何云鳳，顧宇華，匡華麗，李蘊玉，李佩國

（河北科技師范學院動物科技學院預防獸醫(yī)學重點實驗室，河北秦皇島 066604）

傳染性喉氣管炎（infections laryngotracheitis，ILT）是由雙鏈DNA 皰疹病毒1 型（通常稱為傳染性喉氣管炎病毒，ILTV）引起的家禽急性上呼吸道疾病[1]。ILTV 主要通過呼吸道和消化道感染，患病禽和帶毒禽以及畜舍內被污染的墊料是其主要傳染源。也有報道[2]稱，接種活疫苗的雞可長時間排毒，感染后康復雞可排毒兩年。該病在一年四季都可發(fā)生，但秋冬季節(jié)發(fā)病率更高一些。ILTV可感染不同日齡的禽，青年和成年禽群感染后常呈現急性暴發(fā)，產蛋禽感染后出現產蛋率急劇下降甚至停產現象，雛禽也可感染，但較為少見[3]。該病有很高的發(fā)病率和死亡率，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大威脅。

2021 年12 月，河北省滄州市一養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的510 日齡蛋雞發(fā)生了以雞冠邊緣發(fā)紺、發(fā)出怪音、張口伸脖為主要癥狀的疾病。剖檢可見：氣管有血及血樣分泌物，喉頭有干酪樣假膜，卵泡充血呈紅色，腺胃發(fā)軟，腸黏膜變薄，內容物稀薄，扁桃體輕度出血。本研究以該養(yǎng)殖場病死雞為研究對象，從氣管組織中分離病原，通過PCR 擴增、序列分析確定為ILTV，并分析了分離毒株的遺傳變異情況，以期為河北省ILT 防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

SPF 雞胚，購于北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司；0.22 μm 濾膜，購自密理博中國有限公司；2×EsTaqMaster Mix（Dye），購自康為世紀生物科技有限公司；病毒核酸提取試劑盒，購自北京艾德萊生物科技有限公司；ILTV、禽傳染性支氣管炎病毒（IBV）、新城疫病毒（NDV）、J 型禽白血病病毒（ALV）核酸，由本實驗室保存；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、質粒小提試劑盒，均購自北京天根生化科技有限公司；pMD18-T 載體、DNA 連接酶、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞，均購自寶生物工程（大連）有限公司；第一鏈cDNA 高效合成（逆轉錄）試劑盒，購自亞太恒信生物科技（北京）有限公司。

1.2 樣品來源和處理

樣品為來自河北省滄州市養(yǎng)殖戶送檢的疑似ILTV 感染病雞的氣管組織樣品。將組織樣品用無菌剪刀剪碎后，與無菌PBS 按體積比1:5 混合，用組織勻漿機充分混勻；將勻漿液反復凍融3 次，4 ℃ 12 000 r/min 離心2 min，取上清液，經0.22 μm 濾膜過濾后置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 引物設計

參照文獻[4]合成ILTVgD基因序列，參照文獻[5]合成IBVS1基因序列，參照文獻[6]合成NDVF基因序列，參照文獻[7]合成ALVgp85基因序列。所有引物由上海生物工程有限公司合成（表1）。

表1 PCR 擴增引物序列

1.4 病毒分離

取上述病料勻漿上清液接種9 日齡 SPF 雞胚尿囊腔，每胚0.2 mL；接種等量高壓滅菌的PBS作為陰性對照，置孵化器內孵育；棄去24 h 內死亡雞胚，72 h 后取出雞胚于4 ℃冰箱過夜；收集雞胚絨毛尿囊膜研磨后接種9 日齡SPF 雞胚，連續(xù)盲傳3 代；收獲每代的雞胚絨毛尿囊膜和尿囊液，并觀察雞胚與雞胚絨毛尿囊膜病變情況。

1.5 分離病毒PCR 擴增及序列分析

參照核酸提取試劑盒說明，提取第3 代雞胚絨毛尿囊膜和尿囊液的核酸進行RT-PCR 和 PCR 反應。逆轉錄反應條件：25 ℃ 5 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。以上述提取的DNA 和逆轉錄得到的cDNA 為模板，對ILTV、IBV、NDV、ALV 進行PCR 擴增，取5 μL PCR 產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；將ILTV gD基因擴增產物純化回收后連接 PMD-18T 載體，連接產物轉化DH5α 感受態(tài)細胞；挑取單菌落，接種于含氨芐青霉素（100 μg/mL）的LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜；用質粒小提試劑盒提取質粒，經PCR 檢驗后，將陽性重組質粒送生工生物工程股份公司測序。

1.6 遺傳進化分析

應用DNAMAN 軟件對測序結果進行拼接，以GenBank 數據庫中的ILTV 疫苗株、國內外部分流行株作為參考株，利用MEGA7.0 軟件對分離株和參考株的gD基因核苷酸和推導氨基酸序列進行比對，利用DNAstar 7.1 軟件中的MegAlign 程序進行ILTVgD基因核苷酸同源性分析，并采用Neighbor-Joining 方法構建ILTV 分離株及參考株gD基因系統(tǒng)發(fā)育樹，boot strap 設置為1 000 次重復。參考毒株信息見表2。

