鄭曉宇，宋文婷，李 磊，曹 慧，姚明江，劉建勛＊＊

（1. 中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所/北京市中藥藥理重點實驗室 北京 100091；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院西苑醫(yī)院 北京 100029）

由于腦部血管阻塞而導(dǎo)致血液阻斷或由于血管破裂導(dǎo)致血液無法流入腦組織，導(dǎo)致了一種急性腦血管疾病，即腦卒中。依據(jù)發(fā)病原因的不同又被分為了缺血性腦卒中和出血性腦卒中。其中，缺血性腦卒中已成為嚴重危害人類健康的疾病，具有較高的死亡率和致殘率。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為，大腦需要持續(xù)不斷獲得氧，繼而生成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），維持功能代謝的正常進行，一旦因各種原因?qū)е履X缺血缺氧，會使細胞和神經(jīng)發(fā)生損傷，產(chǎn)生感覺、運動及意識等功能障礙，甚至可能導(dǎo)致死亡。缺血性腦卒中最終還會導(dǎo)致神經(jīng)凋亡、血腦屏障被破壞、腦水腫和出血性轉(zhuǎn)化等結(jié)果[1-3]。

在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中，為更好的貼近人類缺血性腦卒中的發(fā)病過程及偏癱等癥狀，常采用大腦中動脈閉塞的模型來模擬大腦局灶性缺血的模型，較為常用方法為線栓法，此法因具有缺血和再灌注時間可控制、腦梗死部位可確定、制作方式可操作等原因而被廣泛應(yīng)用[4-5]，并在日益發(fā)展的過程中逐步成熟，目前已成為最為常見的腦缺血模型的制作方法。但在實驗設(shè)計過程中，動物品系的選擇往往不會被作為實驗設(shè)計時首要的考慮因素，并且目前未見腦缺血模型與品系間差異相關(guān)的報道，但不同動物品系間往往存在一定的差異。本研究通過比較C57BL/6 和ICR 小鼠大腦中動脈閉塞后體重變化率、生存率、神經(jīng)行為學(xué)評分、腦指數(shù)、腦含水量、腦梗死面積等方面，展示了在局灶性腦缺血模型中不同品系小鼠之間以上指標中的差別，并制作小鼠腦部血管鑄型實驗，為未來科研工作者們在模型制作中提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性C57BL/6 和ICR 小鼠各15 只，共32 只，SPF級，體質(zhì)量20-24 g，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，許可證號SYXK（京）2015-0011。小鼠飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院SPF 級實驗動物中心，實驗操作完全遵循該機構(gòu)道德倫理學(xué)標準。動物設(shè)施室內(nèi)溫度23℃-25℃，相對濕度55%±10%。維持12h 光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律。

1.2 主要試劑和儀器

戊巴比妥鈉（北京化學(xué)試劑公司；批號：20190402）；1620A1 栓線（北京西濃科技有限公司；批號：20200509）；牙科模型樹脂（Ⅱ型）（安陽市鷹牌齒科材料有限公司；批號：20180917）；牙科模型樹脂（安陽市鷹牌齒科材料有限公司；批號：20180917）；鄰苯二甲酸二丁酯（無錫市亞太聯(lián)合化工有限公司；批號20181201）；氫氧化鉀（天津市福晨化學(xué)試劑廠；批號：20170220）

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

將C57BL/6 和ICR 小鼠分為4 組，分別為C57BL/6正常組、C57BL/6 模型組、ICR 正常組、ICR 模型組。本著減少動物傷害的原則，設(shè)C57BL/6 正常組和ICR 正常組為5 只，C57BL/6 模型組和ICR 模型組分別設(shè)10只。

