克軍宏，王靜靜，于曉慧，邢安琪，3，彭真奇，4，陳 偉，劉華雷

（1.塔里木大學，新疆阿拉爾 843300；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；3.寧夏大學，寧夏銀川 750021；4.安徽農業(yè)大學，安徽合肥 230036）

禽副黏病毒（avian paramyxovirus，APMV）在分類地位上屬于副黏病毒科禽腮腺炎病毒亞科，主要包括3 個病毒屬，即正禽腮腺炎病毒屬、副禽腮腺炎病毒屬和偏禽腮腺炎病毒屬[1]。目前已鑒定的APMV 至少包括21 種血清型，分別為APMV-1～21。其中，APMV-1、APMV-9、APMV-12、APMV-13、APMV-16～19 和APMV-21 屬于正禽腮腺炎病毒屬，APMV-2、APMV-5～8、APMV-10、APMV-11、APMV-14、APMV-15 和APMV-20 屬于偏禽腮腺炎病毒屬，APMV-3 和APMV-4 屬于副禽腮腺炎病毒屬。APMV 是一種有囊膜的單股負鏈RNA 病毒，基因組長為1.3 萬～1.7 萬核苷酸（nucleotide，nt），可感染多種野鳥和家禽[1]。APMV-1～9 出現于20 世紀80 年代前，2005—2015 年又在多種野鳥和企鵝中陸續(xù)分離到APMV-10～21[2-12]，其中2011 年在日本野鴨中首次分離到APMV-14[8]，至2021 年未見有關分離到APMV-14 毒株的其他報道。目前，我國流行的APMV 主要為APMV-1，即新城疫病毒[13]。近年來，在我國家禽和野鳥中也分離到APMV-2、APMV-4和APMV-6 等毒株[14-16]。2022 年，在我國福建省雞群和江西省鴨群中各分離到1 株APMV-14。為了解我國家禽中APMV-14 分離株的基因組特性，本研究對2 株APMV-14 分離株進行了基因組測序和序列分析，以期為APMV-14 生物學特性等相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒

chicken/Fujian/1013/2022（FJ1013）和duck/Jiangxi/1232/2022（JX1232），均在新城疫監(jiān)測中被分離到，分別分離自福建省和江西省活禽市場采集的臨床健康家禽口咽/泄殖腔拭子樣品，由中國動物衛(wèi)生與流行學中心禽病監(jiān)測室保存。

1.2 病毒繁殖

將病毒液經尿囊腔接種9～11日齡SPF雞胚（購自山東濟南斯帕法斯家禽有限公司），0.2 mL/枚，每個樣品接種5 枚雞胚；接種后37 ℃條件下孵育，18 h 后每12 h 照胚1 次，記錄雞胚死亡情況；收集18 h 后的死胚及96 h 仍存活雞胚，無菌收取雞胚尿囊液，并測定病毒血凝（HA）效價。

1.3 RNA 提取和病毒基因組擴增

利 用High Pure Viral RNA Kit（Roche）提取病毒核酸，立即用于RT-PCR 擴增或置-20 ℃保存?zhèn)溆谩０凑誔rimescript One Step RT-PCR Kit Ver.2（TaKaRa）說明書配置反應體系，分段擴增病毒基因組序列，基因組擴增引物見表1。利用SMARTer RACE 5'/3'試劑盒（Clontech）擴增病毒基因組5'和3'末端。RT-PCR 產物送青島睿博興科生物科技有限公司測序。

表1 APMV-14 基因組擴增引物

1.4 序列分析

利用Lasergene 軟件拼接和編輯基因組序列，分析病毒基因組結構和基因組核苷酸序列同源性，利用MEGA 軟件分析F、HN 蛋白關鍵氨基酸位點。

1.5 遺傳進化分析

從GenBank 中下載APMV-1～21 代表株序列，利用MEGA 軟件進行遺傳進化分析，采用鄰位相連法（neighbor-joining）構建基因組遺傳進化樹，bootstrap 設置為1 000 次重復。

