徐 瑤，任宏偉，孫唯航，張馨方，田雪梅，譚玲玲，袁 濤，高 婷＊＊

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室 青島 266109；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)建筑工程學(xué)院 青島 266109）

藥用植物在遭受外界的生物脅迫與非生物脅迫時，其體內(nèi)的代謝水平會發(fā)生變化，包括初生代謝與次生代謝兩方面[1]。代謝產(chǎn)物在植物細(xì)胞的液泡中進(jìn)行累積，代謝產(chǎn)物的累積會降低植物細(xì)胞內(nèi)的滲透勢，使得外界的水分子更有利于被植物細(xì)胞吸收，為植物在面對非生物脅迫時提供了優(yōu)勢[2-5]。

在分子水平上，逆境脅迫會導(dǎo)致植物部分轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)量發(fā)生變化，進(jìn)而對植物代謝水平進(jìn)行調(diào)控，從而適應(yīng)外界的逆境脅迫。與植物抗逆相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白主要有ZIP、WRKY、AP2／ERF、MYB和NAC 等[6]。其中AP2／ERF 類轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物脅迫中發(fā)揮了重要作用，AP2／ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白全稱為APETALA2 乙烯響應(yīng)原件結(jié)合因子家族蛋白，其結(jié)合靶標(biāo)位點(diǎn)為DRE/CRT 順式作用元件，進(jìn)而對下游基因進(jìn)行調(diào)控，改變下游基因的表達(dá)量，使植物細(xì)胞響應(yīng)生物與非生物脅迫，最終發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能[7-12]。在楊亞苓等人的研究中顯示，花椰菜AP2／ERF 轉(zhuǎn)錄因子ERF056 在鹽脅迫下呈下調(diào)表達(dá),負(fù)向響應(yīng)鹽脅迫[13]。研究發(fā)現(xiàn)，AP2／ERF 轉(zhuǎn)錄因子不僅參與了植物逆境脅迫，同時它也參與了植物的次生代謝產(chǎn)物調(diào)控、合成以及累積過程。Lu等人研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素AaERF1、AaERF2 與AaERF3基因?qū)η噍锼睾铣善鹫{(diào)控作用[14]。張蒙等人研究發(fā)現(xiàn)TcERF12和TcERF15 能夠分別抑制和激活紅豆杉中TASY（紫杉烯合酶）的表達(dá)[15]。Kathleen等人研究發(fā)現(xiàn)煙草中的AP2／ERF 轉(zhuǎn)錄因子ORC1 的過量表達(dá)能夠促進(jìn)煙草中生物堿次生代謝產(chǎn)物的合成[16]。羅紅梅等人研究發(fā)現(xiàn)丹參中的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子SmAP2/ERF152參與調(diào)控丹參酮的合成[17]。

珊瑚菜（Glehnia littoralisFr.Schmidt ex Miq.）屬于傘形科芹亞科珊瑚菜屬的單種屬多年生藥用草本植物，大多數(shù)生長在海邊沙地，屬于瀕危物種[18]。珊瑚菜藥食同源，市場供不應(yīng)求。如何提升珊瑚菜產(chǎn)量與品質(zhì)是珊瑚菜育種工作者的重要任務(wù)。本課題組對珊瑚菜抗逆相關(guān)基因進(jìn)行發(fā)掘，為了獲得珊瑚菜ERFs抗鹽相關(guān)基因，我們對珊瑚菜轉(zhuǎn)錄組中篩選的ERFs相關(guān)基因進(jìn)行初步鹽處理表達(dá)分析，其中c43768_g1基因在鹽處理后表達(dá)量相較對照組明顯上升。將c43768_g1 轉(zhuǎn)錄組序列在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行blast 比對，結(jié)果顯示該轉(zhuǎn)錄組序列對應(yīng)的氨基酸序列與胡蘿卜DcERF11氨基酸序列(XP_017234597.1)最為相似，相似度為71.35%，因此將c43768_g1 轉(zhuǎn)錄組序列命名為GlERF11。本文首次對珊瑚菜AP2／ERF 超家族的GlERF11基因進(jìn)行了克隆并開展生物信息學(xué)分析；同時對GlERF11基因進(jìn)行了鹽處理前后的表達(dá)分析。旨在為該基因的功能鑒定及后續(xù)珊瑚菜遺傳學(xué)、育種學(xué)等研究奠定基礎(chǔ)，如進(jìn)一步增強(qiáng)珊瑚菜抗鹽抗逆能力，有望提高鹽堿地的利用率并改善我國土地環(huán)境。

