbor-joining, NJ）。通 過(guò) 在 線 軟 件SOPMA 和SWISS-MODEL 預(yù)測(cè)SmCOP1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三維模型。

1.6 E3 連接酶SmCOP1 調(diào)控丹參酮和酚酸類物質(zhì)機(jī)制初探

從現(xiàn)有已知文獻(xiàn)報(bào)道中篩選丹參酮和丹酚酸類物質(zhì)合成通路中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，如bHLH 家族中SmMYC2a[25]、MYB 家 族 中 的SmMYB9b[26]、SmPAP1[27]，ERF 家族中的SmERF1L1[28]和SmERF6[29]、WRKY 家族中的SmWRKY1[30]、AREB/ABFs 家族中的SmAREB1[31]以及促進(jìn)丹酚酸上調(diào)的SmTTG1[32]轉(zhuǎn)錄因子等，研究其與本研究所克隆的SmCOP1 之間的聯(lián)系，以求進(jìn)一步探索泛素化修飾調(diào)控藥用活性物質(zhì)機(jī)制。

將pDEST-GBKT7-COP1a 單轉(zhuǎn)AH109 酵母感受態(tài)，涂布于SD-Trp 獲得單轉(zhuǎn)化菌株。挑菌落用SDTrp 液體培養(yǎng)基2ml 在10mlEP 管中28℃180 rpm 培養(yǎng)16-18 h，吸取100 μL 將其涂布于SD-Trp/-His/-Ade驗(yàn)證其是否存在自激活；再與pDEST-GADT7 雜交后在SD/-Trp/-His/-Leu/-Ade 四缺板上進(jìn)一步驗(yàn)證其與DNA 激活domain 是否存在直接互作。將pDESTGBKT7-COP1a+pDEST-GADT7 為陰性對(duì)照和以pGBKT7-53+pGADT7-T 為陽(yáng)性對(duì)照以及pDESTGBKT7-COP1a 分別與實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的pDESTGADT7-PAP1、 pDEST-GADT7-WRKY1、 pDESTGADT7-MYC2a、 pDEST-GADT7-TTG1、 pDESTGADT7-ERF1L1、pDEST-GADT7-MYB9b、pDESTGADT7-AREB1、pDEST-GADT7-ERF6 等prey 表達(dá)載體分別共轉(zhuǎn)AH109 酵母感受態(tài)中，均勻涂在SD/-Trp/-Leu 二缺板上，生長(zhǎng)3-4 天后，有菌落生成則證實(shí)已獲得雜交菌株，然后分別挑選單克隆，用SD--Trp/-Leu 液體培養(yǎng)基2 mL 在10 mL EP 管中28℃、180 rpm培養(yǎng)16-18 h，統(tǒng)一OD 值為0.5-0.6，分別吸取8 μL 菌液滴在SD/-Trp/-His/-Leu/-Ade 四缺板上，培養(yǎng)3-4天，觀察拍照，做三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SmCOP1基因克隆與載體構(gòu)建

克隆到的丹參SmCOP1a和SmCOP1b基因測(cè)序結(jié)果如圖1所示，克隆序列見(jiàn)附表1，得到了2400 bp左右位置的兩條條帶，與預(yù)測(cè)的基因序列比對(duì)結(jié)果于附圖1 和附圖2。結(jié)果表明，SmCOP1a與預(yù)測(cè)結(jié)果無(wú)差別，而SmCOP1b克隆得到的基因序列與預(yù)測(cè)序列相比出現(xiàn)1 個(gè)堿基的突變。最后得到SmCOP1a的基因長(zhǎng)度為2470 bp，SmCOP1b為2412bp，隨后通過(guò)Takara pMD?18-T Vector Cloning Kit 試劑盒將SmCOP1a和SmCOP1b基因片段連接于pMD18-T 載體上保存。最后將本實(shí)驗(yàn)所需目的片段SmCOP1a基因通過(guò)Gateway方法與酵母表達(dá)載體pDEST-GBKT7 連接，獲得pDEST-GBKT7-COP1a重組載體進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 SmCOP1基因PCR擴(kuò)增電泳圖

