袁 偉 ，孟明耀 ，李欣欣 ，熊晶晶 ，李 檬 ，曹 佳 ，劉 梅 ，侯宗柳 ，黃永坤

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，云南 昆明 650032;2）云南省腫瘤免疫防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650051;3）昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院，云南 昆明 650051;4）云南省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650032）

干細(xì)胞移植是將干細(xì)胞處理后重新輸入體內(nèi)，以達(dá)到治療疾病的一種新型生物療法，在當(dāng)前的再生醫(yī)學(xué)時(shí)代，表現(xiàn)出廣闊的前景。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因具有天然的免疫抑制功能、強(qiáng)大的旁分泌功能及可向損傷組織遷移等特性[1]，被視為一種較好的組織工程細(xì)胞和基因載體細(xì)胞。與其他來源的MSCs 不同，hUC-MSCs 來源于產(chǎn)婦分娩時(shí)的臍帶，來源途徑十分廣泛，且排斥性低、獲取手段簡便，具有增殖率和克隆率高、體外細(xì)胞培養(yǎng)容易開展等生物學(xué)特性[2]，可作為干細(xì)胞移植理想的種子細(xì)胞。隨著hUC-MSCs 在臨床治療中的廣泛應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)其增殖是影響臨床療效的重要生理因素，目前國內(nèi)外學(xué)界對MSCs 的研究熱點(diǎn)集中在激素[3]、離子[4]、年齡[5]等對其增殖的影響，然而干細(xì)胞移植部位周圍的特殊炎性微環(huán)境才是影響其增殖的關(guān)鍵因素。

研究表明：LPS 會參與肝衰竭及各種并發(fā)癥發(fā)生和發(fā)展的整個(gè)過程[6]；在炎癥性腸病患者的腸上皮病變部位，LPS 濃度升高[7]；感染性骨不連骨折或骨缺損，其骨斷端周圍組織可檢測出一定量的LPS[8]，所以，利用hUC-MSCs 治療疾病，過程中都將不可避免使hUC-MSCs 處于LPS 炎性微環(huán)境當(dāng)中，與其發(fā)生接觸，并影響其增殖。本研究通過探究最佳量效和時(shí)效的LPS 對hUCMSCs 增殖的影響，提供實(shí)驗(yàn)有效性依據(jù)，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供干細(xì)胞研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料試劑與儀器

α-MEM 干細(xì)胞培養(yǎng)液（由昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供），胰酶、胎牛血清FBS、磷酸鹽緩沖液PBS（BI 公司），LPS（中國食品藥品檢定研究院中檢所），96 孔板（無錫耐思生物科技有限公司），CCK-8 試劑盒（日本同仁，批號：2H779），細(xì)胞周期檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo 公司），倒置顯微鏡（奧特光學(xué)，BDS200 ），離心機(jī)（Eppendorf公司），酶標(biāo)儀（Thermo 公司），流式細(xì)胞儀（貝克曼庫爾特有限公司）。

1.2 主要方法

1.2.1 hUC-MSCs 的體外培養(yǎng)及傳代本實(shí)驗(yàn)使用的hUC-MSCs 提取自昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室干細(xì)胞庫。在T75 的培養(yǎng)瓶中以1×106個(gè)/mL 的密度接種含10%FBS 的α-MEM干細(xì)胞，并放入37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)，棄上清，洗滌，胰酶消化，當(dāng)細(xì)胞由長梭形轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形時(shí)，棄胰酶，重懸后用臺盼藍(lán)稀釋計(jì)數(shù)并繼續(xù)在T75 的培養(yǎng)瓶中以上述密度及條件培養(yǎng)。用倒置顯微鏡觀察到細(xì)胞24 h 內(nèi)貼壁生長，呈長梭形，形態(tài)均一，當(dāng)細(xì)胞融合程度達(dá)到約80%，排列成漩渦狀、放射狀、網(wǎng)格狀時(shí)，培養(yǎng)成功。

