吳希蘭 ，沈紅 ，石素勝 ，張智慧 ，郭蕾 ，王芳

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系，云南 昆明 650500;2）清華大學(xué)附屬垂楊柳醫(yī)院病理科，北京 100022;3）昭通市第一人民醫(yī)院病理科，云南 昭通 657000;4）北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科，北京 100021）

據(jù)Rebecca 等[1]報(bào)告惡性黑色素瘤（malignant melanoma，MM）新發(fā)病率持續(xù)攀升，發(fā)病人數(shù)每年以3%～5%的速度增長(zhǎng)。中國(guó)雖屬于惡黑低發(fā)地區(qū)，但發(fā)病率也在不斷上升，每年新發(fā)惡黑患者超過(guò)8 000，約百萬(wàn)分之八，而在我國(guó)，惡黑患者的5 a 生存率僅為65%。

由于早期病變不明顯，造成多數(shù)患者就診時(shí)已錯(cuò)失手術(shù)最佳時(shí)機(jī)，部分患者甚至已發(fā)生局部組織侵襲或轉(zhuǎn)移，晚期或手術(shù)無(wú)法切除的MM 患者生存率低。鑒于晚期MM 的5 a 生存率低，缺乏較為有效的治療方法，故分析MM 的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、了解有效的早期診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)，以幫助患者選擇有效的診斷和治療方法、延長(zhǎng)MM患者生存時(shí)間，具有較重要的臨床意義。

本文在高通量組織芯片技術(shù)基礎(chǔ)上利用免疫組化方法觀察程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）、BRAFV600E、CD68 在MM組織中的表達(dá)情況，分析其與患者病理臨床特征及在預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值，同時(shí)光鏡下觀察腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）百分比，分析其與臨床病理各參數(shù)的關(guān)系，希望從中篩選出影響預(yù)后的因素，為臨床醫(yī)生正確估計(jì)患者的預(yù)后以及延長(zhǎng)患者生存時(shí)間提供一定的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 樣本來(lái)源收集中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科2007 年1 月至2011 年12 月期間進(jìn)行手術(shù)切除的60例原發(fā)性MM組織樣本（18例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，42例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，術(shù)前均未進(jìn)行放化療）。所有病例的病理切片均由兩位病理學(xué)專家復(fù)閱，按照第七版AJCC 惡性黑色素瘤組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)[2]進(jìn)行分期，診斷意見(jiàn)統(tǒng)一。

所有患者以臨床病例查詢、電話及回院復(fù)查的方式進(jìn)行隨訪，隨訪日期自病理報(bào)告確診日期算起，至2022 年7 月，并嚴(yán)格記錄隨訪情況。共隨訪到35例惡性黑色素瘤患者，失訪25例；隨訪結(jié)局定義為死亡。

1.1.2 主要試劑鼠抗人單克隆抗體PD-L1 購(gòu)自美國(guó)R&D，鼠抗人單克隆抗體BRAFV600E（VE1）和通用型二抗-HRP 購(gòu)自美國(guó)羅氏公司，抗體稀釋液、過(guò)氧化物酶封閉液和Tris-EDTA 緩沖液購(gòu)自美國(guó)Dako 公司，鼠抗人單克隆抗體濃縮型CD68和DAB 顯色液購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，0.01M 磷酸鹽緩沖液、0.01M 檸檬酸鹽緩沖液等購(gòu)自中杉金橋。

1.2 研究方法

1.2.1 組織芯片構(gòu)建光鏡下選擇切片上無(wú)退變、壞死以及不同分化程度的腫瘤區(qū)域進(jìn)行打孔靶位的定位標(biāo)記，每個(gè)病例在受體蠟塊上設(shè)計(jì)2 個(gè)靶位，60例樣本設(shè)計(jì)成4 塊受體蠟塊。

1.2.2 免疫組化染色免疫組化染色步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。PD-L1 蛋白的陽(yáng)性著色定位于胞膜/胞質(zhì)，BRAFV600E陽(yáng)性著色主要定位于胞質(zhì)，呈淡黃色～棕黃色的細(xì)/粗顆粒。采用半定量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[3]：以棕黃色顆粒清晰著色于胞膜/胞質(zhì)為陽(yáng)性，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞≤5%為0 分，6%～25% 為1 分，26%～50% 為2 分，51%～75%為3 分，＞ 75%為4 分；根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色為0 分，淡黃色為1 分，黃色為2 分，棕黃色為3 分。將兩項(xiàng)積分相乘形成最終的評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0 分為陰性（-），1～4 分為弱陽(yáng)性（+），5～8 分為陽(yáng)性（++），9～12 分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

CD68 蛋白表達(dá)定位于胞質(zhì)。在高倍視野下選擇染色均勻的區(qū)域，計(jì)數(shù)5 個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比[4]：未著色為0 分，≤25%為1 分，26%～50%為2 分，＞ 50%為3 分。著色強(qiáng)度判定：無(wú)著色為0 分，淺棕色為1 分，棕色為2 分，深棕色為3 分。上述2 項(xiàng)相加為最終判定標(biāo)準(zhǔn)，陰性：＜ 2 分；陽(yáng)性：≥2 分。