附圖1 克隆SmCOP1a序列與預(yù)測(cè)序列比對(duì)結(jié)果

附圖2 克隆SmCOP1b序列與預(yù)測(cè)序列比對(duì)結(jié)果

圖2 SmCOP1蛋白氨基酸親水性/疏水性預(yù)測(cè)

附表1 SmCOP1克隆序列

附表1 SmCOP1克隆序列

2.2 SmCOP1基因編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

本研究于丹參全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到丹參SmCOP1基因，其家族有兩個(gè)基因，分別為SmCOP1a和SmCOP1b（SmCOP1基因CDS 序列和所編碼蛋白質(zhì)序列于附表2 和附表3），之后采用ORF finder 在線軟件分析找到序列的閱讀框，使用ProtParam 在線軟件分析其蛋白的理化性質(zhì)如分子量、親疏水性等，并且使用Protscale分析得到的親/疏水信號(hào)圖如圖2。

附表2 SmCOP1基因組預(yù)測(cè)CDS序列

附表2 SmCOP1基因組預(yù)測(cè)CDS序列

附表3 SmCOP1預(yù)測(cè)基因編碼蛋白序列

SmCOP1a的ORF 長(zhǎng)度為2007bp,編碼668 個(gè)氨基酸，其分子量74891.47，分子式為C3261H5163N931O1032S33，而SmCOP1b的ORF 長(zhǎng)度為2028 bp,編碼675 個(gè)氨基酸，其分子量為76075.04，分子式為C3331H5283N937O1041S30。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，SmCOP1 的2 個(gè)蛋白均為不穩(wěn)定蛋白。其中SmCOP1b 蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為55.87，表明SmCOP1b 蛋白與不穩(wěn)定系數(shù)為59.46 的SmCOP1a 蛋白相比來(lái)說(shuō)穩(wěn)定性更強(qiáng)。親疏水性方面，SmCOP1a 蛋白平均親水性（Grand average of hydropathicity,GRAVY）達(dá)到-0.437，而SmCOP1b 蛋白的平均親水性（Grand average of hydropathicity, GRAVY）數(shù)值達(dá)到-0.443，初步推測(cè)兩者都是親水性蛋白。脂溶性方面，SmCOP1b脂溶指數(shù)最高，為80.16，而SmCOP1a的脂溶指數(shù)為76.06。這一預(yù)測(cè)結(jié)果暗示SmCOP1b 的蛋白熱穩(wěn)定性可能比SmCOP1a 蛋白高。SmCOP1a 理論等電點(diǎn)6.42＜7,，而SmCOP1b 理論等電點(diǎn)為6.67＜7,兩個(gè)都是弱酸性蛋白。從氨基酸組成特點(diǎn)來(lái)看，SmCOP 蛋白都包含常見(jiàn)氨基酸，SmCOP1a 中含量最高的為Ser（12.1%），其次為L(zhǎng)eu（8.7%）和Ala（7.2%），含量最低的為Trp（1.2%），其負(fù)電荷殘基數(shù)（Asp+Glu）為88，正電荷殘基數(shù)（Arg+Lys）為82。SmCOP1b 蛋白中含量最高的為Ser（11.1%），其次為L(zhǎng)eu（9.0%）和Val（7.1%），含量最低的為Trp（1.5%），其負(fù)電荷殘基數(shù)（Asp+Glu）為85，正電荷殘基數(shù)（Arg+Lys）為82。

