張亞杰，徐亞偉，李春美

華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院/環(huán)境食品學教育部重點實驗室，武漢430070

柿隸屬柿科（Ebenaceae）柿屬（Diospyros?.），多為熱帶、亞熱帶植物，原產(chǎn)于我國長江流域及其以南地區(qū)，在我國有2 500 年以上的栽培歷史。柿的種類繁多，根據(jù)甘澀性狀可將其劃分為完全甜柿（pollination content non-astringent，PCNA，簡稱“甜柿”）、不完全甜柿（pollination variant non-astringent，PVNA）、完全澀柿（pollination content astringent，PCA）和不完全澀柿（pollination variant astringent，PVA）類型［1］。后三者合稱“非完全甜柿”（non-PCNA，本文稱“澀柿”）。通常認為，甜柿在樹上能夠完成自然脫澀，而澀柿需要采后進行脫澀處理才可食用。

與其他水果相比，柿含有高出其他水果十多倍甚至幾十倍的單寧，大量研究表明，柿單寧具有抗氧化［2-3］、抑菌［4］、降脂［5］、提高人體免疫力［6］、抗炎［7］、吸附異味等生理活性。根據(jù)其在醇中的溶解度可分為可溶性單寧和不溶性單寧?？扇苄詥螌幏肿淤|(zhì)量較小，通常以游離或者酯化的狀態(tài)存在；不溶性單寧主要為高聚體，分子質(zhì)量較大，可與其他物質(zhì)以結(jié)合狀態(tài)存在［8］，其中可溶性單寧是決定柿果實澀味的主要物質(zhì)。

不同地域環(huán)境、天氣條件都可對柿果中單寧的含量和組成產(chǎn)生影響，目前報道的柿多酚單體主要有沒食子酸（gallic acid，GA）、兒茶素（catehin，C）、表兒茶素（epicatechin，EC）、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素等，但是不同研究報道的柿多酚組成和含量有差異，且鮮少有關(guān)于不同地域及品種柿果中可溶性單寧和不溶性單寧含量的比較研究。本研究以湖北武漢種植的19 個柿品種和陜西楊凌種植的33 個柿品種為試材，對其果實中的可溶性單寧組成及總酚含量、不溶性單寧含量進行測定和對比，同時探究不同地域及品種柿果中不溶性單寧清除DPPH·和羥基自由基的能力，旨在為柿果實的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試柿果來自陜西楊凌種植的33個柿品種和湖北武漢種植的19個柿品種，詳見表1。

表1 柿品種及來源Table 1 Persimmon varieties and source

續(xù)表1 Continued Table 1

1.2 測定方法

柿可溶性單寧單體組成采用?C-10AT 島津高效液相色譜儀測定；可溶性單寧總酚含量及不溶性單寧含量采用Folin-Denis 方法測定；不溶性單寧抗氧化活性以其清除DPPH·自由基能力表示。

1.3 柿可溶性單寧和不溶性單寧提取

柿可溶性單寧的提取參考陳多多［9］的方法并略作修改，取凍干后的柿子粉，采用超聲波輔助提取法，提取溶劑為甲醇，80 ℃冷凝回流3 次，每次30 min，料液比1∶8（m/V）合并濾液，定容備用。將提取完可溶性柿單寧的果渣收集，采用1%鹽酸-甲醇提取不溶性柿單寧，料液比1∶8（m/V），60 ℃回流提取3次，每次30 min，合并濾液，定容備用。

1.4 柿不溶性單寧的純化

取本文“1.3”提取的不溶性單寧濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至一定體積，取濃縮液于AB-8 大孔樹脂上吸附40 min，用蒸餾水洗至無糖檢出（苯酚硫酸法），之后用10%乙醇洗至無色，除去小分子酚酸，然后用95%乙醇洗脫，收集95%乙醇洗脫液，35 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥，即得不溶性單寧。

1.5 柿可溶性單寧單體組成分析

以沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯為標準品，采用?C-10AT 島津高效液相色譜儀檢測可溶性柿單寧提取液的單體組成。