1 實(shí)驗材料

1.1 植物材料

珊瑚菜幼苗（由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物園苗圃提供）。

1.2 實(shí)驗試劑

本實(shí)驗的主要試劑包括：植物多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；HiScript?III RT Super Mix for qPCR (+gDNA wiper)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；SMARTer?RACE5′/3′Kit 試劑盒（大連寶生生物工程有限公司）；SYBR?Premix Ex Taq ?II 定量試劑盒（大連寶生生物工程有限公司）；TIAN Midi Purification Kit瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（上海生工有限公司）；Ex Taq 酶（寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司）。

1.3 實(shí)驗儀器

本實(shí)驗的主要儀器包括：5424 小型臺式離心機(jī)（德國Eppendorff Centrifuge 公司）；PCR 儀（美國安捷倫公司）；實(shí)時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；SIM-F140AY65 制冰機(jī)（日本三洋公司）；Tanon500 凝膠成像分析儀（上海領(lǐng)成公司）；核酸電泳系統(tǒng)（美國BIO-RAD 公司）；壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安公司）；Nano Drop One 超微量分光光度計（美國Thermo公司）。

1.4 使用軟件與網(wǎng)站

使用軟件：DNAMAN 6.0，WPS 2010，Primer 5.0，Pymol 1.5，MEGA 5，clustalx 2.0，Bioedit7.0。

使用網(wǎng)站：NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，Protscale (https://web. expasy. org/protscale/)，TMHMM Server (http://www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/)，SOMPA (https://npsa-prabi. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat. pl? page=npsa_sopma. html)，SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)，ITOL (https://itol.embl.de/)。

2 實(shí)驗方法

2.1 珊瑚菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

由本實(shí)驗室提供珊瑚菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用關(guān)鍵詞ERF11對珊瑚菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫注釋信息進(jìn)行搜索，獲得c43768_g1 基因核酸序列。使用NCBI 網(wǎng)站ORF finder 功能尋找c43768_g1 轉(zhuǎn)錄組序列的正確開放閱讀框蛋白序列，隨后使用protein blast 功能尋找相似度最高的同源蛋白序列，以確定其蛋白功能以及蛋白序列的完整性。

2.2 GlERF11基因cDNA克隆與測序

使用Primer 5.0 軟件對c43768_g1 轉(zhuǎn)錄組序列開放閱讀框序列設(shè)計引物。提取珊瑚菜幼苗總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，通過PCR 進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳驗證膠回收后連接到18-T 載體上。將構(gòu)建完畢的18-T載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，AMP（氨芐青霉素）抗性的LB 固體培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)。次日挑取飽滿圓形的大腸桿菌進(jìn)行菌液PCR，將陽性菌株送測。

2.3 GlERF11基因3’Race克隆與測序

使用Primer 5.0 軟件，依據(jù)其部分cDNA 序列（5′端完整，3′端不完整）對c43768_g1 轉(zhuǎn)錄組序列開放閱讀框分別設(shè)計長、短3’Race PCR 引物，將擴(kuò)增后測序結(jié)果與原序列進(jìn)行拼接，從而獲得該基因的全長cDNA序列。

2.4 GlERF11生物信息學(xué)分析

使用NCBI 網(wǎng)站的CD Search 功能，尋找該基因全長cDNA 的保守結(jié)構(gòu)域。使用Protscale 網(wǎng)站分析該蛋白的理化性質(zhì)，使用TMHMM Server 網(wǎng)站分析跨膜結(jié)構(gòu)域。使用SOMPA 與SWISS-MODEL 網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)二級或三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