根據(jù)Protscale 分析得到的親/疏水信號(hào)圖可知，SmCOP1a 蛋白中間氨基酸部分呈現(xiàn)出概率較高的親水性，如A206 殘基此處表現(xiàn)出親水性達(dá)到頂峰（-2.856），而疏水性于A48/A49 此處殘基表現(xiàn)最強(qiáng)（2.122）。而SmCOP1b 蛋白N 端含有親水頭部，中間氨基酸部分呈現(xiàn)出親水性較多，最強(qiáng)親水性位于A151殘基（-3.078），而A167 殘基（2.889）此處疏水性是最強(qiáng)的。從圖中可以看出，兩個(gè)SmCOP1 蛋白親/疏水峰值信號(hào)大概率都分布于-0.5 以下，從另一方面又可證明SmCOP1兩個(gè)蛋白皆是親水性蛋白。

2.3 SmCOP1/SPA蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析

采用ScanProsi 在線分析工具預(yù)測(cè)其所包含的保守結(jié)構(gòu)域，如圖3 結(jié)果表明SmCOP1 蛋白均具有一個(gè)WD40結(jié)構(gòu)域，只不過(guò)兩者之間長(zhǎng)度不一樣，這可能是兩者在進(jìn)化上有差異的原因之一。SmCOP1a 與SmCOP1b 蛋白均具有典型的COP1 類蛋白結(jié)構(gòu)特征，N-端存在E3 泛素連接酶的保守結(jié)構(gòu)域即環(huán)形鋅指結(jié)構(gòu)域（RING-finger），而C-端存在COP1 蛋白與其底物結(jié)合的關(guān)鍵位置[33]即WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域。

圖3 SmCOP1蛋白保守結(jié)構(gòu)域分布

2.4 SmCOP1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

采用生物分析軟件MEGA7.0構(gòu)建丹參SmCOP1a/b蛋白與玉米ZmCOP1（Zea mays:AQK56296.1）、擬南芥AtCOP1（NP_180854.1）、樹 棉GaCOP1L（Gossypium arboreum: KHG27191.1）、水 稻OsCOP1（Oryza sativa Japonica Group: XP_015627602.1）、番 茄SlCOP1L（Solanum lycopersicum: XP_004250243.1）、蘋 果MdCOP1-1、 MdCOP1-2（Malus domestica:BAM08276.1、XP_028943470.1） 、辣 椒 CaCOP1（Capsicum annuum: KAF3621537.1）、油 菜BnCOP1（Brassica napus: ADL59932.1）等蛋白的NJ 進(jìn)化樹（圖4）。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹過(guò)程中使用RBH 法結(jié)果表明SmCOP1a和SmCOP1b是旁系同源基因的關(guān)系，而SmCOP1b是AtCOP1的直系同源基因。

圖4 SmCOP1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.5 SmCOP1基因所編碼蛋白質(zhì)的修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)

采用NetPhos3.1 進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析，預(yù)測(cè)結(jié)果表明如圖5，在系統(tǒng)預(yù)設(shè)的閾值內(nèi)SmCOP1a 蛋白預(yù)測(cè)到9 個(gè)酪氨酸（tyrosine）磷酸化位點(diǎn)，17 個(gè)蘇氨酸（threonine）磷酸化位點(diǎn)以及56 個(gè)絲氨酸（serine）磷酸化位點(diǎn)。而SmCOP1b 蛋白預(yù)測(cè)有10 個(gè)酪氨酸（tyrosine）磷酸化位點(diǎn)，22 個(gè)蘇氨酸（threonine）磷酸化位點(diǎn)以及51個(gè)絲氨酸（serine）磷酸化位點(diǎn)。

圖5 SmCOP1蛋白的磷酸化位點(diǎn)分析

通過(guò)NetOGlyc4.0 在線軟件對(duì)蛋白質(zhì)的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果表明SmCOP1a 蛋白具有14 個(gè)可能的糖基化修飾位點(diǎn)而SmCOP1b 蛋白具有19 個(gè)可能的糖基化修飾位點(diǎn)。

2.6 SmCOP1 基因編碼蛋白質(zhì)的信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位及跨膜區(qū)預(yù)測(cè)分析

利用SignalP 5.0 對(duì)于SmCOP1 蛋白的信號(hào)肽序列進(jìn)行分析，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽和剪切位點(diǎn)，推想SmCOP1 蛋白屬于非分泌型蛋白，即SmCOP1 蛋白可能不存在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，直接在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中發(fā)揮功能。