1.3.2 局灶性腦缺血再灌注損傷模型（栓線法）

C57BL/6 和ICR 模型組小鼠進行大腦中動脈栓塞（MCAO）造模。0.5%戊巴比妥鈉麻醉，頸部備毛、消毒，做正中切口，分離右側(cè)頸總動脈（common carotid artery，CCA）、頸外動脈（external carotid artery，ECA）、頸內(nèi)動脈（internal carotid artery，ICA），微動脈夾夾閉ICA，近心端結(jié)扎CCA、ECA、距CCA 分叉部2 mm 處剪口，將栓線插入到ICA，在CCA遠心端輕系栓線。用眼科鑷將線栓向腦部送入，線栓的線直徑0.16 mm，頭部直徑0.20±0.01 mm，插入深度為9 mm（血管分叉處至線栓前端的距離）。待確定好插入深度后，系牢CCA遠心端的結(jié)扎線，線栓插入的時間即為腦缺血的時間。在腦缺血90 min 時，用鑷子緩慢拔出線栓約1 cm后剪斷線栓，剩余少部分線拴留在CCA 中，以防止血管出血。同時血液可由willis環(huán)再次進入大腦中動脈，實現(xiàn)腦部血管再灌注。之后縫合動物傷口，回籠飼養(yǎng)，正常供應(yīng)水和飼料，觀察動物狀態(tài)。小鼠腦內(nèi)線栓走向如圖1所示。

圖1 小鼠腦內(nèi)線栓走向示意圖

C57BL/6 和ICR 正常組小鼠僅進行頸部血管分離操作，縫合傷口后，回籠飼養(yǎng)，正常供應(yīng)水和飼料，觀察動物狀態(tài)。

1.3.3 復(fù)合Garcia神經(jīng)評分

C57BL/6 和ICR 模型組小鼠分別于缺血后6h 和24h進行復(fù)合Garcia神經(jīng)行為學(xué)評分，滿分為21分，最低分為3分，評分全程在一塊20 cm×30 cm的粗糙平板上進行。復(fù)合Garcia神經(jīng)行為學(xué)評分標準[7]如下表1。

表1 復(fù)合Garcia神經(jīng)行為學(xué)評分表

1.3.4 體重變化率測定

在小鼠術(shù)前和術(shù)后的24 h，分別用電子天平稱得其體重，計算其體重變化率。體重變化率的計算方法為：體重變化率（%）=（術(shù)前體重-術(shù)后體重）/術(shù)前體重×100%

1.3.5 腦指數(shù)測定

在小鼠MCAO 術(shù)后24 h，接受0.5%戊巴比妥腹腔注射麻醉，迅速斷頭處死取前腦，用濾紙小心地吸掉小鼠前腦表面的腦脊液和血液，用電子天平稱量得到整腦濕重（精確到0.001 g），腦指數(shù)的計算方法為：腦指數(shù)（%）=整腦濕重/小鼠體重×100%

1.3.6 腦含水量測定

在小鼠MCAO 術(shù)后24 h，接受0.5%戊巴比妥腹腔注射麻醉，迅速斷頭處死取前腦，取右半側(cè)缺血側(cè)大腦，輕輕用濾紙吸去表面的血液和腦脊液，置于已稱重的培養(yǎng)皿中，用電子天平稱濕重（精確到0.001 g），然后放入60℃的烘箱中烘烤72 h 至恒重，稱其干重，計算腦組織含水量。腦含水量的計算方法為：腦含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.3.7 腦梗死面積測定

在小鼠MCAO 術(shù)后24 h，接受0.5%戊巴比妥腹腔注射麻醉，迅速斷頭處死，取腦后及時沿冠狀縱切成4片，腦片隨即用0.2%TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）在37℃恒溫下進行染色約20 min，拍攝腦片梗死灶分布情況照片，并用image pro plus 軟件畫出每個腦片的缺血面積和全腦片面積，計算腦梗死面積。腦梗死面積的計算方法為：腦梗死面積（%）=梗死面積/全腦片面積×100%。

