秦振芬，孟祥霄，溫 東，朱雪雯，王 艷，Botir Khaitov，Atia tul Wahab，孫 偉＊＊

（1. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所/中藥鑒定與安全性評估北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100700；2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所 北京 100193；3. 卡拉奇大學(xué)國際化學(xué)與生命科學(xué)研究院化學(xué)研究所卡拉奇 75270；4. 國際生物鹽農(nóng)業(yè)中心 塔什干 100084；5. 卡拉奇大學(xué)國際化學(xué)與生命科學(xué)研究院分子醫(yī)學(xué)與藥物研究所 卡拉奇 75270）

中藥材甘草是指甘草屬（Glycyrrhiza）多年生草本植物烏拉爾甘草（G. uralensisFisch.）、光果甘草（G.glabraL.）和脹果甘草（G. inflataBatalin.）的干燥根及根莖，性平味甘，歸脾、胃、心、肺經(jīng)，為臨床常用藥，具有補(bǔ)中益氣、潤肺止咳、清熱解毒、緩急止痛、調(diào)和諸藥之功。因其能調(diào)和百藥、解百毒，故有“國老”之稱[1]。我國是對甘草認(rèn)識、研究最早的國家，甘草最早出現(xiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，并被列為上品[2]。烏拉爾甘草主要活性成分包括甘草皂苷類、甘草黃酮類以及甘草多糖，常用于治療多方面疾病如心腦血管疾病、炎癥等[3]。其中甘草酸的含量是《中國藥典》中衡量甘草藥材品質(zhì)優(yōu)劣的主要指標(biāo)。甘草酸具有抗癌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用，還具有促腎上腺皮質(zhì)激素樣的作用，同時(shí)在臨床上可作為消炎藥使用[4]。因此深入研究甘草酸的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，對于培育高質(zhì)量植株，促進(jìn)甘草酸生物合成及開發(fā)甘草酸類藥物等具有重要意義。

三萜皂苷的生物合成首先通過氧化角鯊烯環(huán)化酶（OSCs）將共同前體2,3-氧化角鯊烯環(huán)化成各種各樣的三萜骨架模式。這些三萜骨架在細(xì)胞色素P450單加氧酶（P450）的催化下進(jìn)行位點(diǎn)特異性氧化，形成不同的三萜苷元或非糖基化形式。甘草酸苷是齊墩烷型三萜皂苷，來源于β-香樹脂醇，近年來，隨著對甘草酸代謝途徑研究的不斷深入，其生物合成酶包括P450酶、UGT 合成酶和細(xì)胞合成酶介導(dǎo)的葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶大多已被鑒定[5]，同時(shí)，研究人員已在酵母中成功合成了甘草酸的前體物質(zhì)甘草次酸[6]（圖1）。相較烏拉爾甘草藥效成分的合成途徑解析，轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究相對較少，如bHLH 類轉(zhuǎn)錄因子GubHLH3 可以調(diào)控烏拉爾甘草中大豆皂苷的合成[7]，因此需要我們更深入研究烏拉爾甘草藥效成分的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。

圖1 甘草酸的代謝途徑

TIFY 家族基因是近年發(fā)現(xiàn)的能增強(qiáng)植物抗逆性的新基因。TIFY 蛋白是植物中一類特異性轉(zhuǎn)錄因子，最初在擬南芥中鑒定出來，屬于植物特異的GATA 轉(zhuǎn)錄因子家族，TIFY 家族的特征是一個高度保守的基序（TIF[F/Y]XG），所以被命名為TIFY 基因家族[8]。通過系統(tǒng)發(fā)育和結(jié)構(gòu)分析，該家族的基因可分為:TIFY、JAZ、ZML 和PPD[9]。其中，最典型的成員是JAZ 基因，是植物特異性基因家族的成員，在JA通路中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[10]。茉莉酸類化合物廣泛存在于植物體內(nèi)，是一種植物內(nèi)源激素，在植物各個生長階段以及抵抗逆境過程中均起到重要作用[11]。Nishii 等從擬南芥中鑒定出首個TIFY 基因，隨后TIFY 基因家族陸續(xù)在水稻、大麻、人參、鐵皮石斛、杜仲等中被鑒定出來[12-16]。近期研究表明，TIFY 基因家族參與眾多生物學(xué)過程，例如擬南芥中過表達(dá)AtTIFY1（ZIM）基因?qū)е氯~柄和下胚軸加長[17]、AtTIFY4a（PPD1）和AtTIFY4b（PPD2）基因有助于擬南芥葉片同步生長[18]；Wang Y[19]在木本模式植物毛果楊中發(fā)現(xiàn)，TIFY 基因可積極響應(yīng)干旱、鹽分、極端溫度等非生物脅迫；Chini A[20]在番茄中發(fā)現(xiàn)，TIFY 基因?qū)}脅迫，滲透脅迫和ABA 處理都有反應(yīng)；在藥用活性成分長春花堿的代謝調(diào)控研究中顯示，缺少茉莉酸甲酯刺激下JAZ 蛋白可以有效地抑制CrMYC2和BIS1表達(dá)從而控制長春花堿的合成[21]；在藥用植物丹參中JAZ3 蛋白可以和SmWD40-170 轉(zhuǎn)錄因子蛋白形成復(fù)合體，從而阻礙其正向調(diào)控丹參酮合成的作用[22]。

