張紅麗，王雅婷，黃 靖，張 璐，董建斐，趙靈燕，徐 輝

（浙江省動物疫病預(yù)防控制中心，浙江杭州 311199）

塞內(nèi)卡病毒（Senecavirus A，SVA）為小RNA病毒科（Picornavirdae）塞內(nèi)卡病毒屬（Senecavirus）唯一成員，最早由美國遺傳治療公司科研人員在人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞系的污染物中被發(fā)現(xiàn)，并分離出SVV-001 原型毒株[1]。早期研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，SVA 對人和動物沒有明顯致病性；但因其具有溶瘤特性，被用于不同類型腫瘤的治療。2007 年，加拿大首次報道了豬群感染SVA[4]。隨后，美國（2012 年）[5]、巴西（2014 年）[6]等國家相繼暴發(fā)豬群SVA 感染疫情，引起原發(fā)性豬水皰病和嚴(yán)重的新生仔豬發(fā)病死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成了較大經(jīng)濟(jì)損失[7-8]。隨后，中國（2015 年）[9]、泰國（2016 年）[10]、越南（2018年）[11]皆有豬SVA 感染的報道。

張志等[12]對我國遼寧、福建等7 個省份進(jìn)行豬SVA 感染回顧性監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，我國SVA 流行可追溯到2016 年，2018 年湖南、云南、新疆、遼寧、福建、湖北、廣西等7 個?。ㄗ灾螀^(qū)）豬群中均有不同程度的SVA 污染。高春柳等[13]2019 年對華東、華中、華北、西北、東北6 個地區(qū)16 個?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）屠宰場臨床健康豬群與養(yǎng)殖場非健康豬群的組織及血清樣品分別進(jìn)行了SVA 病原學(xué)和血清學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)SVA 感染強(qiáng)度雖有所下降，但流行范圍仍然較廣，且存在隱性感染。吉林[14]、海南[15]等省份也在養(yǎng)殖場、屠宰場中檢出SVA 陽性樣品。上述研究提示，我國豬群SVA 感染較為廣泛。為了解SVA 在浙江省豬群中的感染程度和分布規(guī)律，2017—2020 年對全省養(yǎng)殖場、屠宰場、無害化處理場開展了持續(xù)性流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測，以期為SVA 感染防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

1.1.1 血清樣品 2018—2020年，每年5月、10月，采集全省部分豬養(yǎng)殖場、屠宰場血清樣品共5 145份，其中養(yǎng)殖場覆蓋全省東、西、南、北、中5 個區(qū)域，根據(jù)每年區(qū)域內(nèi)養(yǎng)殖量適時調(diào)整。采用分層隨機(jī)抽樣策略，按估計流行率方式抽樣。場群層面，按照年度養(yǎng)殖場數(shù)量，確定需抽樣的養(yǎng)殖場群數(shù)量；個體層面，在每個場群，按存欄量確定需抽樣的個體數(shù)量。按N/n=1.962×p（1-p）/d2計算抽樣場群數(shù)或個體數(shù)。式中：N為場群數(shù)，n為個體抽樣數(shù)，p為預(yù)期流行率（設(shè)為15%），d為可接受誤差（設(shè)為15%）。區(qū)域內(nèi)，按照確定的養(yǎng)殖場數(shù)量，隨機(jī)選擇，屠宰場全部抽樣。場點(diǎn)內(nèi)，根據(jù)計算得出的理論采樣數(shù)量隨機(jī)選擇。2018 年采集83 個養(yǎng)殖場群、17 個屠宰場群的2 402 份豬血清樣品；2019年采自51 個養(yǎng)殖場群、13 個屠宰場群的1 627 份豬血清；2020 年采集60 個養(yǎng)殖場群、19 個屠宰場群的2 486 份豬血清。具體見表1。