1.2.2 LPS 的量效和時(shí)效對hUC-MSCs 增殖的影響選擇第四代對數(shù)生長期細(xì)胞，常規(guī)洗滌消化后調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×104個(gè)/mL，后接種于96 孔板，1 500 個(gè)/孔。在接種24h后更換為含LPS 終濃度為0.098、0.195、0.390、0.780、1.560、3.12、6.250、12.500、25.000 和50.000 EU/mL 的培養(yǎng)液。設(shè)不含LPS 的完全培養(yǎng)基為對照組，不含細(xì)胞及LPS 的完全培養(yǎng)基為空白組。分別于LPS 作用24h、48h、72 h 后更換培養(yǎng)液，加入每孔培養(yǎng)基總體積10% 的CCK-8 溶液，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中避光孵育1.5 h，用自動酶標(biāo)檢測儀在450 nm 的波長處測定吸光度（A 值）。

1.2.3 LPS 對hUC-MSCs 細(xì)胞周期的影響根據(jù)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇促進(jìn)hUC-MSCs 增殖的低濃度（0.098 EU/mL，實(shí)驗(yàn)組1）、中濃度（1.56 EU/mL，實(shí)驗(yàn)組2）和高濃度（25 EU/mL，實(shí)驗(yàn)組3）LPS、作用時(shí)間72 h 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取第四代對數(shù)生長期細(xì)胞，以0.5×106個(gè)/mL 密度接種于10 cm培養(yǎng)皿，細(xì)胞接種24 h 后分別更換為含LPS 濃度0.098 EU/mL、1.56 EU/mL、25 EU/mL 的條件培養(yǎng)基，以不含LPS 的完全培養(yǎng)基作為對照組。作用72 h 進(jìn)行細(xì)胞周期檢測：常規(guī)洗滌、消化后調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，加入1 mL 細(xì)胞懸液至離心管內(nèi)離心，棄上清；用70% 乙醇4 ℃進(jìn)行細(xì)胞固定20 h，離心，棄上清后轉(zhuǎn)移至流式管再次離心棄上清；在待檢測樣品中加入0.5 mL配置好的碘化丙啶染色液，37 ℃避光溫浴30 min；用流式細(xì)胞儀在激光波長488 nm 波長處檢測紅色熒光，采用Modfit 軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA 含量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS22.0 軟件和GraphPadPrism5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的連續(xù)變量以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2組之間的比較采用方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 LPS 的量效和時(shí)效對hUC-MSCs 增殖的影響

LPS 對hUC-MSCs 增殖的影響與LPS 的濃度及其作用時(shí)間均有關(guān)系，見表1 和圖1A；不同條件下細(xì)胞增殖率見表2。在LPS 作用24 h 時(shí)（圖1B），主要表現(xiàn)為抑制hUC-MSCs 的增殖，在濃度為0.78 EU/mL 時(shí)抑制作用最明顯，隨LPS 濃度降低或增高，其抑制作用均有減弱的趨勢。作用48 h 時(shí)（圖1C），抑制作用普遍減弱，高濃度組顯示對細(xì)胞增殖無影響。作用72 h 時(shí)（圖1D），LPS 表現(xiàn)出促進(jìn)細(xì)胞增殖的趨勢，且低濃度區(qū)域促進(jìn)作用最顯著，濃度增加其促增殖作用相對減弱。最高濃度組（50 EU/mL）在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)對細(xì)胞增殖均無顯著影響。

表2 LPS 不同濃度及不同作用時(shí)間hUC-MSCs 增殖率（%）Tab.2 Proliferation rates of hUC-MSCs at different dose-response and time-dependent of LPS（%）

圖1 不同濃度及不同作用時(shí)間的內(nèi)毒素對hUC-MSCs 增殖的影響Fig.1 Effects of endotoxin with different concentrations and different time on the proliferation of hUC-MSCs

表1 LPS 不同濃度及不同作用時(shí)間hUC-MSCs 吸光度（A）值（）Tab.1 Absorbance（A）of hUC-MSCs at different dose-response and time-dependent of LPS（）

表1 LPS 不同濃度及不同作用時(shí)間hUC-MSCs 吸光度（A）值（）Tab.1 Absorbance（A）of hUC-MSCs at different dose-response and time-dependent of LPS（）