2 結果

2.1 APMV-14 分離株信息

2022 年從我國福建省雞群和江西省鴨群各分離到1 株APMV-14，2 株毒株均可在雞胚中有效復制。病毒相關信息見表2。

表2 APMV-14 分離株基本信息

2.2 基因組序列分析

2 株毒株基因組長度均為15 444 nt，基因組結構均為3'-N-P-M-F-HN-L-5'，遵循“六堿基原則”；分離株3'前導序列和5'尾隨序列長度均分別為55 和277 nt，N、P、M、F和HN基 因5' 非轉錄區(qū)（untranslated region，UTR）均長于3'UTR，L基因3'UTR 長于5'UTR，基因間隔區(qū)（intergenic sequence，IGS）長度為2～36 nt（表3）；各基因起始序列較保守，只有1 個堿基差異，終止序列存在1～3 nt 的差異（表4）。2 株毒株F蛋白長度為541 個氨基酸（amino acid，aa），與日本分離株11OG0352 一致，F 蛋白裂解位點為99REGR ↓L103，具有低致病性禽副黏病毒的典型分子特征；F 蛋白有5 個潛在N-糖基化位點，分別位于73、180、433、457 和483 位；HN 蛋白長度均為607 aa，長于日本分離株11OG0352（580 aa）；HN 蛋白有7 個潛在N-糖基化位點，分別位于119、148、278、346、377、390 和584 位。

表3 APMV-14 分離株基因組長度特征

表4 基因起始序列和基因終止序列

2.3 基因組核苷酸同源性分析

從GenBank 中下載APMV-1～21 代表株各1株（表5），與我國分離的2 株APMV-14 進行基因組核苷酸序列同源性分析。結果（表6、圖1）顯示：我國分離的2 株毒株高度同源（99.5%），與APMV-14 代表株基因組同源性最高（91.0%），與其6 個基因片段同源性為87.7%～92.0%；2 株分離株與APMV-3 同源性最低（45.0%），與其余APMV 的核苷酸同源性為45.3%～52.3%。

圖1 基因組核苷酸序列同源性分析結果

表5 APMV 代表株信息

表6 分離株6 個基因片段與APMV-14 代表株的核苷酸同源性 單位：%

2.4 遺傳進化分析

病毒基因組遺傳進化分析結果顯示，我國分離的2 株毒株與日本分離株（11OG0352）位于同一分支，均屬于APMV-14 型（圖2）。

圖2 基因組遺傳進化樹

3 討論

野鳥被認為是禽流感病毒、新城疫病毒等多種禽病病毒的貯存宿主。近年來，從野鳥中也分離到多種APMV[1，17-18]，其中全球首株APMV-14 毒株分離自日本野鴨糞便樣本[8]。從我國福建省和江西省分離的2 株APMV-14 毒株均來自家禽；但由于缺乏野鳥APMV-14 監(jiān)測數據，暫不清楚我國家禽中APMV-14 的確切來源。目前，全球主要有8 條候鳥遷徙路線，其中3 條從我國經過，分別為東非—西亞遷徙線、中亞—印度遷徙線和東亞—澳大利亞遷徙線，每年從我國過境的候鳥種類和數量約占遷徙候鳥的20%～25%[19]。福建省和江西省具有良好的生態(tài)環(huán)境和豐富的濕地資源，每年冬春季節(jié)都會吸引大量濕地水鳥前來越冬。濕地水鳥的大量遷徙可能會增加其與家禽接觸的機會，進而導致APMV-14 傳播。因此，建議加強養(yǎng)殖場的生物安全管理，避免野鳥與家禽接觸。

APMV-14 為單股負鏈RNA 病毒，基因組由6個基因片段（N、P、M、F、HN、L）組成。本研究中的2 株毒株基因組長度均為15 444 nt，與日本分離株11OG0352 相同[8]。雖然我國分離的2 株毒株與日本APMV-14 分離株（11OG0352）屬于同一進化分支，但基因組核苷酸同源性僅為91.0%，且存在多處氨基酸差異。我國分離的2 株毒株F蛋白裂解位點序列為REGR ↓L，與日本分離株11OG0352 存在1 個氨基酸差異（REGK ↓L）；HN 蛋白長度為607 aa，明顯長于日本分離株（580 aa）[8]。研究[20]顯示，APMV-1 HN 蛋白的長度與病毒毒力相關；而HN 蛋白長度是否會影響病毒的生物學特性，還需進一步研究。

2011 年在日本野鴨糞便樣本中首次分離到APMV-14 后，10 年內未見有分離到APMV-14 毒株的其他報道。2022 年，中國動物衛(wèi)生與流行學中心禽病監(jiān)測室分別于鴨和雞的口咽/泄殖腔拭子樣品中分離到2 株APMV-14 毒株。這2 株毒株雖然宿主來源不同，但基因組核苷酸序列同源性高達99.5%，說明APMV-14 已具備從水禽跨種傳播至陸禽的能力。據推測，在分離到這2 株毒株之前，我國野生水鳥和家禽中可能就已存在APMV-14 流行。因此，今后還需要加強野鳥和家禽的APMV-14 監(jiān)測及其跨種傳播機制研究。