表1 不同年份SVA 抗體檢測場點(diǎn)分布及樣品數(shù)量統(tǒng)計

1.1.2 組織樣本 根據(jù)國家和浙江省定點(diǎn)監(jiān)測方案要求，結(jié)合全省養(yǎng)殖場、屠宰場、無害處理場分布特點(diǎn)，在全省11 個地市，共采集屠宰場屠宰豬群淋巴結(jié)混樣1 215 份，養(yǎng)殖場及無害化處理場病死豬病料混樣1 158 份（表2）。其中，2019 年對7 個屠宰場群，2020 年對15 個養(yǎng)殖場群同步采集了血清與淋巴結(jié)樣品。

表2 SVA 核酸檢測場點(diǎn)分布及樣品采集數(shù)量統(tǒng)計

1.2 主要試劑

組織樣品磁珠法RNA/DNA提取試劑（LabServ Viral Total NA Kit），購自賽默飛世爾科技有限公司；SVA 間接ELISA 抗體檢測試劑盒、SVA-FMDV 雙重?zé)晒舛縍T-PCR 檢測試劑盒，購自蘭州獸研生物科技有限公司。

1.3 組織樣品處理

淋巴結(jié)樣品采取混樣方式檢測，同一場群的3～4 份淋巴結(jié)混成1 份，同一頭豬的臟器樣品混成1 份。取適量組織樣品，用手術(shù)剪剪碎，放入帶有研磨珠的研磨管中，加入1 mL PBS，于研磨器上研磨，待勻漿后置于-40 ℃或-80 ℃反復(fù)凍融3 次，8 000 r/min 離心2 min 后，取上清，按照磁珠法病毒RNA/DNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行核酸提取。

1.4 主要儀器設(shè)備

酶標(biāo)儀，Multiskan FC，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；磁珠法核酸提取儀，KingFisher Flex，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；熒光定量PCR 儀，型號7500，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。

1.5 樣品檢測

按照SVA 間接ELISA 抗體檢測試劑盒說明書檢測血清樣品抗體，熒光定量RT-PCR 試劑盒說明書檢測組織樣品核酸。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行卡方處理分析，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清樣品檢測

2.1.1 時間分布 不同年份統(tǒng)計結(jié)果顯示（表3），2018—2020 年SVA 抗體個體陽性率分別為21.86%、9.83%、12.79%，場群抗體陽性率分別為83.00%、56.06%、70.89%。經(jīng)統(tǒng)計分析，場群及個體抗體陽性率波動變化明顯（P＜0.01），2019年顯著下降后，2020 年又有明顯提高。

表3 2018—2020 年血清樣品SVA 抗體檢測結(jié)果時間分布

2.1.2 場點(diǎn)分布 不同場點(diǎn)統(tǒng)計結(jié)果（表4）顯示，屠宰場連續(xù)3 年SVA 抗體個體陽性率均高于養(yǎng)殖場，群體抗體陽性率除2018 年外也高于養(yǎng)殖場。屠宰場群與養(yǎng)殖場群陽性率統(tǒng)計對比結(jié)果（表4）顯示，屠宰場群與養(yǎng)殖場群的個體陽性率差異極顯著（P＜0.01），而群體陽性率無統(tǒng)計學(xué)差異。陽性屠宰場群來源統(tǒng)計結(jié)果（表5）顯示，2018 年71.43% 的陽性群體來源于省外，顯著高于省內(nèi)（P＜0.01），2019—2020 年省內(nèi)來源陽性場群占比升高，顯著高于省外（P＜0.01）。

表4 2018—2020 年不同場點(diǎn)SVA 抗體分布 單位：%

表5 2018—2020 年屠宰場SVA 抗體陽性群體來源分布

2.1.3 區(qū)域分布 不同區(qū)域統(tǒng)計結(jié)果（表6）顯示，2018—2020 年，全省不同區(qū)域的SVA抗體個體陽性率分別為11.08%～27.51%、3.42%～13.89%、8.09%～16.07%，群體陽性率分別為70.37%～90.00%、33.33%～72.73%、60.00%～85.00%。總體來看，除浙東外，其他區(qū)域均呈現(xiàn)2019 年下降、2020 年上升的趨勢。對3 年各區(qū)域的平均個體陽性率及場群陽性率統(tǒng)計比較發(fā)現(xiàn)，浙北、浙南之間的個體陽性率無顯著性差異，但它們顯著高于其他區(qū)域（P＜0.05），提示浙北、浙南SVA 感染較嚴(yán)重。

