劉曉明，李 芮，高善語(yǔ)

（山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 濟(jì)南 250014）

特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種發(fā)病機(jī)理不明確的間質(zhì)性肺疾病，目前臨床缺乏有效治療方法及藥物。其中，細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積是肺纖維化的主要病理改變[1-2]，而細(xì)胞自噬正是保護(hù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要途徑，近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)與肺纖維化的發(fā)病密切相關(guān)，自噬受損還誘導(dǎo)更高的炎癥反應(yīng)并增加膠原蛋白的積累，自噬-溶酶體降解途徑則是肺纖維化中降解膠原的主要途徑[3]，提示自噬調(diào)節(jié)失調(diào)可能是肺纖維化發(fā)病的重要機(jī)制之一，而靶向調(diào)控自噬有望成為肺纖維化的診療新靶點(diǎn)和方向。有研究發(fā)現(xiàn)白介素17A 型細(xì)胞因子（Interleukin-17，IL-17A）能夠通過(guò)活化stat3 信號(hào)途徑調(diào)節(jié)自噬相關(guān)核心復(fù)合物組分表達(dá)與活化，進(jìn)而自噬小體的活性被抑制，進(jìn)一步干預(yù)細(xì)胞內(nèi)外膠原蛋白的纖溶及降解。而在多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在多種組織纖維化模型中阻斷IL-17A 能夠使纖維化組織中受損的自噬活性得到顯著恢復(fù)，進(jìn)而阻斷多種組織纖維化的進(jìn)展。由此提出抑制IL-17A可激活自噬活性，延緩各種纖維化的發(fā)生及發(fā)展。進(jìn)而我們推測(cè)阻斷IL-17A 靶向調(diào)控自噬有望成為肺纖維化的診療新靶點(diǎn)和方向。補(bǔ)腎活血方為經(jīng)臨床驗(yàn)證對(duì)肺纖維化有確切療效的中藥處方，前期通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)該方的臨床療效可能與IL-7A 以及細(xì)胞自噬有密切相關(guān)性，因此設(shè)計(jì)該體外實(shí)驗(yàn)，觀(guān)察補(bǔ)腎活血方對(duì)纖維化模型中COL-I（I 型膠原蛋白，Collagen I）、IL-17A 及自噬小體含量的影響，探討補(bǔ)腎活血方在肺纖維化中的作用靶點(diǎn)。為下一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)指明方向，為明確具體的信號(hào)通路奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)具體流程圖見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株和主要試劑

人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5（賽百慷上海生物技術(shù)股份有限公司）；TGF-β1（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1，Transforming growth factor-β1）（MCE中國(guó)）。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)（蘇州凈化SW-CJ-IFD）；HERACELL 150i 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO 公司XD-101）；顯微鏡（日本OLYMPUS公司IX51）；臺(tái)式低速離心機(jī)（廣州吉迪儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)eppendorf 公司5024R）；酶標(biāo)儀（山東恒美電子科技有限公司）；EPS-300 水平電泳儀（賽默飛世爾科技中國(guó)）；VE-186蛋白轉(zhuǎn)膜儀（賽默飛世爾科技中國(guó)）；VE-180蛋白電泳儀（賽默飛世爾科技中國(guó)）。

2 實(shí)驗(yàn)方案

2.1 補(bǔ)腎活血方血清制備

2.1.1 補(bǔ)腎活血方中藥湯藥制備

課題組于濟(jì)南市西嶺角養(yǎng)殖中心購(gòu)入新西蘭兔20 只，雄性，體質(zhì)量2.75±0.25 kg（SCXK(Lu) 201501）。將上述新西蘭兔飼養(yǎng)于山東省中醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。所有新西蘭兔在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均可自由進(jìn)食和飲水。將8 倍新西蘭兔等效劑量的中藥準(zhǔn)確稱(chēng)取，加入8 倍量的水浸泡后煎煮，藥液過(guò)濾濃縮，濃度為5 g·mL-1（生藥量），置4℃冰箱保存?zhèn)溆肹1]。

