劉演龍，光雪峰，尹小龍，戴海龍

（昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院心內(nèi)科/云南省心血管疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/云南省心臟疾病臨床醫(yī)學(xué)中心，云南 昆明 650051）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性炎癥主導(dǎo)的疾病，其首要驅(qū)動因素是巨噬細(xì)胞表型失調(diào)[1]。激活的巨噬細(xì)胞主要被極化成兩種表型，經(jīng)典激活的M1 和間接激活的M2 巨噬細(xì)胞，啟動并促進(jìn)炎癥是M1 巨噬細(xì)胞的主要作用，而M2 巨噬細(xì)胞的主要作用為抑制炎癥[2]。在炎癥的早期啟動中，由于各種炎癥因子的誘導(dǎo)，M1 巨噬細(xì)胞被大量激活，能夠有效清除病原體；隨著炎癥進(jìn)展，激活了大量的M2 巨噬細(xì)胞，炎癥反應(yīng)被抑制[2-3]。Schmitz 等[4-5]發(fā)現(xiàn)，M2 巨噬細(xì)胞主要存在于穩(wěn)定性動脈粥樣硬化斑塊中，而M1巨噬細(xì)胞主要存在于不穩(wěn)定性動脈粥樣硬化斑塊中，提示斑塊的不穩(wěn)定可能是由于M1 和M2 之間失衡。

MicroRNA 在單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化過程中起著重要的調(diào)控作用。最近研究顯示，隨著單核細(xì)胞分化為M1 巨噬細(xì)胞，miR-125a-3p 和miR-125a-5 在此過程中也表達(dá)升高。M1 巨噬細(xì)胞比例的升高，M1/M2 巨噬細(xì)胞的分化失衡，導(dǎo)致不穩(wěn)定斑塊的形成[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)MMP-9、VEGF 在不穩(wěn)定斑塊中呈高表達(dá)[8-9]，并且MMP導(dǎo)致巨噬細(xì)胞積累，VEGF 將巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)為M1巨噬細(xì)胞[10-11]，表明MMP-9、VEGF 在不穩(wěn)定斑塊中起重要作用。筆者的研究[12]顯示miR-125a-3p 在動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定及破裂中也起著重要的作用。本研究擬進(jìn)一步在動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，觀察miR-125a-3p 抑制劑對動脈粥樣硬化斑塊形成、M1/M2 巨噬細(xì)胞以及斑塊組織中MMP-9 和VEGF 表達(dá)的影響，以探討其在動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性中的作用，為不穩(wěn)定斑塊的防治提供新的藥物靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

15 只成年雄性健康日本大耳兔，體重2～2.5 kg，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部提供。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批，實(shí)驗(yàn)動物的處理符合實(shí)驗(yàn)動物相關(guān)要求。

1.2 主要試劑和儀器

牛血清白蛋白（Solarbio）、0.5% 膽固醇，l0%蛋黃，5% 豬油、miR-125a-3p 干擾慢病毒載體（廣州復(fù)能基因有限公司）、生理鹽水、甲醛溶液、70%乙醇、4% 中性福爾馬林、油紅O 染液、0.01M 的PBST、2%BSA、CD11c抗體（Affinity）、CD206抗體（Affinity）、VEGF抗體（Santa Cruz Biotechmology）、MMP-9 抗體（Solarbio）。Axio Lab A1 顯微鏡（蔡司）、Axio Observer A1 熒光顯微鏡（蔡司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 兔動脈粥樣硬化模型的建立及miR-125a-3p 抑制劑干預(yù)15 只成年雄性健康日本大耳兔，給予普通飼料和水適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，再將其隨機(jī)分為3組，對照組、動脈粥樣硬化模型組（AS 模型組）和miR-125a-3p 抑制劑干預(yù)組（miR-125a-3p抑制劑組）。對照組給以普通飼料喂養(yǎng)，動脈粥樣硬化模型組和miR-125a-3p 干預(yù)組一次性靜脈注射牛血清白蛋白（250 mg/kg），即日起給予（0.5% 膽固醇，l0% 蛋黃，5% 豬油）150 g/d 喂養(yǎng)2 周，給予動脈粥樣硬化模型組和miR-125a-3p干預(yù)組第2 次注射牛血清白蛋白（250 mg/kg），并繼續(xù)給予高膽固醇飼料喂養(yǎng)。期間，所有組提供充足干凈水，定期打掃和清洗兔籠。分別于動脈粥樣硬化建立4 周和8 周后，miR-125a-3p 干預(yù)組注射以miR-125a-3p 干擾慢病毒載體（5 mL/只），對照組和動脈粥樣硬化模型組注射以等量生理鹽水，12 周時(shí)耳緣靜脈注射空氣處死兔子，立即剖開胸、腹腔，游離主動脈全長，剝離外膜脂肪組織，縱行剖開，行以下述處理。