色譜條件：色譜柱為Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A 為0.13%三氟乙酸溶液，B 為含0.1%的三氟乙酸的甲醇/乙腈（1/1，V/V）。梯度洗脫程序：0～10 min，0～20% B；11～20 min，20% B；21～25 min，20%～30% B；26～30 min，30%～70% B；31～38 min，70% B；39～40 min，70%～0 B。柱溫：30 ℃；流速0.8 m?/min，進樣量10 μ?，光電二極管陣列檢測器，檢測波長280 nm。所有樣品進樣前用0.22 μm濾膜過濾。

1.6 柿可溶性單寧總酚含量測定

配制1 mg/m?的沒食子酸溶液，依次稀釋至0.1、0.2、0.25、0.4、0.5 mg/m?，分別吸取100 μ?于具塞試管中，加入500 μ?福林酚溶液，搖勻，5～8 min后加入500 μ?的10% NaCO3溶液，搖勻，室溫下避光放置1 h 后，用蒸餾水定容至5 m?，760 nm 處測定其吸光度。采用相同的方法測定每個品種可溶性單寧提取液的總酚含量。

1.7 柿不溶性單寧含量測定

參考中國藥典方法［10］并略作修改。參考董曉倩［3］的方法制備PT40 單寧為標準品，配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/m?標準品溶液，參考本文“1.6”步驟測定光密度。采用相同的方法測定不同品種柿果中不溶性單寧的含量，760 nm處下測定光密度A1；取對應(yīng)的柿果不溶性單寧提取液3 m?于具塞試管中，加入1.2 g 干酪素，30 ℃水浴，每隔10 min 搖勻1次，吸附60 min，1 000 r/min 離心5 min，取上清液同上步驟測定光密度為A2，同時設(shè)定干酪素對照，測定光密度A3；將A4=A1-A2-A3代入標準曲線中，即得柿果中不溶性單寧的含量。

1.8 柿不溶性單寧清除DPPH·自由基能力的測定

參考田燕［11］的方法測定柿不溶性單寧清除DPPH·能力，選取不同區(qū)域甜柿和澀柿純化后的不溶性單寧，以甲醇為溶劑配制成不同濃度的溶液。在具塞試管中分別加入2 m?樣品和2×10-4mol/?的DPPH·溶液2 m?，混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，517 nm 處測定光密度，空白組以等體積的甲醇代替DPPH·溶液，對照組以等體積的甲醇代替樣品溶液，平行測定3次，清除率=［A0-（Ai-Aj）］/A0×100%，式中，A0為對照組光密度；Ai為樣品組光密度；Aj為空白組光密度。

1.9 柿不溶性單寧清除羥基自由基能力的測定

采用田燕［11］的方法進行，選取不同區(qū)域甜柿和澀柿純化后的不溶性單寧，以甲醇為溶劑配制成不同濃度的溶液。在離心管中依次加入1 m?不同濃度的樣品溶液，8.0 mmol/?硫酸亞鐵，20 mmol/?過氧化氫0.25 m?，3.0 mmol/?水楊酸1.0 m?。將離心管置于37 ℃反應(yīng)30 min，流水冷卻，各管中分別加入0.45 m?蒸餾水，混勻，2 000 r/min 離心10 min，取上清于510 nm 下測定值。清除率=［A0-（A1-A2）］/A0×100%，式中，A0為未加清除劑的光密度；A1為加入清除劑的光密度；A2為試劑空白的光密度。

1.10 數(shù)據(jù)處理及分析

不同樣品測定均為3 次重復(fù)，采用Excel 2019 和GraphPad Prism 8.0.1 進行數(shù)據(jù)處理，試驗結(jié)果以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 柿可溶性單寧總酚含量及單體組成

供試52個品種柿可溶性單寧的總酚含量及組成見表2，總酚主要為沒食子酸（GA）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素（EC）和兒茶素（C）?？偡雍恐袥]食子酸的標準曲線為：Y=1.3192X+0.0517，相關(guān)系數(shù)為0.999 1；可溶性單寧組成中沒食子酸的標準曲線為：Y=1×107X+474.34，相關(guān)系數(shù)為0.999 7；表沒食子兒茶素沒食子酸酯的標準曲線為：Y=6×106X-2088.3，相關(guān)性系數(shù)為0.999 3；表兒茶素的標準曲線為：Y=3×106X-500.24，相關(guān)系數(shù)為0.999 8；兒茶素的標準曲線為：Y=3×106X-367.64，相關(guān)系數(shù)為0.999 6。