2.5 GlERF11基因鹽脅迫表達(dá)分析與差異表達(dá)分析

從種植苗圃中挑選健康的剛生長出真葉的珊瑚菜幼苗，用蒸餾水洗凈表面泥沙，吸干多余水分備用。在培養(yǎng)皿中鋪上干凈的濾紙，并在濾紙上倒入適量的200 mmol.L-1的NaCl 溶液，將洗凈的珊瑚菜幼苗鋪在培養(yǎng)皿的濾紙上，放入黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、36 h 各取樣一次，樣品全株及時放入液氮中速凍粉碎，隨后提取RNA，隨后反轉(zhuǎn)錄。使用TB Green?Premix Ex Taq?II (Tli RNaseH Plus)熒光定量試劑盒與Appliedbiosystems 實(shí)時熒光定量PCR儀對不同樣品中的GlERF11基因表達(dá)量進(jìn)行熒光定量分析。使用NCBI設(shè)計定量引物，使用2-ΔΔCT數(shù)據(jù)分析法對熒光定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析（表1）。

表1 GlERF11基因克隆及RT-qPCR所用的引物序列

3 結(jié)果與討論

3.1 GlERF11 cDNA克隆與3’RACE 克隆

3.1.1GlERF11cDNA克隆

為了獲得珊瑚菜GlERF11cDNA 序列，通過已有的轉(zhuǎn)錄組GlERF11序列設(shè)計引物，對珊瑚菜GlERF11cDNA 序列進(jìn)行PCR 克隆以及測序，如圖1-圖2 所示，GlERF11電泳條帶位置與轉(zhuǎn)錄組GlERF11開放閱讀框長度一致，對電泳條帶回收測序，測序結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)錄組序列基本一致。從而證明已獲得了珊瑚菜GlERF11的cDNA序列。

圖1 GlERF11cDNA克隆電泳圖

圖2 GlERF11 cDNA克隆測序比對結(jié)果

3.1.2GlERF11基因cDNA3’RACE克隆

對GlERF11 基因進(jìn)行3’Race PCR，電泳結(jié)果如圖3 所示，通過對GlIPT 基因3’UTR 長度進(jìn)行推測，PCR正確片段長度大約在250-500 bp 之間，因此對圖3 中正確的的DNA 條帶進(jìn)行回收，連接18-T 并測序。將測序結(jié)果與原序列進(jìn)行拼接從而獲得GlERF11 基因的全長cDNA 序列。用NCBI 提供的Open Reading Frame Finder（ORF Finder）進(jìn)行開放閱讀框分析得到該序列長1019 bp，ORF（Open Reading Frame）為537 bp，120 bp 5′非轉(zhuǎn)譯區(qū)（5′UTR），250 bp 3′非轉(zhuǎn)譯區(qū)（3′UTR）和28 bp polyA 尾，編碼177個氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為19710.95 Da（圖4）。

圖3 GlERF11 3’RACE PCR電泳圖

圖4 GlERF11cDNA全長序列與氨基酸序列

3.2 GlERF11蛋白生物信息學(xué)分析

3.2.1 GlERF11蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

將GlERF11 蛋白序列于NCBI 在線網(wǎng)站進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測。預(yù)測結(jié)果如圖5 所示，GlERF11 蛋白的第22-79 個氨基酸編碼區(qū)屬于AP2 超家族保守結(jié)構(gòu)域。

圖5 GlERF11蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

3.2.2 GlERF11蛋白理化性質(zhì)分析

對GlERF11 蛋白進(jìn)行了親疏水性預(yù)測以及蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測，如圖6-圖7所示，GlERF11蛋白相對分子質(zhì)量為19710.95 Da，等電點(diǎn)為6.31。不穩(wěn)定系數(shù)為52.48，說明該蛋白不穩(wěn)定?？偲骄H水性為-0.534，為親水性蛋白，GlERF11 蛋白在第43 個氨基酸位點(diǎn)，最低峰值是-2.744，在第158 個氨基酸位點(diǎn)，最高峰值是1.911，預(yù)測該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域。