1.2.3 TIL 百分比統(tǒng)計(jì)高倍鏡下TIL≥50 個(gè)淋巴細(xì)胞/100 腫瘤細(xì)胞，為大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；TIL ＜ 50 個(gè)淋巴細(xì)胞/100 腫瘤細(xì)胞，為小量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件包，各蛋白表達(dá)和TIL 與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和潰瘍形成的關(guān)系采用等級(jí)相關(guān)分析，各蛋白表達(dá)和TIL與腫瘤大小和腫瘤浸潤(rùn)深度的關(guān)系采用秩和檢驗(yàn)中的Mann-Whitney 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；生存分析使用Cox 回歸模型。

2 結(jié)果

2.1 病例資料

60例原發(fā)性惡性黑色素瘤患者男31例，女29例；年齡19歲～80歲，中位年齡56歲，發(fā)病高峰年齡50～65歲，≤50歲19例，＞ 50 歲41例。18例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)數(shù)目不等；就診時(shí)病變部位出現(xiàn)潰瘍/和壞死者26例；皮膚的惡性黑色素瘤以肢端型黑色素瘤最多見(jiàn)（22/32例），軀干7例，其它部位3例；黏膜的惡性黑色素瘤共28例（消化道10例，頭頸部10例，其它部位8例）；腫瘤浸潤(rùn)深度≤2 惡性黑色素瘤者12例，＞ 2 并≤4 惡性黑色素瘤者8例，浸潤(rùn)深度＞ 4 惡性黑色素瘤者40例；T分期T1 期30例，T2 期6例，T3 期4例，T4 期20例；Clark’s 分期Ⅰ期24例，Ⅱ期19例，Ⅲ期16例，Ⅳ期1例。

2.2 PD-L1、BRAFV600E、CD68 蛋白和TIL 在惡性黑色素瘤中的表達(dá)

PD-L1、BRAFV600E和CD68 免疫組化結(jié)果如圖1～3。TIL 情況如圖4～5。

圖1 惡性黑色素瘤PD-L1 蛋白強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（SP × 200）Fig.1 The strong positive expression of PD-L1 protein in malignant melanoma（SP × 200）

PD-L1、BRAFV600E和CD68 蛋白在原發(fā)性惡性黑色素瘤中陽(yáng)性表達(dá)率分別為43.33%（26/60）、60%（36/60）和6.7%（16/60）。

2.3 生存分析

圖2 惡性黑色素瘤BRAFV600E 蛋白陽(yáng)性表達(dá)（SP × 200）Fig.2 The positive expression of BRAFV600E protein in malignant melanoma（SP × 200）

圖3 惡性黑色素瘤細(xì)胞CD68 蛋白陽(yáng)性表達(dá)（SP × 200）Fig.3 The strong positive expression of CD68 protein in malignant melanoma（SP × 200）

圖4 惡性黑色素瘤組織中少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（HE × 200）Fig.4 A few lymphocytes infiltrated in the malignant melanoma（HE × 200）

納入生存分析的病例數(shù)共35例，生存6例，死亡29例。Cox 回歸分析中可用案例29（占比82.9%），刪失案例6（占比17.1%）；刪除案例中，帶有缺失值的案例、帶有負(fù)時(shí)間的案例、層中最早事件之前刪失的案例均為0例。

將患者生存時(shí)間的影響因素采用Cox 回歸分析，協(xié)變量為患者性別、年齡、臨床分期、腫瘤大小、腫瘤浸潤(rùn)深度、轉(zhuǎn)移與否、潰瘍形成與否、PD-L1、BRAF、CD68 表達(dá)和TIL 多少，采用向前法進(jìn)行變量篩選，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)移是影響惡性黑色素瘤患者預(yù)后的因素。出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，則患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增大，見(jiàn)表1、圖6。

圖5 惡性黑色素瘤組織中大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（HE×200）Fig.5 With extensive lymphocytes infiltrated in the malignant melanoma（HE × 200）

表1 多因素 COX 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型Tab.1 Multivariate COX proportional hazards regression model

圖6 各協(xié)變量的均值水平的生存曲線Fig.6 Survival curves for the mean level of each covariate

3 討論

3.1 PD-L1 蛋白與腫瘤

免疫反應(yīng)中一個(gè)極其重要的協(xié)同刺激分子是B7 家族[5]，而PD-L1（或稱B7-H1）又是B7 家族中的一個(gè)重要成員，也是腫瘤微環(huán)境中的重要成員之一，為PD-1 的相應(yīng)的配體[6]，其表達(dá)于T、B 淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）、內(nèi)皮細(xì)胞、胎盤、心臟、肝臟等。PD-1/PD-L1 對(duì)T 細(xì)胞、DC、NK 細(xì)胞及TIL 均具有不同的調(diào)控作用[7]。PD-L1蛋白在肺癌、MM 等中均有表達(dá)，且通過(guò)高表達(dá)的PD-L1 與PD-1 結(jié)合從而達(dá)到抑制機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)的目的[8-10]。有文獻(xiàn)認(rèn)為PD-L1 是黑色素瘤患者總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期的獨(dú)立預(yù)后因素[11]，有的卻認(rèn)為與總生存期無(wú)關(guān)[12]。這表明PD-L1 蛋白表達(dá)與總生存期、無(wú)進(jìn)展疾病期的關(guān)系還需更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