表2 柿可溶性單寧的總酚含量及組成Table 2 Total phenolic content and composition of soluble tannins in persimmon

續(xù)表2 Continued Table 2

可溶性單寧中沒食子酸的分布最廣，在已測定的52 個品種中均有檢測到，新秋含量最低，只有（0.188±0.016）mg/100 g，邵安元宵柿含量最高，達（132.947±7.29）mg/100 g。

在甜柿品種中，湖北武漢的小寶蓋柿總酚含量最高，為（2.943±0.136）g/100 g；四方甜柿EC 和C含量最高，分別為（8.356±0.452）mg/100 g 和（21.039±0.497）mg/100 g；小果甜柿EGCG 含量最高，為（2.786±0.250）mg/100 g；陜西楊凌的西村早生的GA 含量最高，為（38.427±1.124）mg/100 g，湖北武漢完全甜柿品種小果甜柿、上西早生、松本早生、四方甜柿、羅田甜、鄂柿1 號、小寶蓋柿可溶性單寧中的總酚含量和組成整體上高于陜西楊凌完全甜柿品種甜寶蓋、前川次郎、新秋、愛知早生可溶性單寧中的含量。在澀柿品種中，湖北武漢的黃邊小雞心總酚和兒茶素（C）含量最高，分別為（9.283±0.328）、（64.389±0.735）mg/100 g，邵安元宵柿GA含量最高，為（132.947±7.29）mg/100 g，金棗柿EGCG 含量最高，為（3.603±0.274）mg/100 g，陜西 的小面糊EC含量最高，為（6.200±0.124）mg/100 g。PVNA 中沒食子酸含量顯著高于其在PCNA 中的含量。近緣種君遷子、金棗柿、油柿、德陽柿，君遷子總酚、EC、EGCG 含量最高，分別為（10.564±0.742）g/100 g、（9.084±1.032）mg/100 g、（4.265±0.484）mg/100 g，德陽柿GA 含量最高，為（32.598±0.854）mg/100 g，金棗柿C 含量最高，為（24.533±0.168）mg/100 g。綜合比較發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)的柿果可溶性單寧含量和組成存在差異。澀柿品種的總酚含量和沒食子酸含量絕大多數(shù)高于甜柿品種，可能因為各品種中EGCG、EC 和C 的含量很少，所以甜柿和澀柿品種相比較無顯著差異；湖北武漢完全甜柿品種中可溶性單寧的總酚含量及組成整體上高于陜西楊凌的完全甜柿品種，澀柿品種整體上無顯著差異。

2.2 柿不溶性單寧含量的測定

以PT40 作為標準品，標準曲線為Y=0.8297X+0.0592，相關(guān)系數(shù)為0.998，如表3 所示，在甜柿品種中，湖北武漢小果甜柿的不溶性單寧含量最高，為（14.281±1.635）g/100 g，松本早生不溶性單寧含量最低，為（2.034±0.075）g/100 g 。引自日本的甜柿品種中不完全甜柿品種（西村早生、禪寺丸）不溶性單寧含量高于完全甜柿新秋、上西早生、松本早生、前川次郎、愛知早生中不溶性單寧的含量。中國本土的完全甜柿品種甜寶蓋、小果甜柿、四方甜柿、鄂柿1號、羅田甜柿、小寶蓋柿中不溶性單寧的含量顯著高于日本完全甜柿中不溶性單寧的含量。湖北武漢完全甜柿不溶性單寧含量整體上高于陜西楊凌完全甜柿。在澀柿品種中，陜西楊凌的富平板柿不溶性單寧含量最高，為（28.224±0.672）g/100 g，大荔七月黃不溶性單寧含量最低，為（2.809±0.143）g/100 g。湖北武漢近緣種德陽柿不溶單寧含量最高，為（49.946±0.546）g/100 g，金棗柿不溶單寧含量最低，為（3.068±0.478）g/100 g。綜合以上數(shù)據(jù)可知，不同地區(qū)的柿果不溶性單寧含量存在差異。甜柿和澀柿品種在不溶性單寧的含量方面不存在顯著差異。湖北武漢的澀柿和完全甜柿（PCNA）中不溶性單寧含量整體上高于陜西楊凌的澀柿和完全甜柿（PCNA）中的含量。