圖6 GlERF11蛋白質(zhì)親疏水性預(yù)測

圖7 GlERF11蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

3.2.3 GlERF11蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

對珊瑚菜GlERF11 蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。如圖8 所示，GlERF11 二級結(jié)構(gòu)中有21 個氨基酸參與形成了α-螺旋，占11.8%。36 個氨基酸參與了延伸鏈的形成，占20.22%。117 個氨基酸參與了無規(guī)卷曲的形成，占65.73%。GlERF11 主要結(jié)構(gòu)均為延伸鏈和無規(guī)卷曲，α-螺旋是最為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋的比例僅為11.8%，因此推測此蛋白不穩(wěn)定。

圖8 GlERF11蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

3.2.4 GlERF11蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

對已知功能蛋白擬南芥AtERF11 與未知功能蛋白珊瑚菜GlERF11 進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果如圖9 所示，預(yù)測GlERF11蛋白結(jié)構(gòu)包含285個氨基酸，占編碼氨基酸總數(shù)的93.14%，可信度較高。GlERF11 與AtERF11 預(yù)測蛋白空間結(jié)構(gòu)較為相似，普遍包含無規(guī)則卷曲、β-片層、ɑ-螺旋三種空間結(jié)構(gòu)，推測兩者蛋白在功能上可能存在一定的保守性與相似性。

圖9 AtERF11和GlERF11蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

3.2.5 GlERF11蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析與氨基酸比對

對不同物種的ERF11 蛋白進(jìn)行了氨基酸序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，如圖3～6所示，GlERF11與胡蘿卜Daucus carota，刺苞菜薊Cynara cardunculus以及向日葵Helianthus annuus的ERF11 蛋白親緣關(guān)系較近，與密花豆Spatholobus suberectus，玉米Zea mays以及粟Setaria italica等物種的ERF11蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。通過GlERF11 蛋白與其他物種ERF11 蛋白氨基酸比對結(jié)果（圖10）發(fā)現(xiàn)，圖中所有物種的ERF11蛋白存在部分保守性基序，從而說明圖中各個物種的ERF11 蛋白存在一定的同源性，同時對圖中所有物種的ERF11 蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示蛋白結(jié)構(gòu)均與GlERF11 蛋白結(jié)構(gòu)相似，保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，圖中所有蛋白氨基酸序列均包含一個AP2 DNA binding domain 的蛋白保守結(jié)構(gòu)域。該保守結(jié)構(gòu)域至少存在兩個基序，第一個基序位于β-sheet 1 與βsheet 2 預(yù)測區(qū)，序列為RGVRXRPWGRYAAEIRDP（X為任意氨基酸）。第二個基序位于β-sheet 3 預(yù)測區(qū)，序列為RVWLG（圖11）。

圖10 ERF11蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖11 GlERF11蛋白與其他物種氨基酸比對

3.3 鹽處理下珊瑚菜GlERF11基因熒光定量表達(dá)分析

對不同時間段鹽脅迫處理下的珊瑚菜幼苗的GlERF11基因進(jìn)行了熒光定量表達(dá)分析，結(jié)果如圖12所示。珊瑚菜GlERF11基因表達(dá)量在鹽脅迫3 h 時間段顯著上調(diào)，在6 h 時間段顯著下調(diào)，在12 h 顯著上調(diào)，在24 h 顯著下調(diào)，呈現(xiàn)出節(jié)律性變化。說明GlERF11基因響應(yīng)了鹽脅迫，參與了珊瑚菜的鹽脅迫反應(yīng)。

圖12 珊瑚菜鹽脅迫處理GlERF11基因表達(dá)量變化

4 討論

珊瑚菜是一種重要的鹽生藥用植物，其干燥根是藥典收載的重要中藥材北沙參。有研究表明：在珊瑚菜種子萌發(fā)階段和幼苗生長期均具有較好的耐鹽性，在100 mmol·L-1NaCl 處理的珊瑚菜幼苗生長狀態(tài)和生長量正常，當(dāng)溶液中濃度超過200 mmol·L-1時生長開始受到抑制，在300 mmol·L-1處理條件下開始出現(xiàn)植株死亡，存活率為50%左右[19]。對于珊瑚菜抗鹽基因的研究，對揭示藥用植物抗鹽抗逆機(jī)理具有重要價值。