由此可見，TIFY 蛋白在植物生長發(fā)育、代謝物質(zhì)調(diào)控上具有重要作用，因此本研究在已有的烏拉爾甘草全基因組的基礎(chǔ)上，采用生物信息學(xué)方法對烏拉爾甘草TIFY 基因家族的序列特征、分類、系統(tǒng)發(fā)育和基因的組織差異表達(dá)進(jìn)行可視化分析，為研究TIFY基因家族成員參與甘草酸代謝調(diào)控提供數(shù)據(jù)支持，為甘草的優(yōu)良品種選育等工作提供參考。

1 材料

烏拉爾甘草的全基因組數(shù)據(jù)和相關(guān)注釋在http://ngs-data-archive.psc.riken.jp/Gur-genome/download.pl網(wǎng)站獲取，其品種為308-19 品系烏拉爾甘草[23]。擬南芥TIFY 基因家族蛋白數(shù)據(jù)下載自TAIR 網(wǎng)站（http://www.arabidopsis.org/browse/genefamily/index.jsp）。

2 方法

2.1 烏拉爾甘草GurTIFY基因家族鑒定

烏拉爾甘草全部蛋白序列通過TBtools 軟件進(jìn)行分析提取，與擬南芥TIFY基因家族蛋白序列進(jìn)行blast比對，獲得候選烏拉爾甘草TIFY 基因序列，用TBtools去除重復(fù)，然后包含TIFY 結(jié)構(gòu)域（PF06200）的蛋白通過HMMERsearch 獲得，其他數(shù)據(jù)刪除，確定烏拉爾甘草中的TIFY 基因家族成員。利用ExPASy 網(wǎng)站（http://web.expasy.org/protparam/）對烏拉爾甘草TIFY等電點(diǎn)、蛋白分子量等理化性質(zhì)進(jìn)行分析。亞細(xì)胞定位通過WoLFPSORT 網(wǎng)站（http://www.genscript.com/wolfpsort.html）進(jìn)行分析。

2.2 烏拉爾甘草GurTIFY基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用MEGA7軟件對擬南芥和烏拉爾甘草的TIFY蛋白進(jìn)行多序列比對，使用鄰接法（Neighbor-Joining,NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（bootstrap 重復(fù)次數(shù)為1000），并用iTOL（http://itol.embl.de/）網(wǎng)站對進(jìn)化樹進(jìn)行美化，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹對烏拉爾甘草GurTIFY基因亞家族分類。

2.3 烏拉爾甘草GurTIFY 基因保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析

通 過MEME（https://meme-suite. org/meme/）對GurTIFY的蛋白保守基序進(jìn)行預(yù)測（motif 參數(shù)設(shè)為10），使用CDD 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）對GurTIFY的蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。將蛋白保守基序、保守結(jié)構(gòu)域和其系統(tǒng)進(jìn)化樹使用TBtools軟件整合及可視化作圖。

2.4 烏拉爾甘草GurTIFY基因順式作用元件預(yù)測

通過基因組序列和結(jié)構(gòu)注釋文件分別提取18 個GurTIFY基因上游各2Kb 序列作為啟動子區(qū)域。然后對啟動子區(qū)的順式作用元件的預(yù)測通過PlantCare（https://www.plantcare.co.uk/）進(jìn)行，通過TBtools 軟件進(jìn)行可視化作圖。

