彭利君 劉立賓 王靜 方婷婷 蔡龍

在全球范圍內(nèi)，結(jié)核病是導致死亡的主要原因之一，預計2020 年結(jié)核病是位于COVID-19 之后的第二大單一感染源致死原因[1]。獲取優(yōu)質(zhì)的檢測樣本進行靈敏、快速地診斷對結(jié)核病的發(fā)現(xiàn)和后續(xù)治療至關(guān)重要。支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）有助于痰涂片陰性和少痰的結(jié)核病診斷。研究表明，BALF 改善了肺結(jié)核的檢測[2～5]。隨著博奧結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸檢測（TB-DNA）、結(jié)核分枝桿菌RNA 恒溫擴增實時檢測技術(shù)（simultaneous amplification and

testing for Mycobacterium tuberculosis，SAT-TB）、

Xpert MTB/RIF 檢測（Xpert）、涂片、培養(yǎng)等結(jié)核病檢測技術(shù)的廣泛開展，這些方法在BALF 樣本中的診斷價值尚未得到全面評估。涂片、TB-DNA、SAT-TB 和Xpert 可當日獲得檢驗結(jié)果，而培養(yǎng)一般需要2～8 周。在獲得BALF 樣本后，臨床醫(yī)生為提高檢測陽性率，可能對一份樣本進行一種或多種檢測，本次研究以臨床診斷為金標準，通過大樣本量數(shù)據(jù)分析，評估涂片、培養(yǎng)、TB-DNA、SAT-TB、Xpert 檢測在BALF 樣本中的獨立和不同聯(lián)合方式檢測結(jié)核的診斷效能，旨在找到一種合適的方案，準確、快速地診斷臨床疑似的肺結(jié)核。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2016 年7 月至2021 年9 月期間在浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市胸科醫(yī)院住院治療的疑似結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染患者的臨床資料，所有患者使用同一份BALF 樣本且均接受了五項測試（涂片、培養(yǎng)、TB-DNA、SAT-TB 和Xpert），排除了出院時診斷不明確的患者。共收集BALF 標本7 718 份，參照《肺結(jié)核診斷和治療指南》[6]，確診的肺結(jié)核患者4 692 例，確診為其他疾病的非肺結(jié)核患者3 026 例。其中男性4 665 例、女性3 053 例，年齡1～86 歲，平均（46.90±17.80）歲。本次研究經(jīng)浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市胸科醫(yī)院人體研究倫理委員會批準。由于本次研究為回顧性研究，倫理委員會免除了患者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標本采集和處理 所有患者均由臨床醫(yī)生采集新鮮BALF 標本10～20 ml，均分后分別進行涂片、培養(yǎng)、TB-DNA、SAT-TB和Xpert檢測。

1.2.2 涂片 涂片檢查遵守《中國結(jié)核病防治規(guī)劃痰涂片鏡檢質(zhì)量保證手冊》[7]中的操作程序?qū)ALF標本進行抗酸染色涂片檢查。采用抗酸染色試劑（由珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）對每份樣本行三張抗酸染色涂片鏡檢。其中一張涂片鏡檢陽性則為涂片陽性。

1.2.3 培養(yǎng) 按照《結(jié)核病實驗室標準化操作與網(wǎng)絡(luò)建設(shè)》[8]中的操作程序和標準使用Lowenstein-Jensen 固體培養(yǎng)基（由杭州創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）和960 液體培養(yǎng)基（由美國BD 公司生產(chǎn)）對BALF 樣本進行分枝桿菌培養(yǎng)。固體或液體培養(yǎng)陽性并鑒定為MTB為MTB培養(yǎng)陽性，若鑒定為非結(jié)核分枝桿菌（non-tuberculous Mycobacterium，NTM）則視為MTB 培養(yǎng)陰性，固體或液體培養(yǎng)均陰性視為MTB培養(yǎng)陰性。

1.2.4 TB-DNA 檢測 提取BALF 樣本的DNA，使用SLAN-96S 實時熒光定量檢測儀（由上海宏石醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)）進行聚合酶鏈式反應(yīng)，依據(jù)結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒聚合酶鏈式反應(yīng)熒光探針法（由博奧生物有限公司生產(chǎn)）的說明書，在3 h 內(nèi)擴增和檢測結(jié)核特異性IS6110基因和分枝桿菌屬共有基因熱休克蛋白65（heat shock protein 65，HSP65）。若樣本擴增曲線呈S型，且Ct＜40，判定為陽性，否則為陰性。HSP65陽性IS6110 基因陽性為MTB 陽性，HSP65 陽性IS6110 基因陰性為NTM 陽性。HSP65 陰性為MTB 和NTM 均陰性。

1.2.5 SAT-TB 檢測 根據(jù)制造商提供的結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒（由上海仁度生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）說明書操作。用實時熒光定量檢測儀（SLAN-96S）擴增16S rRNA基因，根據(jù)Ct 值判斷結(jié)果：Ct≤35 為陽性；35＜Ct＜40 需重新檢測進行確認；Ct 無數(shù)字或＞40 為陰性。