利用TMHMM 2.0 預(yù)測(cè)了SmCOP1 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)域和膜內(nèi)的氨基酸序列，推測(cè)SmCOP1蛋白位于膜外，屬于非膜蛋白。

根據(jù)Psort Prediction 預(yù)測(cè)結(jié)果（表2），SmCOP1a蛋白定位于葉綠體基質(zhì)（Chloroplast stroma），葉綠體類囊體膜（Chloroplast thylakoid membrane），葉綠體類囊體腔（Chloroplast thylakoid spac）和細(xì)胞核（nucleus）中。SmCOP1b 蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（endoplasmic reticulum(membrane)），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔（endoplasmic reticulum lumen），過(guò)氧化物酶體（peroxisome）和細(xì)胞外中。結(jié)合信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)結(jié)果，推測(cè)SmCOP1a蛋白在游離核糖體上合成蛋白多肽，隨后一部分借助葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽定位到葉綠體，并進(jìn)一步穿過(guò)葉綠體膜進(jìn)入基質(zhì)中，另一部分進(jìn)入細(xì)胞核，推測(cè)可能大部分在葉綠體基質(zhì)和細(xì)胞核中發(fā)揮功能。而SmCOP1b翻譯合成蛋白后一部分進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，大部分位于膜上的非膜蛋白，推測(cè)可能是被其他膜定位蛋白招募過(guò)去的，另有少量SmCOP1蛋白定位于過(guò)氧化物酶體中。

表2 SmCOP1a蛋白的亞細(xì)胞定位分析

2.7 SmCOP1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用在線工具SOPMA 預(yù)測(cè)SmCOP1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見(jiàn)圖6-圖7。SmCOP1a 蛋白結(jié)果顯示含有43.26%的無(wú)規(guī)則卷曲，31.29%的α 螺旋，延伸鏈占20.36%，β-轉(zhuǎn)角占5.09%，而SmCOP1b 該蛋白質(zhì)含有44.89%的無(wú)規(guī)則卷曲，29.33%的α 螺旋，延伸鏈占21.04%，β-轉(zhuǎn)角占4.74%。

圖6 COP1a蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖7 COP1b蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.8 SmCOP1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)SWISS-MODEL進(jìn)行SmCOP1 蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，所構(gòu)建的模型如圖8。結(jié)果顯示，SmCOP1a蛋白與SmCOP1b 蛋白建模以5igo.1.A 為模板，與目標(biāo)蛋白序列的一致性分別為84.38%和83.95%，目標(biāo)模型質(zhì)量分別為-1.41 和-2.30，說(shuō)明SmCOP1a 蛋白和SmCOP1b 蛋白序列與相應(yīng)模板序列的一致度均超過(guò)80%。

圖8 SmCOP1蛋白的三維結(jié)構(gòu)建模

2.9 Y2H 分析SmCOP1 調(diào)控丹參酮和酚酸物質(zhì)機(jī)制初探

pDEST-GBKT7-COP1a 單轉(zhuǎn)化菌株在SD-Trp/-His/-Ade 三缺板上無(wú)生長(zhǎng)說(shuō)明其無(wú)自激活現(xiàn)象，并且與AD-空載體雜菌雜交菌株在SD/-Trp/-His/-Leu/-Ade 四缺板上無(wú)生長(zhǎng)說(shuō)明其不存在與DNA 激活域的直接互作。如圖9，共轉(zhuǎn)質(zhì)粒于感受態(tài)細(xì)胞AH109，2-3 天后觀察發(fā)現(xiàn)在酵母缺陷性培養(yǎng)基SD/-Leu/-Trp二缺板上可以正常生長(zhǎng)菌斑，顯示質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化。在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 平板上，陰性對(duì)照（pDEST-GBKT7-COP1a+pDEST-GADT7）和同時(shí)轉(zhuǎn)化的 pDEST-GBKT7-COP1a 和 pDEST-GADT7-WRKY1、pDEST-GADT7-MYC2a、pDEST-GADT7-TTG1、 pDEST-GADT7-ERF1L1、 pDEST-GADT7-MYB9b、 pDEST-GADT7-AREB1、 pDEST-GADT7-ERF6 均無(wú)法正常生長(zhǎng)，而pDEST-GBKT7-COP1a 與pDEST-GADT7-PAP1 的雜交菌株酵母卻可以長(zhǎng)出清晰的白色菌斑，說(shuō)明COP1a 可能通過(guò)泛素化修飾靶向MYB 轉(zhuǎn)錄因子PAP1來(lái)調(diào)控酚酸類物質(zhì)。由系統(tǒng)進(jìn)化樹分析SmCOP1a是SmCOP1b的旁系同源基因，則很大可能COP1b也參與MYB轉(zhuǎn)錄因子PAP1泛素化。