2.5 烏拉爾甘草GurTIFY基因差異表達(dá)分析

采用兩年生烏拉爾甘草根和葉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用STAR（version 2.7.3）軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對，使用RSEM（version 1.33）軟件計(jì)算各樣品的表達(dá)量FPKM 值。使用DEseq2（version 1.22.2）軟 件 計(jì) 算GurTIFY在不同組織中差異表達(dá)情況。最終使用烏拉爾甘草GurTIFY在不同組織的FPKM 值，繪制TIFY 基因表達(dá)水平的柱形圖。轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)為已上傳至國家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心（https://ngdc.cncb.ac.cn/），GSA編號：CRA005924。

篩選表達(dá)量較高，且不同組織間具有顯著差異的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析，使用華越洋試劑盒（0416-50）提取樣品RNA，全式金試劑盒（AT311-02）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用啟衡星試劑盒（FS-Q1002）進(jìn) 行qRT-PCR 反應(yīng)，內(nèi)參基因?yàn)棣聇ubulin，使用NCBI 設(shè)計(jì)引物（表1），qRT-PCR 反應(yīng)體系：cDNA 模板1 μL，上下游引物各0.4 μL、SYBR qPCR Ready Mix 熒光染料10 μL，ddH2O 8.2 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，56℃退火20 s，72℃延伸20 s，40 次循環(huán)。每個樣品設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)，采用2-ΔΔCT法分析基因表達(dá)量。

表1 烏拉爾甘草GurTIFY基因qRT-PCR引物序列

3 結(jié)果與分析

3.1 烏拉爾甘草GurTIFY基因家族成員的鑒定

通過AtTIFY的blastn 同源比對，在烏拉爾甘草中共得到37 條候選序列，去除重復(fù)并確認(rèn)結(jié)構(gòu)域（PF06200）后 得 到GurTIFY成 員18 個，命 名 為GurTIFY1-GurTIFY18，核苷酸長度在444-1266 bp 之間，氨基酸長度在147-421 aa 之間，蛋白分子量大小在16741.11-44426.5 Da 之間，等電點(diǎn)介于4.57-9.68之間，與此前已發(fā)表的擬南芥，大麻等的TIFY 基因家族相近（表2）。

表2 烏拉爾甘草TIFY基因家族基本信息

3.2 烏拉爾甘草GurTIFY 基因的蛋白多重序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了解烏拉爾甘草和擬南芥TIFY 基因家族的進(jìn)化關(guān)系，烏拉爾甘草和擬南芥TIFY 基因共37 個，根據(jù)擬南芥TIFY 家族分類方法[24]被分為4 個亞類（圖2）。烏拉爾甘草18 個TIFY 基因中，JAZ 亞家族基因10 個，將JAZ亞家族分為3個亞組，Ⅰ組有GurTIFY8，Ⅱ組由GurTIFY4、GurTIFY17、GurTIFY18組 成，Ⅲ組 由GurTIFY1、 GurTIFY2、 GurTIFY10、 GurTIFY11、GurTIFY13、GurTIFY15組成；ZML亞家族基因5個分別為GurTIFY12、GurTIFY6、GurTIFY16、GurTIFY9、GurTIFY7；TIFY 亞家族基因2 個分別為GurTIFY5和GurTIFY3以及PPD 亞家族基因1 個為GurTIFY14，每個亞家族的結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)與擬南芥一致。

圖2 烏拉爾甘草（紅色字體）和擬南芥（黑色字體）TIFY轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)育樹

3.3 烏拉爾甘草GurTIFY 基因保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析

將烏拉爾甘草TIFY蛋白保守基序、保守結(jié)構(gòu)域和其系統(tǒng)進(jìn)化樹使用TBtools 軟件進(jìn)行結(jié)合并做可視化作圖分析。結(jié)果顯示，烏拉爾甘草的18 個TIFY 基因中含有10 個保守基序和4 個保守結(jié)構(gòu)域，18 個GurTIFY中 均 含 有 TIFY 結(jié) 構(gòu) 域，GurTIFY9、GurTIFY16、GurTIFY7、GurTIFY6、GurTIFY12含有CCT和GATA 結(jié)構(gòu)域，除GurTIFY9、GurTIFY16、GurTIFY7、GurTIFY6、GurTIFY12、GurTIFY3、GurTIFY5外均含有Jas結(jié)構(gòu)域（圖3）。