表6 2018—2020 年SVA 抗體陽性率空間分布 單位：%

2.1.4 陽性場群個體陽性率分布 本次調(diào)查共檢測到176 個抗體陽性場群，包括152 個養(yǎng)殖場群、34 個屠宰場群。養(yǎng)殖場群抗體平均個體陽性率為19.30%，中位數(shù)為13.81%，標(biāo)準(zhǔn)差為19.18%；屠宰場群平均個體陽性率為25.50%，顯著高于養(yǎng)殖場（P＜0.01），中位數(shù)為15.84%，標(biāo)準(zhǔn)差為25.79%。由分析結(jié)果（圖1）可以看出：50%的養(yǎng)殖場陽性群體抗體個體陽性率低于15.00%，75%低于30.00%；50%的屠宰場陽性群體抗體個體陽性率低于16.00%，75%低于35.00%。

圖1 SVA 抗體陽性場群個體陽性率分布

2.2 組織樣品檢測

2.2.1 時間分布 不同年份統(tǒng)計結(jié)果（表7）顯示，2017—2020 年SAV 核酸個體陽性率與群體陽性率呈逐年下降趨勢。統(tǒng)計分析顯示，4 年間個體陽性率與群體陽性率差異均極顯著（P＜0.01）。

表7 2017—2020 年組織樣品SVA 核酸檢測結(jié)果統(tǒng)計

2.2.2 場群分布 將樣品來源分為臨床健康豬群與非健康豬群，其中臨床健康豬群樣品來源于屠宰場，非健康豬群樣品來源養(yǎng)殖場與無害化處理場病死豬。從檢測統(tǒng)計結(jié)果（表8～9）來看，臨床健康豬群的SVA 平均個體陽性率與群體陽性率均顯著高于非健康豬群（P＜0.01）。2017—2020 年，臨床健康豬群核酸個體陽性率和群體陽性率分別為3.32%～23.83%和4.88%～42.86%，非健康豬群分別為0.59%～8.13%和2.63%～13.64%。2019—2020 年22 個屠宰場同一群體來源的血清及組織樣品檢測結(jié)果（表10）顯示，15 個抗體陽性場群中，包含1 個核酸陽性場，占6.7%；7 個抗體場陰性場群中，包含1 個核酸陽性場，占14.3%。

表8 2017—2020 年屠宰場生豬淋巴結(jié)SVA核酸檢測結(jié)果統(tǒng)計

表9 2017—2020 年養(yǎng)殖場與無害化處理場病死豬病料的SVA 核酸檢測結(jié)果統(tǒng)計

表10 2019—2020 年屠宰場同一來源群體SVA 抗體與核酸檢測結(jié)果對比 單位：個

2.2.3 區(qū)域分布 區(qū)域統(tǒng)計結(jié)果（圖2）顯示：2017 年全省5 個區(qū)域均有組織樣品檢出SVA 核酸陽性，其中個體陽性率浙南和浙東較高，分別為27.52%、28.33%，與其他區(qū)域存在顯著差異（P＜0.05），而區(qū)域間的場群陽性率均無顯著性差異。2018—2020 年SVA 核酸陽性只在浙南和浙北被檢出，且這兩個區(qū)域不同年份間的陽性率變化較大，2018 年浙南個體陽性率和場群陽性率顯著高于浙北，而2019 年又顯著低于浙北（P＜0.05），2020 年兩個區(qū)域間又差異不明顯。

圖2 2017—2020 年SVA 病原樣品陽性率及群體陽性率區(qū)域分布

3 討論

本研究對浙江省2017—2020 年SVA 時間與空間分布進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)平均71.84%的群體為SVA 抗體陽性，表明SVA 在浙江省豬群中流行較為廣泛。