表3 柿不溶性單寧含量Table 3 Content of insoluble tannin in persimmon

續(xù)表3 Continued Table 3

2.3 柿不溶性單寧清除DPPH·自由基的能力

選取陜西楊凌的愛知早生、前川次郎，澀柿粘眼窩甜柿和湖北武漢的羅田甜柿和澀柿磨盤柿，比較不溶性單寧清除DPPH·自由基的能力。從圖1 中可以看出，在5～30 μg/m?的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，5 種不溶性單寧都有清除羥基自由基的能力，且澀柿高于甜柿；湖北武漢的甜柿高于陜西楊凌的甜柿，武漢的澀柿低于陜西楊凌的澀柿。

2.4 柿不溶性單寧清除羥基自由基的能力

選取陜西楊凌的甜柿愛知早生、前川次郎、澀柿粘眼窩，湖北武漢的甜柿羅田甜柿和澀柿磨盤柿，比較不溶性單寧清除羥基自由基的能力。從圖2 中可以看出，在0.2～1.2 mg/m?的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，5 種不溶性單寧都有清除羥基自由基的能力，且澀柿高于甜柿，湖北武漢的甜柿高于陜西楊凌的甜柿，武漢的澀柿低于陜西楊凌的澀柿。

3 討論

本研究結(jié)果表明，不同地域及品種柿中單寧的含量和組成存在差異，可溶性單寧中單體組成主要為沒食子酸（GA）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素（EC）和兒茶素（C），并未檢測出EGC，這與前人的報道［12］有所區(qū)別。有研究發(fā)現(xiàn)在22 個柿品種檢測到的沒食子酸含量存在差異，檢測到的最低含量只有1.75 mg/kg，最高含量可達221 mg/kg［13-14］，還有研究者測定了17 個不同品種柿果種的兒茶素（C）含量，發(fā)現(xiàn)‘磨盤柿’兒茶素（C）含量最高（58.1 mg/kg），‘刀根早生’兒茶素含量最低（1.8 mg/kg）［15-16］。韓振誠等［17］研究了水城磨盤柿和興義磨盤柿中縮合單寧的含量，分別為（27.37±0.05）mg/g 和（17.29±0.04）mg/g，本文測得武漢磨盤柿中不溶性單寧含量為（17.507±0.264）g/100 g，表明不同區(qū)域柿果中不溶性單寧含量存在差異。費學謙等［18］比較了不同品種甜柿和澀柿在成熟過程中單寧組成成分的差異，發(fā)現(xiàn)甜柿在果實發(fā)育早期兒茶素（C）含量很高，澀柿在果實發(fā)育過程中沒食子酸（GA）含量明顯高于甜柿。因此，在成熟過程中甜柿和澀柿品種中可溶性單寧的組成及含量會發(fā)生動態(tài)變化。Chen等［19］利用鹽酸甲醇提取柿總酚，結(jié)果顯示，永濟青柿、禪寺丸和胎里紅總酚含量分別為（11.04±0.12）、（6.74±0.26）和（18.44±0.28）mg/g，而本研究測定永濟青柿、禪寺丸和胎里紅總酚含量分別為（0.816±0.069）、（0.295±0.004）g/100 g 和（5.663±0.202）g/100 g，總酚含量存在差異，可能是因為提取溶劑和柿果實成熟度不同而導(dǎo)致的。但是2 種提取方式都表明完全澀柿的總酚含量高于不完全甜柿的總酚含量。不同地區(qū)氣候、生態(tài)環(huán)境、栽培條件都是影響柿果中多酚類化合物含量的重要因素［20］。湖北武漢柿果與陜西楊凌柿果單寧在含量及組成存在差異，湖北武漢完全甜柿（PCNA）可溶性單寧的總酚含量及組成整體上高于其在陜西楊凌的完全甜柿（PCNA）中的含量，這可能與兩地的氣候及生態(tài)環(huán)境等相關(guān)。An 等［21］等從磨盤柿殘渣中提取柿單寧，發(fā)現(xiàn)不溶性單寧含量最高可達221.8 mg/g。孟明佳等［22］提取河北保定的磨盤柿殘渣，發(fā)現(xiàn)不溶性單寧含量達221.57 mg/g。與本試驗檢測的（17.507±0.264）g/100 g 無明顯差異。由于柿果澀味的產(chǎn)生主要是可溶性單寧，在測定的52種柿果中，發(fā)現(xiàn)澀柿中的總酚和沒食子酸含量高于完全甜柿中的含量。Tessmer 等［23］利用光學顯微鏡（?M）觀察發(fā)現(xiàn)，與甜柿相比，成熟早期澀柿果肉中的可溶性單寧含量更高，且隨著澀柿成熟過程的推進，可溶性單寧的含量會急劇下降。可能因為在柿果發(fā)育的早期階段，與單寧合成相關(guān)的基因（通過類黃酮生物合成途徑）在甜柿和澀柿類型中均高水平表達，在成熟時，甜柿中這些基因的表達會下調(diào)，從而導(dǎo)致單寧積累的終止和澀味的喪失。但澀柿即使在成熟后期也會保持高水平的基因表達，含有高濃度的單寧［24］。還有研究指出，完全甜柿在發(fā)育早期階段就停止了單寧細胞的發(fā)育，由于單寧的含量不會隨著果實的生長而增加，因此其濃度會隨著其他化合物的增加而逐漸降低，即“稀釋效應(yīng)”。其他類型的柿果（不完全甜柿、完全澀柿、不完全澀柿）果實的單寧細胞發(fā)育時間較長，在成熟末期濃度較高［25］。另外，有研究用乙醇處理未成熟的中國完全甜柿，發(fā)現(xiàn)乙醇處理可加速可溶性單寧向不溶性單寧轉(zhuǎn)化，認為柿果脫澀不僅涉及單寧物質(zhì)的“稀釋效應(yīng)”，還可能存在單寧的“凝固”［26］。綜合上述數(shù)據(jù)可知，甜柿因為“稀釋效應(yīng)”，可溶性單寧含量略低；澀柿因為在成熟早期，可溶性單寧含量較高，在成熟后期，可能因為可溶性單寧的“自然凝固”，導(dǎo)致不溶性單寧含量增高，去除了澀味［27］。因此，澀柿和甜柿中不溶性單寧的含量無顯著性差異。