圖3 烏拉爾甘草TIFY家族功能結(jié)構(gòu)域

為進(jìn)一步分析甘草GurTIFY基因之間的進(jìn)化關(guān)系，利用TBtools 軟件構(gòu)建了烏拉爾甘草GurTIFY的基因結(jié)構(gòu)圖。結(jié)果顯示，烏拉爾甘草的18 個GurTIFY中內(nèi)含子的數(shù)量為2-9 個（圖4），其中GurTIFY9和GurTIFY16所含內(nèi)含子數(shù)量最多為9 個，GurTIFY14含有2 個內(nèi)含子，數(shù)目最少，其余成員中GurTIFY1、GurTIFY2、GurTIFY11、GurTIFY13、GurTIFY15含內(nèi)含子4 個，GurTIFY4、GurTIFY6、GurTIFY12、GurTIFY17、GurTIFY18含內(nèi)含子6 個，GurTIFY3和GurTIFY5含內(nèi)含子5 個，GurTIFY10、GurTIFY7和GurTIFY8內(nèi)含子數(shù)量分別為3、7、8個。

圖4 烏拉爾甘草GurTIFY基因的基因結(jié)構(gòu)

3.4 烏拉爾甘草GurTIFY基因順式作用元件預(yù)測

順式元件對基因表達(dá)具有重要的調(diào)控作用，烏拉爾甘草TIFY 基因家族成員的順式作用元件預(yù)測和可視化分析結(jié)果表明（圖5），GurTIFY中每個成員的啟動子區(qū)都含有眾多順式元件，如光響應(yīng)元件，脫落酸響應(yīng)元件，干旱誘導(dǎo)元件等。光響應(yīng)元件數(shù)量最多為274 個，分布在每個成員中，其次為脫落酸響應(yīng)元件數(shù)量為68個。另外，烏拉爾甘草抗逆性和抗干旱的茉莉酸甲酯和干旱響應(yīng)元件也在大多數(shù)烏拉爾甘草TIFY基因的啟動子上存在。表明烏拉爾甘草TIFY 不同成員能夠廣泛且差異性的參與烏拉爾甘草生長發(fā)育及非生物脅迫等多種生物過程的響應(yīng)。

圖5 烏拉爾甘草GurTIFY基因的啟動子區(qū)順式作用元件

3.5 烏拉爾甘草GurTIFY基因差異表達(dá)分析

為了探究GurTIFY在烏拉爾甘草不同組織中的表達(dá)模式，對兩年生烏拉爾甘草根和葉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明（圖6），GurTIFY15、GurTIFY4、GurTIFY1、 GurTIFY11、 GurTIFY5、 GurTIFY13、GurTIFY8、GurTIFY16、GurTIFY14在烏拉爾甘草葉和根中的表達(dá)水平具有顯著差異性。GurTIFY15、GurTIFY4在各個組織表達(dá)量都相對較高，而GurTIFY16、GurTIFY3和GurTIFY14在各個組織幾乎不表達(dá)。且GurTIFY15、GurTIFY4、GurTIFY1、GurTIFY11、GurTIFY13在葉中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在根中的表達(dá)。在所有成員中GurTIFY15在葉表達(dá)量最高，GurTIFY2 在根表達(dá)量最高。以上在根和葉中表達(dá)量較高的基因大多為JAZ 亞家族的成員，表明烏拉爾甘草的GurTIFY基因家族成員中的JAZ 亞家族可能參與了不同組織器官的調(diào)控。篩選表達(dá)量較高，且組織間具有顯著差異的GurTIFY1、GurTIFY4、GurTIFY11、GurTIFY13四個基因進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證，結(jié)果顯示（圖7），在相同組織中四個基因的qRT-PCR 相對表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果相似，相同基因在不同組織間的qRT-PCR表達(dá)差異與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果相一致。

圖6 烏拉爾甘草不同組織中GurTIFY基因的差異表達(dá)分析

圖7 qRT-PCR驗(yàn)證烏拉爾甘草GurTIFY基因表達(dá)

4 討論

烏拉爾甘草是重要的中藥材，有著豐富的藥用功能，但跟其他中藥材一樣，烏拉爾甘草種植區(qū)域仍有許多制約因素，如鹽害、干旱和堿性土壤等，嚴(yán)重影響烏拉爾甘草的產(chǎn)量和質(zhì)量，此外，由于全球變暖和適宜種植的土地面積減少，迫切需要進(jìn)行甘草抗逆品種選育，并改善甘草育種的重要性狀和品質(zhì)[25]，因此，有必要對甘草的發(fā)育及其對環(huán)境因素的響應(yīng)進(jìn)行深入研究。TIFY 家族基因是近年發(fā)現(xiàn)的能增強(qiáng)植物抗逆性的新基因。TIFY 基因參與調(diào)控多種次生代謝產(chǎn)物的生物合成，但在中藥植物中報(bào)道較少。