1.2.6 Xpert MTB/RIF 在1～2 ml 未離心BALF 中加入2 倍體積的處理液混合，渦旋振蕩15～30 s，在室溫放置15 min，取2 ml 處理過的樣本溶液緩慢添加到Xpert 實時熒光PCR 檢測儀反應(yīng)盒（由美國Cepheid 公司生產(chǎn)）中，并放置在檢測模塊中以啟動自動檢測。系統(tǒng)將在2 h內(nèi)自動讀取MTB 檢測結(jié)果與利福平耐藥結(jié)果。實驗結(jié)果MTB 未檢出為陰性，MTB 檢出極低、檢出低、檢出中等和檢出高為陽性。

1.3 評價指標 以臨床診斷為金標準，計算各項檢測方法的靈敏度、特異度、陽性預測值（positive predictive value，PPV）、陰性預測值（negative predictive value，NPV）、曲線下面積（area under the curve，AUC）。

1.4 統(tǒng)計學方法 利用Python 語言和Pandas 包進行數(shù)據(jù)處理。靈敏度、特異性和PPV、NPV比較采用χ2檢驗，AUC 的比較采用DeLong 檢驗。設(shè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BALF 樣本檢測結(jié)核陽性結(jié)果的維恩圖見封二圖1

圖1 BALF檢測陽性結(jié)果的維恩圖

由封二圖1 可見，涂片、培養(yǎng)、TB-DNA、SATTB、Xpert 檢測在BALF 樣本中均為陽性的有680 例。僅有四種方法同時為陽性時，TB-DNA、Xpert、涂片、培養(yǎng)最多為781 例。僅有三種方法同時為陽性時，TB-DNA、SAT-TB、Xpert最多為335 例。僅有兩種方法同時為陽性時，TB-DNA 和Xpert 最多為292 例。僅有一種方法檢出陽性，最多的是Xpert，可單獨檢出339 例。

2.2 各檢測方法對結(jié)核病的診斷價值見表1

表1 涂片、培養(yǎng)、TB-DNA、SAT-TB、Xpert檢測肺結(jié)核的診斷效能

由表1 可見，五種檢測中，Xpert 的靈敏度及NPV 最優(yōu)，培養(yǎng)的特異度及PPV 最優(yōu)。對各檢測方法的AUC 進行兩兩比較，TB-DNA 的AUC 與SATTB、Xpert、涂片、培養(yǎng)的AUC 比較，差異均有統(tǒng)計學意義（Z分別=12.80、4.57、48.23、18.84，P均＜0.05）。SAT-TB 的AUC 與Xpert、涂片、培養(yǎng)的AUC 比較，差異均有統(tǒng)計學意義（Z分別=15.63、39.96、8.62，P均＜0.05）。Xpert 的AUC 與涂片、培養(yǎng)的AUC 比較，差異均有統(tǒng)計學意義（Z分別=51.64、23.03，P均＜0.05）。涂片的AUC 與培養(yǎng)的AUC 比較，差異有統(tǒng)計學意義（Z=34.91，P＜0.05）。

2.3 各檢測方法對結(jié)核病的聯(lián)合診斷價值 對五種檢測方法進行兩項、三項、四項、五項排列組合，評估聯(lián)合后在BALF中對肺結(jié)核的診斷效能，見表2～4。

表2 兩項聯(lián)合檢測結(jié)核的診斷效能

表3 三項聯(lián)合檢測結(jié)核的診斷效能

表4 四項和五項聯(lián)合檢測結(jié)核的診斷效能

由表2～4 可見，兩項、三項、四項、五項最高的AUC 分別為TB-DNA+Xpert 聯(lián)合、TB-DNA+Xpert+培養(yǎng)聯(lián)合、TB-DNA+SAT-TB+Xpert+培養(yǎng)聯(lián)合、五項聯(lián)合。對以上最優(yōu)的組合方式進行診斷效能比較發(fā)現(xiàn)：兩項聯(lián)合的靈敏度低于三項、四項、五項聯(lián)合（χ2分別=4.05、10.38、13.33，P均＜0.05），三項、四項、五項聯(lián)合之間的靈敏度進行兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2分別=1.47、2.69、0.18，P均＞0.05）；兩項聯(lián)合特異度與三項和四項相比，差異無統(tǒng)計學意義（χ2分別=0.00、0.72，P均＞0.05），三項聯(lián)合的特異度與四項相比，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.72，P＞0.05），五項聯(lián)合的特異度低于兩項、三項、四項（χ2分別=31.10、31.10、22.69，P均＜0.05）；兩項聯(lián)合的PPV 與三項和四項相比，差異無統(tǒng)計學意義（χ2分別=0.03、0.28，P均＞0.05），三項聯(lián)合的PPV與四項相比，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.52，P＞0.05），五項聯(lián)合的PPV 低于兩項、三項、四項（χ2分別=24.69、26.93、20.49，P均＜0.05）；兩項聯(lián)合的NPV 低于四項聯(lián)合（χ2=4.38，P＜0.05），兩項與三項、兩項與五項、三項與四項、三項與五項、四項與五項之間的NPV 之間，差異均無統(tǒng)計學意義（χ2分別=1.82、3.28、0.56、0.22、0.07；P均＞0.05）。兩項聯(lián)合的AUC 低于三項和四項（Z分別=9.63、9.90，P均＜0.05），三項聯(lián)合的AUC 低于四項和五項（Z分別=4.14、3.65，P均＜0.05），五項聯(lián)合的AUC 低于四項（Z=6.97，P＜0.05），兩項聯(lián)合與五項的AUC 之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（Z=1.62，P＞0.05）。