1.3.8 觀察動物生存率

截止到缺血后的24 h，觀察C57BL/6 和ICR 模型組小鼠的生存率。生存率的計算方法為：生存率=存活只數(shù)/原始只數(shù)×100%。

1.4 腦部血管鑄型

選擇ICR小鼠進行腦部血管鑄型。用生理鹽水進行灌注，直至沖洗出的血水顏色變淺，肝臟變白，后用自凝牙托水（3.75 mL）、自凝牙托粉（2 g）、鄰二甲基苯丙醛（1.5 mL）、紅色顏料（0.2 g）混勻后從心尖注入小鼠體內(nèi)。靜置24h 后，剪掉多余的皮毛和組織，泡入4 mol·L-1的氫氧化鉀溶液中約一周，即得到ICR 小鼠腦血管鑄型。將得到的血管形態(tài)進行修剪，得到圖。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

以上數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標準差（±s）表示，若各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，則進行單因素ANOVA 分析，P＜0.05 為具有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.01 為具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

2 實驗結(jié)果

2.1 C57BL/6和ICR小鼠神經(jīng)行為學(xué)數(shù)據(jù)比較

如圖所示，C57BL/6 模型組小鼠腦缺血后6 h 和24 h的神經(jīng)行為學(xué)評分顯著低于與C57BL/6正常組小鼠，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；ICR 模型組小鼠腦缺血后6 h 和24 h 的神經(jīng)行為學(xué)評分顯著低于ICR 正常組小鼠，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；C57BL/6 模型組小鼠腦缺血后6 h 和24 h 的神經(jīng)行為學(xué)評分低于ICR模型組小鼠，但差異并無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2）。

圖2 C57BL/6和ICR小鼠缺血后6 h（a）和24 h（b）的神經(jīng)行為學(xué)評分比較（±s）

2.2 C57BL/6和ICR小鼠體重差異數(shù)據(jù)比較

如圖所示，C57BL/6 模型組小鼠的體重差異顯著高于C57BL/6正常組小鼠，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；ICR 模型組小鼠的體重差異顯著高于ICR 正常組小鼠，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；C57BL/6 模型組小鼠的體重差異顯著高于ICR 模型組小鼠，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖3）。

圖3 C57BL/6和ICR小鼠術(shù)前和術(shù)后體重差異數(shù)據(jù)比較（±s）

2.3 C57BL/6和ICR小鼠腦指數(shù)數(shù)據(jù)比較

如圖所示，C57BL/6 模型組小鼠的腦指數(shù)顯著高于C57BL/6 正常組小鼠，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；ICR 模型組小鼠的腦指數(shù)顯著高于ICR 正常組小鼠，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；C57BL/6 模型組小鼠的腦指數(shù)顯著高于ICR 模型組小鼠，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4 C57BL/6和ICR小鼠腦指數(shù)數(shù)據(jù)比較（±s）

2.4 C57BL/6和ICR小鼠腦含水量數(shù)據(jù)比較

如圖所示，C57BL/6 模型組小鼠的腦含水量顯著高于C57BL/6正常組小鼠，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；ICR 模型組小鼠的腦含水量顯著高于ICR 正常組小鼠，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；C57BL/6 模型組小鼠的腦含水量顯著高于ICR 模型組小鼠，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖5）。

圖5 C57BL/6和ICR小鼠腦含水量數(shù)據(jù)比較（±s）

2.5 C57BL/6和ICR小鼠腦梗死面積數(shù)據(jù)比較

如圖所示，C57BL/6 模型組小鼠的腦梗死面積顯著高于C57BL/6 正常組小鼠，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；ICR 模型組小鼠的腦梗死面積顯著高于ICR 正常組小鼠，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；C57BL/6 模型組小鼠的腦梗死面積顯著低于ICR 模型組小鼠，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。腦梗死情況如圖6 所示，采用TCC 染色法檢測小鼠腦梗死情況，發(fā)生腦梗死部分的腦組織呈現(xiàn)白色的梗死灶，C57BL/6 和ICR 的正常組小鼠無明顯白色梗死灶，而C57BL/6 和ICR 模型組小鼠出現(xiàn)明顯的白色梗死灶，可觀察到C57BL/6 模型組小鼠的腦梗死區(qū)域較小，ICR 模型組小鼠的腦梗死面積與較C57BL/6模型組有所增加。腦梗死面積的數(shù)據(jù)統(tǒng)計如圖7。