圖9 Y2H分析SmCOP1a與轉(zhuǎn)錄因子互作

3 總結(jié)

泛素化是蛋白質(zhì)組中中常見(jiàn)的翻譯后修飾方式，植物能夠通過(guò)泛素-26S 蛋白酶體途徑降解細(xì)胞內(nèi)的周期較短以及結(jié)構(gòu)異常的蛋白，從而調(diào)控自身生長(zhǎng)發(fā)育以及次生代謝過(guò)程來(lái)適應(yīng)環(huán)境的變化[34-35]。COP1作為RING 型E3 型泛素連接酶能夠特異性泛素化修飾多數(shù)底物，并通過(guò)26S 蛋白酶體系統(tǒng)促進(jìn)底物水解[36]，而目前對(duì)于COP1的研究?jī)H集中于擬南芥等模式植物。

COP1 在植物和動(dòng)物中高度保守，其直系同源物在細(xì)胞特性、生化活性和預(yù)測(cè)的分子結(jié)構(gòu)方面具有高度相似性[37]。本研究預(yù)測(cè)并克隆丹參E3 泛素連接酶SmCOP1基因，對(duì)其編碼的蛋白理化性質(zhì)等進(jìn)行了一定的生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示SmCOP1蛋白理化性質(zhì)不同，使得它們的穩(wěn)定性存在差異，進(jìn)而影響其自泛素化過(guò)程以及靶蛋白的積累。SmCOP1 具有COP1家族代表性結(jié)構(gòu)特征，N-端具有環(huán)形鋅指保守結(jié)構(gòu)域即RING-finger，而C-端的WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域則是與靶蛋白結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析SmCOP1a是SmCOP1b的旁系同源基因，SmCOP1a和SmCOP1b基因編碼蛋白質(zhì)的信號(hào)肽和跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示皆為非分泌性蛋白和非膜蛋白。且在蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析中，都以同一模板蛋白建模。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明COP1a 主要聚集在細(xì)胞核內(nèi)與核內(nèi)蛋白結(jié)合促進(jìn)其降解，而COP1b 具有細(xì)胞質(zhì)定位信號(hào)通過(guò)抑制自身的表達(dá)提高靶蛋白的積累。本文研究其與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的作用模式，故酵母雙雜實(shí)驗(yàn)以COP1a 為代表做下游互作基因初步的篩選。