3 討論

痰涂片鏡檢經(jīng)濟、易于操作，但其靈敏度較低，且不能區(qū)分MTB 和NTM 感染。分枝桿菌培養(yǎng)敏感度較高，一直作為結(jié)核病的金標準，但其檢測周期長，不利于肺結(jié)核的快速診斷。TB-DNA 可在數(shù)小時內(nèi)同時檢測MTB 或NTM 感染，防止臨床對肺NTM 和肺結(jié)核的誤診。SAT-TB 是以MTB 特異的16S rRNA 為靶標，可快速準確地檢測存活的結(jié)核分枝桿菌。Xpert檢測可以在2 h內(nèi)同時檢測出結(jié)核病和利福平耐藥情況，優(yōu)勢是操作簡單，結(jié)果可靠，為患者提供及時、有效的治療指導，并協(xié)助限制耐多藥結(jié)核病的傳播，缺點是成本較高。

本次研究通過比較涂片、培養(yǎng)、TB-DNA、SATTB、Xpert 在BALF 樣本中的檢測效能發(fā)現(xiàn)，在單獨診斷BALF 樣本結(jié)核時Xpert 明顯優(yōu)于其他檢測，三種分子診斷方法的診斷效果均高于傳統(tǒng)的培養(yǎng)和涂片。但是考慮到各種方法的優(yōu)缺點和臨床有多種方法同時用于檢測結(jié)核以增加陽性檢出率的需求，對五種檢測進行排列組合后比較診斷效能發(fā)現(xiàn)：兩項聯(lián)合中TB-DNA+Xpert 聯(lián)合最佳、三項聯(lián)合中TB-DNA+Xpert+培養(yǎng)聯(lián)合最佳、四項聯(lián)合中TB-DNA+SAT-TB+Xpert+培養(yǎng)聯(lián)合最佳。理論上聯(lián)合檢測的項目越多，靈敏度越高。但綜合考慮經(jīng)濟、周轉(zhuǎn)時間、指導后續(xù)治療等因素，推薦兩項中的TB-DNA+Xpert 聯(lián)合或四項聯(lián)合中TBDNA+SAT-TB+Xpert+培養(yǎng)聯(lián)合來提高結(jié)核的陽性檢出率。因為TB-DNA+Xpert 聯(lián)合與五項聯(lián)合的AUC 之間差異無統(tǒng)計學意義。TB-DNA+Xpert聯(lián)合可以獲得的收益包括：兩種檢測的靈敏度可達66.94%，略低于五項聯(lián)合的70.44%；當日可出報告，速度快；可以同時鑒別MTB 和NTM 感染；可以獲得利福平耐藥情況。TB-DNA+SAT-TB+Xpert+培養(yǎng)聯(lián)合的靈敏度（70.03%）與五項（70.44%）最佳聯(lián)合相比，差異無統(tǒng)計學意義。TB-DNA+SATTB+Xpert+培養(yǎng)聯(lián)合與TB-DNA+Xpert 聯(lián)合相比增加了培養(yǎng)和結(jié)核RNA 檢測，可以判定體內(nèi)存在活菌且后續(xù)獲得純菌株可進行更多藥敏檢測，彌補Xpert 只包括利福平藥敏的局限性。

值得注意的是，即使使用五項聯(lián)合依然有29.37%的漏診，這可能是由于某些患者根本不排菌，通過實驗室方法無法提供病原學依據(jù)，這個時候醫(yī)生可以選擇免疫學和病理學的檢驗來提高檢測陽性率并參考患者的影像學表現(xiàn)和抗結(jié)核治療反應(yīng)來確診。在BALF 樣本中診斷結(jié)核時，Xpert 明顯優(yōu)于涂片、培養(yǎng)、TB-DNA、SAT-TB；臨床為提高結(jié)核陽性檢出率進行項目聯(lián)合時，推薦使用TBDNA+XPERT 聯(lián)合或TB-DNA+SAT-TB+Xpert+培養(yǎng)聯(lián)合的方案檢測結(jié)核。