2.1.2 制備過(guò)程

健康新西蘭兔隨機(jī)分為含藥血清組和正常血清組。

以56 g·kg-1生藥量對(duì)新西蘭兔進(jìn)行灌胃。在灌胃前，對(duì)新西蘭兔禁食12 h，其中含藥血清組1 日灌胃2次11.2 mL/（kg·天），正常血清組以等體積0.9% NaCl灌胃1日2次。連續(xù)灌胃給藥7天，在末次給藥1 h后，對(duì)仍處在自然意識(shí)狀態(tài)下的新西蘭兔，腹腔注射1%利多卡因5 mL，取腹主動(dòng)脈血。將所取血液置于37℃下放置1 h。血凝后，5000 r/min 離心10 min。分離血清，將同組血清混合，并滅活補(bǔ)體。然后使用0.22 μm醋酸纖維素膜對(duì)血清進(jìn)行過(guò)濾和消毒，在-20°C 下保存以備將來(lái)使用[1]。

2.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的培養(yǎng)

MRC-5 細(xì)胞被置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中，在添加10%胎牛血清的不完全DMEM 培養(yǎng)基（Dulbecco′s modification of Eagle′s medium Dulbecco，改良Eagle 培養(yǎng)基）中生長(zhǎng)，并以傳代后狀態(tài)較好的第3-4代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù)

參照文獻(xiàn)[3]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定TGF-β1 誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞活化的最佳濃度為5 ng·mL-1，最佳刺激時(shí)間為48 h。

2.3.1 實(shí)驗(yàn)分組一

對(duì)照組，不同稀釋倍數(shù)的含藥血清組（1 倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍、1/16倍、1/32倍、1/64倍、1/128倍）。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)分組二

空白對(duì)照組，TGF-β1處理組，TGF-β1處理+最佳濃度含藥血清干預(yù)1 h 組（含藥血清組），TGF-β1 處理+基因敲除陰性對(duì)照組（sh-NC 組），TGF-β1 處理+IL-7A 基因敲減組（sh-IL-17A 組），TGF-β1 處理+最佳濃度含藥血清干預(yù)1 h+過(guò)表達(dá)質(zhì)粒陰性對(duì)照組（Vector 組），TGF-β1 處理+最佳濃度含藥血清干預(yù)1 h+IL-17A過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組（IL-17AOE組）。

2.4 MTT法測(cè)定各組對(duì)MRC-5細(xì)胞增殖的抑制情況

將細(xì)胞隨機(jī)分為9組，包括正常組（正常DMEM培養(yǎng)基）及不同稀釋濃度含藥血清干預(yù)組。各組細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中（37℃5%CO2）培養(yǎng)24 h，棄去舊培養(yǎng)液，每孔加入20 μL MTT 液（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽），繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄去MTT液，加入DMSO，震蕩搖勻后在避光孵育15 min，酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)490 nm 處各孔OD 值并記錄，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[1]。

2.5 CCK8（Cell Counting Kit-8）法檢測(cè)含藥血清對(duì)MRC-5細(xì)胞增殖的影響

MRC-5 細(xì)胞以1×105/孔接種于96 孔微量滴定板，除空白對(duì)照組外，其余各組加入TGF-β1 誘導(dǎo)48 h。然后更換100 μL新培養(yǎng)基，加入10%CCK8，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm 測(cè)各組OD 值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[1]。

2.6 RT-qPCR 技術(shù)（Real time Quantitative PCR，實(shí)時(shí)熒光定量）檢測(cè)含藥血清對(duì)MRC-5 細(xì)胞中IL-17A 含量的影響

用超純RNA提取試劑盒提取樣本中總RNA，采用RT-qPCR 方法檢測(cè)mRNA 的表達(dá)水平，以GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，甘油醛-3-磷酸脫氫酶）作為內(nèi)參基因。表1-表2 為引物序列。

表1 IL-17A引物序列

表2 COL-Ⅰ引物序列

2.7 Western blot（蛋白質(zhì)印跡法）檢測(cè)COL-Ⅰ、IL-17A、LC3Ⅱ（膜型自噬體）含量的變化

抽提總蛋白，具體操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。最后放入凝膠成像儀中顯影。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，應(yīng)用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行具體分析，組間比較結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式表示，P＜0.01 表明差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05 差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