PD-L1/PD-1 通路在誘導(dǎo)效應(yīng)T 細(xì)胞凋亡、抑制T 細(xì)胞活化、抑制機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)和腫瘤免疫逃逸過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13]，PD-L1 也表達(dá)于部分TIL 表面，通過(guò)結(jié)合其他TIL 表面的PD-1 發(fā)揮作用[14]。因此，PD-L1/PD-1 通路成為引起研究者研發(fā)新一代藥物的靶點(diǎn)。除MM 外，結(jié)直腸癌等都有報(bào)道PD-L1 蛋白表達(dá)與臨床病理各參數(shù)的相關(guān)性[15]，Cathy A Pinto 等[16]的研究認(rèn)為晚期黑色素瘤患者的抗PD-1 治療進(jìn)展不理想，這突出了進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)新藥物和優(yōu)化治療策略的必要性。筆者的研究顯示PD-L1 高表達(dá)的患者見(jiàn)于較晚的T 分期，這也許是因?yàn)镻D-L1/PD-1通路激活抑制了免疫反應(yīng)所引起。因此，PDL1/PD-1 信號(hào)通路激活的被抑制，可能是腫瘤免疫治療的有效方法，有望成為惡性黑色素瘤免疫治療的新手段，但PD-L1 是否可以成為預(yù)后指標(biāo)還有待更進(jìn)一步的研究。

3.2 BRAFV600E 蛋白與腫瘤

BRAF 是絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶，RAF 激酶家族的3 個(gè)主要成員之一，該蛋白由3 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域組成，可激活MAPK 信號(hào)通路。BRAF 的突變類型有V600E、V600K、V600R、V600D 等，但MM 常見(jiàn)的突變是BRAFV600E，即BRAF 蛋白第600 位的纈氨酸被谷氨酸取代，導(dǎo)致BRAF 激酶活性顯著提高，從而激活MAPK 信號(hào)通路，使黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)化成黑素瘤細(xì)胞[17]。非小細(xì)胞肺癌BRAF 突變率約占3%，突變類型中V600E 型占一半左右，這和MM 不同[18]。Feller 等[19]研究發(fā)現(xiàn)免疫組化是檢測(cè)BRAFV600E突變的一種可靠、高度特異性的方法，能作為臨床實(shí)踐中篩選BRAFV600E突變的工具。本實(shí)驗(yàn)中肢端型MM 突變率約68.2%，故對(duì)于皮膚部位的MM 筆者建議行BRAFV600E突變檢測(cè)。

3.3 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)與腫瘤

TIL 是一種異質(zhì)性的淋巴細(xì)胞群體，以T 細(xì)胞為主，存在于腫瘤間質(zhì)內(nèi)，是機(jī)體對(duì)腫瘤的抵抗現(xiàn)象[20]。TIL 中T 細(xì)胞以CD4+、CD8+為主。在光鏡下觀察到，部分腫瘤組織內(nèi)可見(jiàn)到大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，且和腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)。

隨著腫瘤免疫治療的研究，最近幾年，Rosenberg 等[21]通過(guò)回輸前臨床干預(yù)使TIL 回輸治療MM 的有效率高達(dá)70%。

本研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)病例的病理切片中只能見(jiàn)到少量或缺乏TIL，筆者認(rèn)為大多數(shù)惡性黑色素瘤患者對(duì)腫瘤缺乏免疫反應(yīng)。

3.4 CD68 與腫瘤

腫瘤微環(huán)境包括了巨噬細(xì)胞，有研究發(fā)現(xiàn)實(shí)體瘤中有大量的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）浸潤(rùn)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[22]。根據(jù)巨噬細(xì)胞不同的功能特性，通常分2 型：（1）經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞（M1 型），主要能分泌促炎因子、趨化因子等參與炎癥反應(yīng)、清除病原體，參與Th1 型免疫應(yīng)答發(fā)揮抑制腫瘤的作用；（2）替代活化的巨噬細(xì)胞（M2 型），有較弱的抗原提呈能力，從而抑制了T 細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。相關(guān)研究資料顯示，腫瘤組織周圍若有明顯的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，發(fā)生腫瘤擴(kuò)散轉(zhuǎn)移的幾率低，預(yù)后也較好；反之亦然[23]。腫瘤間質(zhì)中CD68 陽(yáng)性巨噬細(xì)胞是降低乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立預(yù)后因素，而CD68 蛋白在MM 的表達(dá)研究很少，且結(jié)果不盡相同。

CD68 是巨噬細(xì)胞最可靠的標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在惡性黑色素瘤中CD68 蛋白陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤T 分期間存在差異，提示巨噬細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著一定的潛在作用。由于CD68蛋白既標(biāo)記M1 型也標(biāo)記M2 型，故CD68 蛋白在判定腫瘤浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞作用方面還存在一定的局限性。