酵母互作結(jié)果表明SmCOP1a 與SmMYC2a、SmMYB9b、 SmERF1L1、 SmERF6、 SmWRKY1、SmAREB1 以及SmTTG1 轉(zhuǎn)錄因子等，體外不互作，卻與R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子SmPAP1 互作。有研究表明，SmPAP1 激活了兩個(gè)關(guān)鍵迷迭香酸生物合成途徑基因即SmPAL1（苯丙氨酸解氨酶）和SmC4H（肉桂酸4-羥化酶）的啟動(dòng)子，并且過(guò)表達(dá)SmPAP1植物和過(guò)表達(dá)AtPAP1擬南芥的根能夠大量積累迷迭香酸、丹酚酸B、總酚以及總黃酮等活性物質(zhì)[38]。除此之外，SmPAP1通過(guò)與茉莉酸途徑中主要調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子MYC2相互作用激活編碼關(guān)鍵酶的基因方式參與酚酸生物合成途徑的調(diào)節(jié)[27]。說(shuō)明SmCOP1 可能靶向泛素化修飾SmPAP1 后再與其它轉(zhuǎn)錄因子互作參與茉莉酸途徑，從而調(diào)控酚酸生物合成。從另一個(gè)方面看，雖然Y2H實(shí)驗(yàn)顯示其與其他關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子不互作，但這并不代表SmCOP1a對(duì)其沒(méi)有影響，可能也需要一個(gè)中間體去作為它們之間的橋梁。然而Y2H 實(shí)驗(yàn)結(jié)果只是說(shuō)明其具有互作的可能性，仍還需要LCI和COIP 等方法進(jìn)一步證實(shí)。

4 討論

在植物中，E3泛素連接酶影響多種發(fā)育和環(huán)境反應(yīng)以及激素信號(hào)通路，在脫落酸（ABA）、生長(zhǎng)素、油菜素內(nèi)酯（BR）、細(xì)胞激肽（CK）、乙烯、赤霉酸（GA）、茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）和金合子內(nèi)酯（SL）等植物激素信號(hào)通路中發(fā)揮核心調(diào)控作用[39]。植物激素會(huì)影響COP1 選擇性泛素化降解多種轉(zhuǎn)錄因子來(lái)響應(yīng)不同的信號(hào)，進(jìn)而影響植物的多種生理過(guò)程，例如ABA 長(zhǎng)期的處理會(huì)使得COP1介導(dǎo)GLK1泛素化降解，降低與光合作用相關(guān)的基因表達(dá)，影響葉綠體的形態(tài)[40]；JA 可通過(guò)減少細(xì)胞核內(nèi)COP1 蛋白的積累以及減少與SPA蛋白的相互作用來(lái)抑制COP1 活性，從而刺激子葉展開[41]。而丹參酮和丹酚酸等藥用活性物質(zhì)受到激素信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，接下來(lái)可將目光聚焦在COP1 泛素化降解關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控活性物質(zhì)的合成。COP1 蛋白在光形態(tài)建成中起到重要的抑制作用[42]，在黑暗條件下COP1通常在細(xì)胞核中富集[43]，可針對(duì)多種光形態(tài)發(fā)生促進(jìn)因子進(jìn)行泛素化降解[44]，而光照會(huì)使得相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子積累，促進(jìn)光形態(tài)過(guò)程。COP1的保守N端部分可與光信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中必不可少的轉(zhuǎn)錄因子HFR1結(jié)合，介導(dǎo)其泛素化降解，而光可消除該降解作用，促進(jìn)光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[45]。此外，COP1 對(duì)不同物種的HFR1 具有不同的結(jié)合親和力，例如AtHFR1與COP1的結(jié)合比其他植物COP1 底物弱約100 倍[46]，該結(jié)合能力的差異會(huì)影響HFR1 的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響植物的光形態(tài)發(fā)生乃至于植物其他生命活動(dòng)過(guò)程。由此可以推測(cè)COP1 在不同植物中對(duì)次生代謝物的調(diào)控作用也有可能存在差異。