3.1 最佳濃度含藥血清的選擇

3.1.1 各組含藥血清對(duì)MRC-5細(xì)胞的抑制情況

由圖2 可見(jiàn)，當(dāng)含藥血清稀釋至0.0625 倍（1/16）時(shí)，細(xì)胞抑制率為10.06%，該藥物濃度下，細(xì)胞抑制率較低，對(duì)細(xì)胞損傷小，相對(duì)安全，故將含藥血清濃度稀釋至0.0625倍定為本實(shí)驗(yàn)的藥物最大無(wú)毒濃度。

圖2 各組對(duì)MRC-5細(xì)胞增殖的抑制情況

3.1.2 Western blot法檢測(cè)各組COL-I 蛋白含量情況

由圖3 顯示，組間分析顯示，MRC-5 細(xì)胞加入含藥血清干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)COL-ⅠmRNA 表達(dá)最大無(wú)毒濃度組（a組）降低最明顯。

圖3 不同濃度含藥血清對(duì)細(xì)胞內(nèi)COL-Ⅰ蛋白含量的影響

3.2 含藥血清對(duì)MRC-5細(xì)胞增殖的影響

表3 顯示，與空白對(duì)照組比較，TGF-β1 處理組的MRC-5 細(xì)胞增殖水平顯著增加（P＜0.01），增殖率為15.21%。

表3 含藥血清對(duì)MRC-5細(xì)胞增殖的影響（±s）

表3 含藥血清對(duì)MRC-5細(xì)胞增殖的影響（±s）

注：▲與空白組相比較，P＜0.01；▼與模型組相比較，P＜0.01。

組別空白對(duì)照組TGF-β1處理組含藥血清組sh-IL-17A組IL-17AOE組OD值2.493±0.213 3.198±0.137▲2.473±0.086▼2.480±0.123▼3.215±0.126增殖抑制率（%）22.67 22.45

3.3 各組MRC-5細(xì)胞中IL-17A mRNA的表達(dá)量

3.3.1 含藥血清組與TGF-β1 處理組、空白對(duì)照組MRC-5細(xì)胞中的IL-17A mRNA表達(dá)量比較

表4、圖4 中，TGF-β1 處理組與空白對(duì)照組MRC-5 細(xì)胞中的IL-17A mRNA 表達(dá)量比較（P＜0.05），含藥血清組與TGF-β1 處理組MRC-5 細(xì)胞中的IL-17A mRNA表達(dá)量比較（P＜0.01）。