抗體檢測結(jié)果顯示：從時間分布看，2018—2020 年SVA 抗體陽性率呈波動狀變化趨勢，2019年抗體個體陽性率與群體陽性率較2018 年顯著下降，2020 年又顯著回升。從區(qū)域分布看，各區(qū)域的抗體陽性率有一定差異，2018—2019 年浙南、浙北抗體陽性率較高，2020 年浙東、浙南較高，但總體看，浙南、浙北較高，需要重點(diǎn)加強(qiáng)對這些地區(qū)的SVA 監(jiān)測。經(jīng)調(diào)查分析，引起區(qū)域間差異的主要原因可能與各區(qū)域的養(yǎng)殖量與調(diào)入量有關(guān)。從場點(diǎn)分布看，2018—2020 年屠宰場平均抗體個體陽性率顯著高于養(yǎng)殖場，這可能與屠宰場樣品來源復(fù)雜有關(guān)，也提示浙江省調(diào)入的生豬存在不同程度的SVA 感染。

核酸檢測情況顯示：時間分布上，2017—2020 年核酸個體陽性率與群體陽性率總體呈顯著下降趨勢。區(qū)域分布上，2017 年浙江省5 個區(qū)域均有陽性檢出，但2018 年后只在浙南、浙北區(qū)域被檢出。場點(diǎn)分布上，來源于屠宰場臨床健康豬群的SAV 核酸檢出率顯著高于來源于養(yǎng)殖場與無害化處理場的病死豬群，表明SVA 感染多表現(xiàn)為隱性感染，這與張志等[12]對我國部分省份豬群的SVA 調(diào)查結(jié)果一致。另外，該結(jié)果也與屠宰豬群包含一定的省外調(diào)入豬群有關(guān)，說明外省份調(diào)入生豬存在SVA 感染，這與全國多個省份報道的SVA分布較廣的結(jié)果相符[12-19]。

比較全省總體SVA 抗體陽性率與病毒核酸陽性率可以發(fā)現(xiàn)，抗體陽性率明顯高于核酸陽性率。同時，抗體陽性場群內(nèi)SVA 感染率較低，75%的陽性養(yǎng)殖場群感染率低于30%，屠宰場陽性群感染率低于35%。這可能與該病毒在健康豬群中代謝周期短，導(dǎo)致發(fā)生隱性一過性感染有關(guān)。15 個屠宰場檢測到SVA 抗體陽性，卻只有1 個場檢測到病毒核酸陽性，也進(jìn)一步說明豬群感染后排毒時間較短。這也與相關(guān)報道[12]的多數(shù)血清陽性樣品中病毒含量較低的結(jié)果相一致。

總體來看，浙江省近幾年SVA 污染范圍有所下降，這可能與非洲豬瘟疫情傳入后，生豬流通監(jiān)管力度加大，豬場規(guī)?；潭忍岣?，豬場和屠宰場更加重視生物安全以及提高消毒頻率等因素有關(guān)。但2020 年感染抗體水平有所回升，說明防控有所松懈，應(yīng)引起重視，仍需持續(xù)監(jiān)測?？紤]到浙江省養(yǎng)豬密度大，流通范圍廣，特別是SVA 傳入我國后，已在美國株的基礎(chǔ)上進(jìn)化出5 個遺傳分支[20]，甚至已重組形成新的重組病毒[21-23]，浙江省需繼續(xù)加強(qiáng)SVA 監(jiān)測，密切關(guān)注其流行特點(diǎn)變化。

4 結(jié)論

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，浙江省豬群的SVA 感染強(qiáng)度有所下降，但污染面仍然較廣，臨床健康豬群中SVA隱性感染較嚴(yán)重，需重視并持續(xù)加強(qiáng)外省調(diào)入豬群及本地養(yǎng)殖豬群的SVA 感染監(jiān)測。