本研究在全基因組的水平上共鑒定出18 個烏拉爾甘草TIFY 基因，全部分布于細(xì)胞核中。基于CCT、Jas、GATA、TIFY4 種保守結(jié)構(gòu)域，將烏拉爾甘草的TIFY 基因家族劃分為TIFY、JAZ、PPD、ZML 四個亞家族。其中JAZ 亞家族基因占比最多。近年來，人們對JAZ 蛋白進(jìn)行了深入研究，主要是因?yàn)樗鼈冊谥参锇l(fā)育和針對生物和非生物脅迫的防御反應(yīng)等許多方面起到了作用。茉莉酸作為重要的植物激素，在植物生長、繁殖和抗逆等諸多方面起重要的作用。茉莉酸途徑的抑制因子JAZ（Jasmonate ZIM-domain, JAZ）蛋白（JAZs）是調(diào)節(jié)茉莉酸（JA）激素應(yīng)答的關(guān)鍵因子，在茉莉酸（JA）信號傳導(dǎo)中，JAZ 蛋白通過與轉(zhuǎn)錄因子MYC2 結(jié)合來調(diào)節(jié)JA 下游基因的表達(dá)，其在廣闊的激素調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中起中心樞紐的作用[26-27]。Li[22]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)丹參TIFY家族中屬于JAZ亞家族的SmJAZ3蛋白在JA信號通路中與SmWD40-170相互作用，并在次級代謝產(chǎn)物的積累中發(fā)揮重要作用。因此，推測JAZ 基因在烏拉爾甘草生長發(fā)育的調(diào)控過程發(fā)揮了重要的作用，是增強(qiáng)烏拉爾甘草抗逆性的主要基因之一。

順式作用元件分析表明，在烏拉爾甘草的TIFY基因啟動區(qū)中光響應(yīng)元件和激素誘導(dǎo)類元件數(shù)量較多，表明該基因與烏拉爾甘草的生長發(fā)育密切相關(guān)，環(huán)境和激素可影響其表達(dá)。此外，在烏拉爾甘草TIFY基因啟動子中均預(yù)測到大量不同功能的順式作用元件，表明TIFY 基因可能參與了烏拉爾甘草的生長和發(fā)育的許多過程。根據(jù)差異表達(dá)分析，烏拉爾甘草TIFY基因?qū)趵瓲柛什莞腿~器官的生長發(fā)育發(fā)揮一定的作用，其中GurTIFY15、GurTIFY4、GurTIFY1、GurTIFY11、GurTIFY5、 GurTIFY13、 GurTIFY8、 GurTIFY16、GurTIFY14在烏拉爾甘草葉和根中的表達(dá)水平具有顯著差異性，屬于JAZ 亞家族的GurTIFY15、GurTIFY4、GurTIFY1、GurTIFY2和GurTIFY11中葉的表達(dá)量較高，而有研究表明擬南芥TIFY 的JAZ 亞家族一些成員基因參與葉片的生長調(diào)控[9]。擬南芥PPD 亞家族成員對葉片形態(tài)具有調(diào)節(jié)作用[18]，AtTIFY1（ZIM）可以促進(jìn)葉柄和下胚軸的延伸[17]，與赤霉素和油菜素類固醇無關(guān)[28]。丹參TIFY 基因家族在不同組織差異表達(dá)分析結(jié)果得知TIFY 家族整體在葉中的表達(dá)較高且其大部分屬于JAZ亞家族[22]。因此，推測GurTIFY在葉的生長發(fā)育調(diào)控中起到了重要的作用，起調(diào)控作用的可能就是JAZ亞家族。

TIFY 基因家族是一個植物特有的基因家族，現(xiàn)已在大部分陸生植物中檢測到了TIFY 基因家族[29-30]，目前在一些中藥中也已經(jīng)有所研究報(bào)道，然而該家族在烏拉爾甘草中的表達(dá)和功能分析卻很少。對GurTIFY的研究可以為抗逆性遺傳改良提供理論基礎(chǔ)，擴(kuò)大烏拉爾甘草種植范圍，提高其產(chǎn)量。本研究為進(jìn)一步探究烏拉爾甘草TIFY 基因家族功能和烏拉爾甘草轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究以及利用該基因家族改良烏拉爾甘草抗逆性奠定了基礎(chǔ)。