1.3.2 血管內(nèi)膜油紅“O”染色血管粥樣斑塊大體標(biāo)本染色步驟（1）從甲醛溶液中取出標(biāo)本，用流水洗15 min，剝?nèi)ネ饽?，再用蒸餾水浸洗；（2）取儲備液60 mL 加入蒸溜水至100 mL，混勻放置10 min 后染色，染色時(shí)間為2～4 min；（3）用70%乙醇浸泡標(biāo)本至斑塊呈紅色，底色呈白色為止，最后用蒸餾水浸泡標(biāo)本，浸入甲醛溶液中保存。油紅O 染液的配制：儲備液：油紅O 0.5 g，98%異丙醇 100 mL。臨用前取上液6 mL，加蒸餾水4 mL，靜置10 min，過濾即可。

1.3.3 免疫組織化學(xué)方法檢測斑塊組織中MMP-9、VEGF主動脈經(jīng)4% 中性福爾馬林固定后，石蠟切片進(jìn)行MMP-9、VEGF 表達(dá)測定（SP 法，陰性對照一抗用0.01 mol/L PBS 代替）。顯微鏡下拍照后用“Image Pro Plus 4.5”軟件進(jìn)行圖像分析，測定陽性物質(zhì)表達(dá)面積和積分光密度。

1.3.4 免疫熒光法檢測M1 標(biāo)志物CD11c、M2標(biāo)志物CD206 石蠟切片經(jīng)脫蠟、酒精脫水后，進(jìn)行抗原修復(fù)，用0.01 M 的PBST 漂洗5 min，重復(fù)3 次；以2% BSA 于37 ℃濕盒內(nèi)封閉30 min；標(biāo)本片上滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記抗體，放在濕盒中，37 ℃孵育30 min，0.01 mol/L PBS 漂洗5 min，重復(fù)3 次，不時(shí)震蕩。緩存甘油封片，鏡檢。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 11.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較應(yīng)用方差分析，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血管內(nèi)膜油紅“O”染色結(jié)果

血管內(nèi)膜油紅“O”染色顯示，動脈粥樣硬化病變處被染成紅色。血管內(nèi)膜油紅“O”染色統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示動脈粥樣硬化組病變區(qū)域遠(yuǎn)大于miR-125a-3p 抑制劑干預(yù)組，各組間的差異具有顯著性（P＜ 0.01）（圖1、圖2）。結(jié)果表明：miR-125a-3p 抑制劑能減少動脈粥樣硬化斑塊的形成。

圖1 血管內(nèi)膜油紅“O”染色各組動脈粥樣硬化病變區(qū)域Fig.1 Vascular intima oil red "O" staining for atherosclerotic lesions in each group

圖2 血管內(nèi)膜油紅“O”染色Fig.2 Vascular intima is stained with oil red "O" stain

2.2 免疫組織化學(xué)方法檢測斑塊組織中MMP9的結(jié)果

MMP-9 免疫組化染色結(jié)果顯示，與對照組比較，AS 模型組的MMP-9 水平顯著升高（P＜0.001），與AS 模型組比較，miR-125a-3p 抑制劑干預(yù)后MMP-9 水平顯著下降（P＜ 0.01）（圖3、圖4）。結(jié)果表明：miR-125a-3p 抑制劑干預(yù)后，降低了斑塊組織中MMP-9 的表達(dá)。

圖3 免疫組化檢測各組MMP-9 表達(dá)水平Fig.3 The expression level of MMP-9 was detected by immunohistochemistry

圖4 MMP-9 免疫組化染色（×200）Fig.4 MMP-9 immunohistochemical staining（×200）

2.3 免疫組織化學(xué)方法檢測斑塊組織中VEGF 的結(jié)果

VEGF 免疫組化染色結(jié)果顯示，與對照組對比，AS 模型組的VEGF 水平顯著提高（P＜ 0.01）；與AS 模型組對比，miR-125a-3p 抑制劑干預(yù)后VEGF 水平下降，（P＜ 0.01）（圖5、圖6）。結(jié)果表明：miR-125a-3p 抑制劑干預(yù)后，降低了斑塊組織中VEGF 的表達(dá)。

圖5 免疫組化檢測各組VEGF 表達(dá)水平Fig.5 Immunohistochemistry was used to detect VEGF expression levels in each group

圖6 VEGF 免疫組化染色（×200）Fig.6 VEGF immunohistochemical staining（×200）

2.4 免疫熒光染色檢測M1 標(biāo)志物CD11c 的結(jié)果

免疫熒光檢測M1 標(biāo)志物CD11c 染色結(jié)果顯示：與對照組比較，AS 模型組的CD11c 水平有明顯升高（P＜ 0.000 1）；與AS 模型組比較，miR-125a-3p 抑制劑干預(yù)后CD11c 水平顯著下降（P＜0.000 1）（圖7、圖8）。結(jié)果表明：miR-125a-3p抑制劑減少了斑塊組織中M1 巨噬細(xì)胞。

圖7 免疫熒光檢測各組M1 標(biāo)志物CD11c 表達(dá)水平Fig.7 The expression level of M1 marker CD11c was detected by immunofluorescence

圖8 M1 標(biāo)志物CD11c 免疫熒光染色（×200）Fig.8 M1 marker CD11c immunofluorescence staining（×200）