目前有研究發(fā)現(xiàn)COP1 體內(nèi)外都可以和4 個(gè)SPA蛋白在空間上形成復(fù)合體，通過(guò)物理互作的方式行使功能[47-48]。在體外COP1 活性較高，可自主發(fā)揮功能，而在體內(nèi)需要以復(fù)合體形式參與靶蛋白的修飾[49]。盡管對(duì)SPA蛋白的初步研究主要集中在其增強(qiáng)COP1 E3連接酶功能中的輔助作用，但發(fā)現(xiàn)SPA1的N端結(jié)構(gòu)域具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，可磷酸化靶蛋白促進(jìn)COP1和SPA 蛋白中的WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域與底物結(jié)合。因此同源激酶E3 連接酶復(fù)合體可選擇性地與其底物相互作用，并以光誘導(dǎo)的方式快速降解[50]。未來(lái)需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)研究其他COP1-SPA 底物是否也被SPA 激酶磷酸化，以及同源激酶E3泛素連接酶模型是否也適用于丹參等植物和動(dòng)物中的其他E3 連接酶復(fù)合物。據(jù)報(bào)道COP1-SPA可接著與其他復(fù)合體發(fā)生互作形成復(fù)合體形式如CUL4-DDB1COP1-SPA1，之后再發(fā)揮作用[47]。如發(fā)現(xiàn)CUL4COP1-SPA復(fù)合體作為一個(gè)激酶E3泛素連接酶復(fù)合體，用于快速光誘導(dǎo)降解PIF1 和PIF5[51]。這一現(xiàn)象說(shuō)明了SmCOP1 可能直接與SPA 互作，也可能先與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子互作，再和SPA 作用形成復(fù)合體，進(jìn)而泛素化靶蛋白。然而有報(bào)道曾指出在黑暗中PCH1 和PCHL 也與PIF1 相互作用，可抑制PIF1 的DNA 結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活活性或通過(guò)COP1/SPA復(fù)合體誘導(dǎo)PIF1的降解來(lái)調(diào)節(jié)PIF1，表明相關(guān)調(diào)節(jié)因子的泛素化降解有多種形式[52-53]。并且泛素化調(diào)控影響植物生命活動(dòng)機(jī)制并不是單一的，它可能降解激素信號(hào)通路相互拮抗的兩個(gè)調(diào)節(jié)因子，使其中一個(gè)生物角色占重要位置從而調(diào)節(jié)植物生命活動(dòng)。在植物的整個(gè)生命周期中，光環(huán)境控制著植物發(fā)育的許多方面。CO 是控制擬南芥光周期開花的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，盡管CO 和COL12 都是COP1/SPA 泛素連接酶的降解靶標(biāo)，但它們對(duì)控制降溫時(shí)間的作用是拮抗的。COP1/SPA 的主要功能是在黑暗中調(diào)節(jié)短日生植物中CO 的降解。相反，光對(duì)COL12 的穩(wěn)定作用可能是通過(guò)抑制長(zhǎng)日照植物白天CO 蛋白活性適應(yīng)環(huán)境[54]。COP1/SPA 復(fù)合體對(duì)植物生命活動(dòng)調(diào)節(jié)方式也可能存在于如丹參植物和其他動(dòng)物中。將來(lái)可以先確定COP1s和SPAs是否存在互作，之后以互作形成的復(fù)合體形式深入探索其對(duì)丹參藥用活性成分關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的泛素化修飾機(jī)制，還可以通過(guò)多種方式篩查確認(rèn)是否有其他的E3連接酶在泛素化過(guò)程發(fā)揮重要作用。如利用Cell free 瞬時(shí)體系進(jìn)一步驗(yàn)證篩選介導(dǎo)關(guān)鍵核心轉(zhuǎn)錄因子降解的E3泛素連接酶。

總之，本實(shí)驗(yàn)初步篩選到與丹參E3泛素連接酶互作的SmPAP1 蛋白，預(yù)測(cè)SmCOP1 通過(guò)泛素化修飾SmPAP1 促進(jìn)酚酸等生物活性化合物的積累，并也可能影響SmPAP1 與茉莉酸信號(hào)通路中主要調(diào)控因子MYC2 的結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控植物次生代謝物的合成。本研究將有助于闡明上游E3 泛素連接酶對(duì)于調(diào)控丹參酮和酚酸合成通路中關(guān)鍵核心轉(zhuǎn)錄因子的泛素化修飾對(duì)丹參次生代謝調(diào)控的共同作用機(jī)制，拓寬了E3泛素連接酶在植物生命體中扮演的角色，也為提高丹參藥用成分含量的研究提供了新的研究方向。