表4 含藥血清對(duì)IL-17A mRNA表達(dá)量的影響（±s）

表4 含藥血清對(duì)IL-17A mRNA表達(dá)量的影響（±s）

注：▲與空白組相比較，P＜0.05；▼與模型組相比較，P＜0.05。

組別空白對(duì)照組TGF-β1處理組含藥血清組IL-17A mRNA表達(dá)量1.030±0.282 9.756±1.560▲1.907±0.679▼

圖4 含藥血清對(duì)IL-17A mRNA表達(dá)量的影響

3.3.2 sh-NC 組與sh-IL-17A 組MRC-5 細(xì)胞中IL-17A mRNA表達(dá)量比較

表5、圖5 中，sh-NC 組與sh-IL-17A 組MRC-5 細(xì)胞中的IL-17A mRNA表達(dá)量比較（P＜0.01）。

圖5 IL-17A基因敲除后IL-17A mRNA表達(dá)量的影響

表5 IL-17A基因敲除后IL-17A mRNA表達(dá)量的影響（±s）

表5 IL-17A基因敲除后IL-17A mRNA表達(dá)量的影響（±s）

注：▼與sh-NC組相比較，P＜0.05。

組別sh-NC組sh-IL-17A組IL-17A mRNA表達(dá)量1.008±0.128 0.471±0.072▼

3.3.3 IL-17AOE 組與Vector 組MRC-5 細(xì)胞中的IL-17A mRNA表達(dá)量比較

表6、圖6 中，IL-17AOE 組與Vector 組MRC-5 細(xì)胞IL-17A mRNA表達(dá)量比較（P＜0.01）。

圖6 IL-17A質(zhì)粒過(guò)表達(dá)后對(duì)IL-17A mRNA表達(dá)量的影響

表6 IL-17A質(zhì)粒過(guò)表達(dá)后對(duì)IL-17A mRNA表達(dá)量的影響（±s）

表6 IL-17A質(zhì)粒過(guò)表達(dá)后對(duì)IL-17A mRNA表達(dá)量的影響（±s）

注：▼與Vector組相比較，P＜0.05。

組別Vector組IL-17AOE組IL-17A mRNA表達(dá)量1.011±0.199 6.730±1.271▼

3.4 各組MRC-5細(xì)胞中COL-Ⅰ、IL-17A蛋白含量情況

COL-Ⅰ：圖7 顯示，含藥血清組細(xì)胞中COL-Ⅰ蛋白含量較TGF-β1處理組明顯降低；sh-IL-17A組細(xì)胞中COL-Ⅰ蛋白含量較sh-NC 組明顯減少，而IL-17AOE 組細(xì)胞中COL-Ⅰ蛋白含量較Vector 組明顯增加。

IL-17A：圖7 顯示，TGF-β1 處理組細(xì)胞中IL-17A蛋白含量量較空白對(duì)照組明顯增多，而含藥血清組細(xì)胞中IL-17A 蛋白含量較TGF-β1 處理組明顯減少；sh-IL-17A 組細(xì)胞中IL-17A 蛋白含量較sh-NC 組明顯減少，而IL-17AOE 組細(xì)胞中IL-17A 蛋白含量較Vector組明顯增加。

圖7 各組MRC-5細(xì)胞中COL-Ⅰ、IL-17A蛋白含量情況

3.5 各組MRC-5 細(xì)胞中自噬小體LC3-Ⅱ蛋白含量情況

圖8 激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察自噬小體的形態(tài)

圖8、圖9 顯示，與TGF-β1 處理組比較，含藥血清組細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白含量明顯增多；與sh-NC 組比較，sh-IL-7A 組細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白含量增多，而與Vector 組比較IL-7AOE 組細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白含量明顯減少。

圖8 激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察自噬小體的形態(tài)

圖9 各組溶液對(duì)MRC-5細(xì)胞內(nèi)自噬小體LC3-Ⅱ蛋白表含量情況

4 討論

研究表明，肺間質(zhì)纖維化的形成與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子異常釋放、免疫系統(tǒng)失調(diào)、微循環(huán)障礙及細(xì)胞增殖、重構(gòu)等有關(guān)[4]，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（即不溶性纖維蛋白）的過(guò)度沉積或者分解減少[2]。有研究發(fā)現(xiàn)阻斷IL-17A 的活性，激活細(xì)胞自噬，能夠阻斷膠原蛋白的異常沉積。因此，IL-17A可能成為肺纖維化治療的新靶點(diǎn)。