原花青素的抗氧化能力來源于分子中存在的大量酚羥基，其自由基清除能力與酚羥基有關(guān)。柿單寧是由幾種低分子質(zhì)量的化合物通過C—C 鍵連接而成的一類高分子化合物，研究發(fā)現(xiàn)聚合度大的柿單寧級分清除DPPH·和羥基自由基能力更強［11］。柿果中的不溶性單寧主要為高聚體，在體外可表現(xiàn)出顯著的抗氧化能力［28-29］。Yonemori 等［30］報道甜柿中小分子質(zhì)量組分占優(yōu)勢，而澀柿中高分子質(zhì)量組分占優(yōu)勢。Yildiz 等［31］發(fā)現(xiàn)非完全甜柿（non-PCNA）柿果酚類的總抗氧化能力是完全甜柿（PCNA）品種的2.3 倍和1.9 倍。本研究在對甜柿和澀柿中不溶性單寧清除DPPH·和羥基自由基能力的對比中發(fā)現(xiàn)，澀柿抗氧化能力高于甜柿，這可能與其獨特的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，推測可能是澀柿中不溶性單寧的聚合度高于甜柿中的不溶性單寧聚合度。

近年來我國柿總產(chǎn)量和種植面積穩(wěn)居第一，但柿果易腐爛、不耐貯運，給加工利用帶來了不便和限制，造成大量柿果被丟棄。在中國、日本、西班牙和意大利，柿常被加工成果酒和醋［32］，含有大量不溶性單寧的殘留物被浪費，導(dǎo)致環(huán)境安全問題。本研究測定了52個柿品種可溶性單寧組成和含量以及不溶性單寧的含量和抗氧化能力，但柿果在成熟過程中可溶性單寧和不溶性單寧的含量和結(jié)構(gòu)是動態(tài)變化的，關(guān)于不同時期單寧的含量變化及峰值有待進一步研究。