圖6 C57BL/6和ICR小鼠局灶性腦梗死的梗死灶

圖7 C57BL/6和ICR小鼠腦梗死面積數(shù)據(jù)比較（±s）

2.6 C57BL/6和ICR小鼠生存率數(shù)據(jù)比較

腦缺血24 h 后，發(fā)現(xiàn)C57BL/6 模型組小鼠因手術(shù)失敗出血過多死亡1只，生存率為90.91%；ICR 模型組小鼠因造模過重死亡3只，生存率為72.72%。

2.7 ICR小鼠腦部血管鑄型

ICR小鼠腦部血管鑄型圖如圖8所示。

圖8 ICR小鼠腦部血管鑄型圖

3 討論

引發(fā)缺血性腦卒中的原因是腦部組織供血的動脈血流阻斷或減少，無法為組織細胞提供氧糖。當缺血性腦卒中發(fā)生后，進一步會導(dǎo)致腦水腫等并發(fā)癥，使顱內(nèi)壓增高使該局部腦組織被破壞，并難以恢復(fù)，臨床上常會通過溶栓等方法恢復(fù)腦部血液重新灌流及腦組織脫水并降低顱壓等方法進行治療[7]，但缺血區(qū)域神經(jīng)元死亡等難以恢復(fù)和逆轉(zhuǎn)，是目前科研工作者們難以攻克的問題。

在臨床上，恢復(fù)組織器官的血液灌流是及時治療缺血性腦卒中的重要治療方法，但在血液重新灌注及氧供時往往會發(fā)生加重組織損傷的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象被稱為腦缺血再灌注損傷，是進一步加重缺血性腦卒中、腦水腫、腦出血、神經(jīng)元死亡等重要原因[8]，還會引起鈣超載、興奮性氨基酸的神經(jīng)毒作用、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體損傷、炎性反應(yīng)和調(diào)控凋亡基因等，最終導(dǎo)致難以逆轉(zhuǎn)的腦損傷[9]。腦缺血再灌注通常被分為兩個過程，一個是缺血的過程，一個是再灌注的過程。在缺血的過程中，動脈血流受阻導(dǎo)致細胞缺少紅細胞供氧，并導(dǎo)致線粒體中電子傳輸鏈障礙，進而使線粒體中ATP 的產(chǎn)生減少，導(dǎo)致了鈉鉀泵功能障礙，致使細胞高滲性，終使細胞腫脹和破裂；在再灌注過程中，動脈中的缺血組織恢復(fù)血流和供氧，活性氧的產(chǎn)生會增加，進而會導(dǎo)致氧化應(yīng)激、局部炎癥反應(yīng)和脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）損傷，其中又因為局部炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，所以細胞結(jié)構(gòu)破損加重，最后導(dǎo)致細胞死亡，造成不可逆的后果[10]。腦缺血再灌注損傷的病機十分復(fù)雜，目前已知的就已包含了多種途徑與機制，它們之間又互相影響、互相關(guān)聯(lián)，因此腦缺血再灌注損傷成為研究的熱點與難點，該研究過程中所涉及到的大腦中動脈閉塞模型應(yīng)用廣泛，并在不斷的摸索中逐漸成熟。