IL-17 是一種細(xì)胞因子，家族中最具代表性的成員IL-17A，一方面會(huì)誘導(dǎo)炎癥因子以及趨化因子的表達(dá)，另一方面會(huì)誘導(dǎo)一些組織修復(fù)相關(guān)因子的表達(dá)加速機(jī)體的恢復(fù)[5]。過(guò)高的IL-17A水平對(duì)于疾病的病理發(fā)展起到惡化作用。2010年，Wilson等人發(fā)現(xiàn)IL-17A的受體被敲除后，由博萊霉素誘導(dǎo)的肺組織纖維化程度得到顯著改善[6]。近年來(lái)有研究表明，IL-17A 還可以通過(guò)非TGF-β1 依賴(lài)途徑抑制自噬活化，進(jìn)而抑制膠原降解[7-9]。因此，IL-7A 可能成為治療肺纖維化的潛在靶點(diǎn)，阻斷IL-17A的活性為其關(guān)鍵路徑。其中一條為IL-17A 的自噬活化機(jī)制，阻斷IL-17A 能夠抑制Vps34（Ⅲ型磷酸肌醇3-激酶，PI3K），進(jìn)而通過(guò)GSK3β信號(hào)通路激活抑制性蛋白Bcl-2（B-cell lymphoma-2，B 淋巴細(xì)胞瘤-2）的ser70 位的磷酸化，抑制Bcl-2 與Beclin-1（programmed cell death-1，程序性死亡受體-1）結(jié)合，最終促進(jìn)自噬活化，增加膠原蛋白的降解。自噬主要通過(guò)調(diào)節(jié)膠原降解和細(xì)胞凋亡來(lái)控制或者延緩肺纖維化的進(jìn)展[10-11]。許多研究報(bào)道認(rèn)為纖維化肺細(xì)胞中的自噬活性是降低的、促纖維化反應(yīng)是激活的[12]。在肺纖維化患者的肺組織中可檢測(cè)到自噬小體，應(yīng)用具有生物活性的自噬小體來(lái)評(píng)價(jià)自噬的活性[13-16]。自噬核心復(fù)合物（Bcl-2、Beclin-1、Vps34、Vps15、Atg14 以及Ambral 等）在自噬的活化過(guò)程中發(fā)揮了極其重要的作用，當(dāng)Bcl-2 與Beclin-1 結(jié)合時(shí)，自噬被抑制;當(dāng)Bcl-2 與Beclin-l 解離時(shí)，自噬被活化[17-18]。因此，Bcl-2 與Beclin-1 結(jié)合與否，是自噬活化的關(guān)鍵。因此，研究有效藥物通過(guò)抑制Bcl-2 與Beclin-1的結(jié)合，自噬活性被活化，進(jìn)一步降解肺組織中膠原成分，阻斷甚至逆轉(zhuǎn)組織纖維化，為治療肺纖維化疾病提供新的治療思路。

課題組應(yīng)用李芮教授治療肺纖維化的協(xié)定方補(bǔ)腎活血方（人參9 g，黃芪30 g，熟地黃15 g，山茱萸9 g，麥冬15 g，五味子6 g，當(dāng)歸15 g，丹參15 g，黃芩15 g，川貝母6 g，虎杖18 g，炙甘草6 g），以傳統(tǒng)中醫(yī)理論為指導(dǎo)進(jìn)行了一系列的臨床及實(shí)驗(yàn)研究。其中2011 年在對(duì)慢阻肺合并肺纖維化的臨床觀(guān)察中發(fā)現(xiàn)，該方對(duì)老年患者的癥狀、體征有顯著改善作用，同時(shí)能夠升高隨增齡而降低的IgM，調(diào)節(jié)免疫球蛋白的改變，同時(shí)對(duì)炎癥指標(biāo)CRP 亦有明顯的降低作用。因此可以從中看出補(bǔ)腎活血方治療肺纖維化可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫、減輕炎癥反應(yīng)等方面來(lái)實(shí)現(xiàn)的[19]。而近年來(lái)在對(duì)該方的進(jìn)一步臨床研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血方治療IPF 療效確切，既能夠改善肺內(nèi)換氣功能、提高動(dòng)脈血攜氧能力、調(diào)節(jié)氧化/抗氧化失衡、減輕抗炎癥反應(yīng)，同時(shí)還抑制膠原蛋白異常沉積，從而達(dá)到治療IPF 的良好療效[20]。方中以人參、黃芪、麥冬、熟地黃以補(bǔ)肺益腎，共為君藥；山茱萸、五味子上斂肺氣、下固腎精，共為臣藥；佐以當(dāng)歸、丹參活血通絡(luò)，黃芩、虎杖以清瀉肺熱，川貝母、炙甘草祛痰止咳，六藥合用共祛瘀、痰、熱毒；炙甘草兼為使藥，以調(diào)和諸藥。“補(bǔ)腎活血方”對(duì)正氣虧虛、痰瘀毒聚所致的肺纖維化具有顯著的臨床療效。

基于以上研究基礎(chǔ)，我們提出假說(shuō)：補(bǔ)腎活血方扶正、祛瘀、化痰、解毒，減少膠原蛋白的異常沉積是其治療肺間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其機(jī)制可能與IL-17A/PI3K/GSK3β信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞自噬密切相關(guān)。