注：實(shí)驗(yàn)組1至10LPS終濃度依次為：0.098、0.195、0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50 EU/mL，表示分別在24 h、48 h、72 h時(shí)，與對照組相比，*P ＜ 0.05。

2.2 LPS 對hUC-MSCs 細(xì)胞周期的影響

與對照組相比，當(dāng)作用時(shí)間為72 h 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組1 G0/G1 期的占比降低，S 期占比增高，G2/M期占比增高，實(shí)驗(yàn)組2 和實(shí)驗(yàn)組3 G0/G1 期的占比降低，S 期占比增高，G2/M 期占比與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3、圖2、圖3）。

圖2 LPS 刺激后流式細(xì)胞技術(shù)檢測hUC-MSCs 細(xì)胞周期代表圖例Fig.2 Cell cycle of hUC-MSCs tested by flow cytometry after LPS stimulation

圖3 不同濃度LPS 作用72 h 時(shí)hUC-MSCs 細(xì)胞周期比例Fig.3 Proportion of hUC-MSCs cell cycle after 72 h of LPS with different concentrations

表3 LPS 對hUC-MSCs 細(xì)胞周期的影響（%）Tab.3 Effect of LPS on huc-Mscs cell cycle（%）

3 討論

LPS 是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的一種成分，在菌體裂解后得以釋放，是菌體中存在的毒性物質(zhì)的總稱。LPS 與許多慢性疾病的病理生理學(xué)有關(guān)，是其發(fā)病的重要原因，包括胃腸道疾病如腸易激綜合征[9]，心血管疾病如冠心病[10]，中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病如帕金森病[11]等。在利用hUCMSCs 進(jìn)行干細(xì)胞移植治療疾病時(shí)，過程中都將不可避免接觸LPS，并影響其增殖。

hUC-MSCs 的增殖是影響干細(xì)胞移植臨床療效的重要生理因素，對于LPS 對hUC-MSCs 增殖的影響，本研究通過CCK-8 增殖實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行探討。首先CCK-8 檢測結(jié)果提示，LPS 的量效和時(shí)效對hUC-MSCs 的增殖表現(xiàn)出不同的效應(yīng)，僅當(dāng)作用時(shí)間為72 h，才表現(xiàn)出增殖效應(yīng)，且低濃度區(qū)域促進(jìn)作用更顯著，濃度增加其促增殖作用相對減弱，當(dāng)作用時(shí)間為24、48 h，表現(xiàn)為抑制hUC-MSCs 增殖。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。細(xì)胞周期包括G0 期（休眠期），G1 期（DNA 合成前期），S 期（DNA 合成期）以及G2 期（DNA 合成后期），分裂期又稱為M 期。根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，低濃度LPS 處理72 h 后細(xì)胞周期的G0/G1 期占比降低，S 期占比增高，G2/M 期占比增高，提示促進(jìn)hUCMSCs 增殖。

以上兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示低濃度LPS 且作用時(shí)間長時(shí)可促進(jìn)hUC-MSCs 增殖，這可用預(yù)處理對細(xì)胞的保護(hù)作用解釋，對此，侯玉森等[12]得到了相同的結(jié)論，低濃度LPS 預(yù)處理可促進(jìn)hUCMSCs 增殖，提高細(xì)胞LPS 耐受性。目前已有大量不同學(xué)科及領(lǐng)域的研究證實(shí)預(yù)處理可減輕臟器損傷、減少細(xì)胞凋亡，起到良好的保護(hù)作用[13-16]。LPS 預(yù)處理對心[17]、肝[18]、腦[19]缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，而缺氧[20]、炎癥因子[21]、紅細(xì)胞生成素[22]、川芎嗪[23]預(yù)處理可促進(jìn)MSCs 增殖。

綜上所述，hUC-MSCs 的增殖與LPS 的量效和時(shí)效均有關(guān)系，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用hUCMSCs 進(jìn)行干細(xì)胞移植治療疾病時(shí)，可根據(jù)這一特性提前用低濃度LPS 預(yù)處理hUC-MSCs，這樣可增加細(xì)胞增殖率，減少凋亡，為干細(xì)胞移植應(yīng)用于臨床提供新思路。