MCAO的模型制作全過程在上述實驗方法中已詳細說明。線栓在腦血管中的路線是從CCA 進入ICA，導(dǎo)致大腦中動脈中的血流降低或被阻斷，一個較好的模型應(yīng)從腦片的TTC 染色中得到面積較大的腦梗死面積，約占整個腦片面積的30%-50%。在這個過程中最為關(guān)鍵的是：保證線栓進入ACA 并阻斷或降低對側(cè)來的血流，且線栓不刺破血管。這是MCAO 制作的原理，也是確保最終實現(xiàn)腦缺血的關(guān)鍵所在。MCAO 模型制作的原理正是模仿了缺血性腦卒中的發(fā)病過程，通過栓線降低或阻滯大腦中動脈的血流量，使一側(cè)大腦供血不足，并可以通過控制栓線在體內(nèi)的時間進行再灌注，模仿臨床上溶栓治療的時間[11]。

在基礎(chǔ)研究中，進行實驗之前選擇動物的種類是重要的一步，但往往是容易被忽略的地方。此前有研究發(fā)現(xiàn)，在MCAO 模型制備過程中，動物體重[12]、麻醉方式[13]、線栓插入深度[14-15]、線栓頭段直徑[16]等因素對大小鼠造模成功與否均具有十分關(guān)鍵的作用。但實驗動物的品系選擇往往會對實驗數(shù)據(jù)產(chǎn)生一定的影響，因為不同品系之間的差異是確實存在的。比如李祥磊等[17]發(fā)現(xiàn)ICR、C57BL/6J 在學(xué)習(xí)方面存在差異三個品系中，C57BL/6J 小鼠自發(fā)活動低，曠場實驗焦慮水平高，空間參考記憶優(yōu)于ICR 小鼠；李騰飛[18]等發(fā)現(xiàn)C57BL/6 小鼠與ICR 小鼠在急性應(yīng)急抑郁模型中的表現(xiàn)有一定差異，在小鼠自發(fā)活動量和對新奇環(huán)境的探索能力上，C57BL/6 小鼠不如ICR 小鼠，并且C57BL/6小鼠在急性應(yīng)激刺激下更易產(chǎn)生行為絕望；劉芳[19]等在研究肥胖模型時發(fā)現(xiàn)C57BL/6J 模型組小鼠可形成良好肥胖模型，ICR 模型組小鼠與肥胖模型相關(guān)的指標，如體重、脂肪重量、Lee’s 指數(shù)、脂肪細胞橫截面面積等，均不如C57BL/6J 小鼠變化明顯；王瑞雪[20]等發(fā)現(xiàn)不同品系小鼠在禁食和（或）禁水狀況下血糖變化趨勢有所不同，表現(xiàn)為ICR 小鼠的血糖濃度低于C57BL/6J 小鼠，但ICR 小鼠的血糖變化幅度較C57BL/6J 小鼠更大。以上均結(jié)果提示，在各項實驗研究中，需同時考慮不同品系動物之間的差異，從而選擇合適的動物進行研究并對數(shù)據(jù)進行合理分析和解釋。

本實驗研究通過統(tǒng)計小鼠MCAO 模型制作前后體重、生存率、神經(jīng)行為學(xué)評分、腦指數(shù)、腦含水量、腦梗死面積等方面的數(shù)據(jù)表明，采用相同的造模方法均可成功實現(xiàn)大腦中動脈栓塞模型，但在C57BL/6 與ICR 小鼠間存在較為顯著的品系間差異。本研究通過比較C57BL/6 和ICR 兩種不同品系的小鼠在MCAO 模型制作前后體重、生存率、神經(jīng)行為學(xué)評分、腦指數(shù)、腦含水量、腦梗死面積等方面的差異，并進行了ICR小鼠腦部血管鑄型實驗，發(fā)現(xiàn)由于小鼠品系不同，使術(shù)后各指標之間也具有一定差異，這有可能是由于不同品系間小鼠腦部血管的細微差異所致。本研究結(jié)果可為未來研究者們選擇MCAO 小鼠的模型制作的動物品系方面提供一定的參考。本文中所涉及到的實驗流程如下圖9所示。

圖9 實驗總體流程圖