AP2/EREBP 是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，根據(jù)AP2 結(jié)構(gòu)域數(shù)量可以分為兩種，其中只具有一個AP2 結(jié)構(gòu)域的為ERF 亞族，其屬于乙烯響應(yīng)因子，在調(diào)節(jié)植物生物和非生物逆境反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[20-21]。研究表明很多物種的ERF11基因參與抗逆脅迫。Marieke 等人發(fā)現(xiàn)：在甘露醇處理下擬南芥AtERF11基因表達(dá)量受到誘導(dǎo)呈上調(diào)趨勢[22]。在白樺（Betula platyphylla）中，ERFs 基因的表達(dá)存在組織差異性，并且在鹽脅迫下BpERF11基因呈上調(diào)的表達(dá)趨勢，說明其參與白樺對鹽脅迫的響應(yīng)[23]。劉悅等人在楊 樹（Populus simonii × P.nigra）中克隆并獲得了PsERF11基因，并對該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)和表達(dá)分析。實(shí)驗結(jié)果顯示該基因在楊樹組織中存在差異表達(dá)，同時響應(yīng)鹽脅迫與干旱脅迫[24]。在大白菜（Brassica pekinensis(Lour.) Rupr.）和蘋果(Malus × domesticaBorkh.)中，ERF11基因也參與了植物的生物脅迫[25-26]。本研究通過RACE 技術(shù)得到珊瑚菜抗鹽相關(guān)基因GlERF11的全長cDNA 序列，將其與NCBI 上植物的同源蛋白序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)GlERF11 蛋白存在1 個AP2 蛋白保守結(jié)構(gòu)域。利用生物信息軟件進(jìn)行序列分析，從而全面研究基因信息；通過qPCR 分析鹽脅迫下的珊瑚菜幼苗，結(jié)果顯示：在200 mmol·L-1NaCl 的不同時間處理該基因表達(dá)量均有顯著上調(diào)；在12 h 處理下，該基因的表達(dá)量增幅最大，是空白的2 倍多。說明了GlERF11基因響應(yīng)鹽脅迫，從而參與珊瑚菜的抗鹽過程。本研究為ERFs 家族基因促進(jìn)珊瑚菜抗鹽的分子機(jī)制研究提供依據(jù)，后續(xù)功能鑒定及機(jī)理解析實(shí)驗有待進(jìn)一步開展。

乙烯作為一種植物激素不僅調(diào)節(jié)生長發(fā)育、果實(shí)成熟，還能在植物體內(nèi)快速傳遞環(huán)境信號，進(jìn)而使植物對脅迫做出應(yīng)答[27]。一些轉(zhuǎn)錄因子可以通過響應(yīng)乙烯來調(diào)節(jié)植物的鹽脅迫。如大部分具有較高水平ERFs的煙草乙烯不敏感突變體，對環(huán)境脅迫表現(xiàn)出明顯的抗性[28-29]。推測乙烯響應(yīng)因子GlERF11 可能通過結(jié)合結(jié)構(gòu)基因的上游順勢作用元件來調(diào)控下游基因的表達(dá)，即GlERF11 可能是通過調(diào)節(jié)乙烯的生成進(jìn)而協(xié)調(diào)相應(yīng)信號途徑之間的相互作用，參與珊瑚菜的抗逆過程，有待后續(xù)研究。

此外，植物在受到外界環(huán)境的影響壓迫時，體內(nèi)的次生代謝物一般會大量產(chǎn)生，進(jìn)而來抵御惡劣環(huán)境。如有研究表明：一定量的環(huán)境脅迫可以增加甘草中甘草苷、甘草酸等有效成分的積累，進(jìn)而提高其相關(guān)品質(zhì)[30-31]?？剐耘c高品質(zhì)存在一定關(guān)聯(lián)性，珊瑚菜的抗性優(yōu)良品種很可能也是高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種。因此，對于珊瑚菜抗鹽基因的研究，不僅有利于開發(fā)利用耐鹽植物資源、提高國家鹽堿地的利用率，并且對提高藥用植物的產(chǎn)量及優(yōu)化中藥材品質(zhì)都有一定現(xiàn)實(shí)意義。