根據(jù)圖10 假說(shuō)我們課題組進(jìn)行了一系列相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，基于詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可知：

圖10 課題假說(shuō)圖

首先，通過(guò)測(cè)定不同濃度含藥血清對(duì)MRC-5細(xì)胞增殖的抑制情況，選取含藥血清的最大無(wú)毒濃度。組間分析顯示，最大無(wú)毒濃度組（a 組）降低最明顯（P＜0.01），a、b組與對(duì)照組兩兩比較差異性顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，c、d組無(wú)明顯差異。因此最終選定a組濃度為本研究的最佳有效濃度。

其次，TGF-β1 處理組MRC-5 細(xì)胞的增殖率及COL-Ⅰ的蛋白表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組，說(shuō)明應(yīng)用TGF-β1作用MRC-5細(xì)胞造模成功。

第三，與TGF-β1 處理組比較，含藥血清組和sh-IL-17A 組細(xì)胞增殖水平均降低（P＜0.01），且兩組之間細(xì)胞增殖率無(wú)明顯差異（P＞0.05）；而IL-17AOE 組細(xì)胞增殖水平與TGF-β1 處理組相似，兩組之間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。同時(shí)與TGF-β1 處理組比較，含藥血清組細(xì)胞中COL-Ⅰ的蛋白含量明顯降低，sh-IL-17A組細(xì)胞中COL-Ⅰ蛋白含量較sh-NC 組明顯減少，而IL-17AOE組細(xì)胞中COL-Ⅰ蛋白含量較Vector組明顯增加。說(shuō)明含藥血清能夠明顯的降低MRC-5 細(xì)胞中膠原蛋白的含量，也可以說(shuō)補(bǔ)腎活血方可有效的降低MRC-5細(xì)胞內(nèi)的膠原蛋白的含量，其作用途徑可能與阻斷IL-17A通路有關(guān)。

第四，各組IL-17A mRNA表達(dá)量及蛋白含量比較中可以看出，而含藥血清組細(xì)胞中IL-7A mRNA 表達(dá)量及IL-17A 蛋白含量較TGF-β1 處理組明顯減少，且sh-IL-17A組細(xì)胞中IL-7A mRNA表達(dá)量及IL-17A蛋白含量較sh-NC 組明顯減少。IL-17AOE 組細(xì)胞中IL-7A mRNA 表達(dá)量及IL-17A 蛋白含量較Vector 組明顯增加。進(jìn)一步驗(yàn)證了該方是通過(guò)阻斷IL-17A 通路而起到治療肺纖維化作用的。

第五，在各組MRC-5 細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)記蛋白LC3-Ⅱ含量比較中發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 組較空白對(duì)照組MRC-5細(xì)胞中的LC3-Ⅱ蛋白含量降低，而與TGF-β1 處理組比較，含藥血清組細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白含量明顯增多與sh-NC組比較，sh-IL-7A組細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白含量增多，而與Vector組比較IL-7AOE組細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白含量明顯減少。進(jìn)一步說(shuō)明了補(bǔ)腎活血方治療肺纖維化是通過(guò)阻斷IL-17A 通路、激活細(xì)胞自噬、降解膠原蛋白而實(shí)現(xiàn)的。

總之，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血方主要是通過(guò)阻斷IL-17A、激活細(xì)胞自噬、進(jìn)而降解膠原蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)肺間質(zhì)纖維化的治療作用。該實(shí)驗(yàn)是山東中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃的一項(xiàng)在研課題，也是濟(jì)南市科技局臨床醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新計(jì)劃課題的一部分，該實(shí)驗(yàn)主要是以MRC-5細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)準(zhǔn)確找到中藥復(fù)方（補(bǔ)腎活血湯）靶向治療的分子靶點(diǎn)，是本項(xiàng)目的創(chuàng)新，為下一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指明研究方向，為進(jìn)一步明確具體的信號(hào)通路奠定基礎(chǔ)，并詳細(xì)闡釋中藥復(fù)方的靶向治療機(jī)理，為臨床應(yīng)用中藥治療IPF提供新的方法及理論支持。