2.5 免疫熒光染色檢測M2 標(biāo)志物CD206 的結(jié)果

免疫熒光檢測M2 標(biāo)志物CD206 染色結(jié)果顯示，與對照組對比，AS 模型組的CD206 水平顯著下降（P＜ 0.000 1），miR-125a-3p 抑制劑干預(yù)后CD206 水平明顯升高（P＜ 0.000 1）（圖9、圖10）。結(jié)果表明：miR-125a-3p 抑制劑增加了斑塊組織中M2 巨噬細(xì)胞。

圖9 免疫熒光檢測各組M2 標(biāo)志物CD206 表達(dá)水平Fig.9 The expression level of M2 marker CD206 was detected by immunofluorescence

圖10 M2 標(biāo)志物CD206 免疫熒光染色（×200）Fig.10 M2 marker CD206 immunofluorescence staining（×200）

3 討論

AS 是一種慢性炎癥性疾病，嚴(yán)重威脅人體健康。研究表明，不穩(wěn)定AS 斑塊容易導(dǎo)致不良心血管事件的發(fā)生[13-14]。巨噬細(xì)胞是AS 病變中主要的免疫細(xì)胞，在AS 整個病理生理過程中都發(fā)揮著重要作用[5]。在動脈粥樣硬化中，當(dāng)循環(huán)中的單核細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)膜后，單核細(xì)胞會分化為巨噬細(xì)胞[15]。巨噬細(xì)胞和單細(xì)胞暴露在炎癥細(xì)胞因子、氧化脂質(zhì)、膽固醇晶體和其他因素中。所有這些刺激不僅誘導(dǎo)特定的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，而且還廣泛相互作用，導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄[7]?；诓煌募せ罘绞?，巨噬細(xì)胞主要分為兩種表型，即經(jīng)典激活的M1 和替代激活的M2 巨噬細(xì)胞[2-3]。M1 巨噬細(xì)胞能夠開始并維持炎癥反應(yīng)，分泌促炎細(xì)胞因子，激活內(nèi)皮細(xì)胞，并誘導(dǎo)其他免疫細(xì)胞募集到發(fā)炎組織中;另一方面，M2巨噬細(xì)胞促進(jìn)炎癥的消退，吞噬糖凋亡細(xì)胞，驅(qū)動膠原蛋白沉積，協(xié)調(diào)組織完整性，釋放抗炎介質(zhì)，主要參與組織修復(fù)，具有吞噬、促血管生成和促纖維化能力。M1 巨噬細(xì)胞在促進(jìn)斑塊不穩(wěn)定方面發(fā)揮了重要作用，而M2 巨噬細(xì)胞則維持斑塊的穩(wěn)定，提示斑塊的不穩(wěn)定可能是M1 和M2亞型之間失衡的結(jié)果[6,16]。

miRNA 是一種小型、進(jìn)化保守的非編碼RNA，長度為18～25 個核苷酸，在基因調(diào)控中具有重要作用，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)[17-18]。miRNA 可以抑制數(shù)千個目標(biāo)基因并協(xié)調(diào)正常過程，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡[19]。同時(shí)，miRNA 對巨噬細(xì)胞的激活起到重要調(diào)節(jié)作用[7]，例如Lin-Li Lv 等的研究表明[20]，外體miR-19b-3p 調(diào)節(jié)的TEC 和巨噬細(xì)胞之間的通路，導(dǎo)致M1 巨噬細(xì)胞激活。由于M1 巨噬細(xì)胞加劇斑塊的不穩(wěn)定，因此，筆者可以推測miRNA 對不穩(wěn)定斑塊的發(fā)生起到了一定的作用。筆者的研究[12]也提示miR-125a-3p 在動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定及破裂中起著重要的作用。

VEGF 是一種有效的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和血管生成誘導(dǎo)因子，對血管的完整性和血管功能具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF 在不穩(wěn)定斑塊中發(fā)揮著重要作用，能在一定程度上加速動脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展和不穩(wěn)定性。其機(jī)制可能是VEGF 增加血管通透性，引起紅細(xì)胞外滲，進(jìn)而導(dǎo)致斑塊內(nèi)出血，加速動脈粥樣硬化[21]。基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）屬于MMP 家族，并已被廣泛研究。隨著MMP-9 活性的增加，MMP-9 可導(dǎo)致纖維帽變薄，從而導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定[22]。

本研究結(jié)果顯示，抑制miR-125a-3p 可使動脈粥樣硬化斑塊病變區(qū)域面積減少，斑塊組織中M1 巨噬細(xì)胞、MMP-9，VEGF 表達(dá)減少，M2 巨噬細(xì)胞增加。提示miR-125a-3p 抑制可以減輕動脈粥樣硬化斑塊形成，平衡M1/M2 巨噬細(xì)胞，減少M(fèi)MP-9，VEGF 表達(dá)，促進(jìn)斑塊穩(wěn)定，miR-125a-3p 可能是治療不穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊的新靶點(diǎn)。