表2 參考株信息

1.7 gD 蛋白生物信息學分析

采用SOPMA 在線服務器預測分離株與參考株gD基因編碼蛋白的二級結構，采用YinOYang-1.2、NetNGlyc-1.0 在線服務器分別預測分離株與參考株O-連接和N-連接的糖基化位點。

2 結果

2.1 病毒分離

病料勻漿上清液接種9 日齡雞胚后，初次傳代的雞胚在接種后120 h 內未見死亡，但取出胚體后可見胚體體積小于對照組。收集尿囊液并用濾膜過濾除菌，繼續(xù)接種雞胚，傳至第3 代時，雞胚在接種后48 h 開始出現死亡，打開雞胚氣室可見雞胚絨毛尿囊膜出現痘斑，胚體取出后可觀察到胚體蜷縮，雙爪彎曲呈抱頭樣，死亡胚體表面可見明顯出血點，符合ILTV 致雞胚病變表現，而對照胚體無肉眼可見病變，表明在雞胚尿囊液中成功分離出ILTV。

2.2 病料樣品PCR 檢測

以前述所提第3 代雞胚尿囊液的DNA 和cDNA 為模板，采用IBV、NDV、AIV、ILTV 特異性引物進行PCR 擴增。結果（圖1）顯示，病料樣品中NDV、AIV、IBV 均為陰性，僅ILTV 為陽性，凝膠電泳顯示約1 133 bp 的條帶，表明雞胚尿囊液中存在ILTV，分離得到1 株ILTV，將其命名為Hebei2021 株。

圖1 ILTV 分離株gD 基因PCR 結果

2.3 ILTV gD 基因核苷酸同源性結果分析

應用DNAMAN 軟件對測序結果進行拼接，發(fā)現gD基因分離株核苷酸長度為1 133 bp，編碼377 個氨基酸。應用DNAstar 7.1 軟件中MegAlign程序進行ILTVgD基因同源性分析，發(fā)現分離株與河南、黑龍江、江蘇分離株的gD基因序列同源性為99.0%～99.4%，與國內K317 株弱毒疫苗株（JX458824）同源性為99.4%，與澳大利亞、埃及、韓國參考株同源性為99.4%～99.5%（圖2）。

圖2 ILTV 分離株與參考株核苷酸同源性分析結果

2.4 ILTV gD 基因遺傳進化分析

利用MEGA7.0 軟件構建的遺傳進化樹（圖3）顯示，江蘇分離株單獨在一分支上，河北分離株與其他國內參考株、國內疫苗株以及國外參考株在同一分支上，表明河北分離株與國內疫苗株，河南、黑龍江參考株，以及澳大利亞、韓國、埃及參考株親緣關系近，而與江蘇分離株親緣關系相對較遠。

圖3 ILTV 分離株與參考株gD 基因分子進化樹

2.5 ILTV gD 蛋白氨基酸序列分析

采用MEGA7.0 軟件對河北分離株和國內疫苗株及國內外參考株進行ILTV gD 蛋白氨基酸序列比對。結果（表3）顯示：與疫苗株相比，河北分離株在3、219 aa 兩位點分別發(fā)生了T3A、V219Q突變；與河南、黑龍江、江蘇分離株相比，河北分離株與其分別在3、23 aa，3、208、282、334 aa，3、71、107 aa 等位點處發(fā)生了突變，分別為T3A、H23L，T3A、G208E、Q282R、R334C，T3A、K71E、K107E。

表3 ILTV 分離株、疫苗株、參考株gD 蛋白變異情況

2.6 ILTV gD 蛋白生物信息學分析

分離株與參考株蛋白二級結構均包含α-螺旋、β-轉角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈，且分離株的無規(guī)則卷曲含量占肽鏈的45.89%。α-螺旋、延伸鏈、β-轉角占比分別為35.01%、14.59%、4.51%，部分二級結構預測結果見圖4。分離株和疫苗株gD蛋白均可能有49 個O-連接的糖基化位點（圖5），分離株和參考株均無N-連接的糖基化位點。

圖4 分離株和疫苗株gD 蛋白二級結構預測結果

圖5 分離株和疫苗株O-連接的糖基化位點預測結果

3 討論

本試驗通過雞胚傳代、PCR 擴增、測序分析，成功分離鑒定出1 株ILTV。gD基因具有高度保守性[8]，其編碼的糖蛋白是病毒的主要保護性抗原，能夠誘導機體產生細胞和體液免疫應答，同時也是病毒主要抗原之一，是病毒吸附、穿入、復制所必需的[9]，故本試驗對ILTV 的gD基因序列進行了相關分析。gD基因核苷酸序列同源性分析發(fā)現，河北分離株與疫苗株及國內外參考株的同源性均在99.0%以上；氨基酸序列比對發(fā)現，河北分離株與參考株絕大部分位點的氨基酸序列一致，僅極個別位點發(fā)生了突變，表明分離株的gD基因序列較為保守，遺傳進化較穩(wěn)定。gD 蛋白二級結構預測和糖基化預測發(fā)現，分離株和疫苗株相比并未發(fā)生突變。

通過詢問該養(yǎng)殖場人員得知，該養(yǎng)殖場近半年內未進行ILT 免疫，因此可以認為該分離株為自然感染的野毒株。分離株與弱毒疫苗株的gD基因序列在遺傳進化關系上很接近，因此只要正確合理地進行疫苗免疫，就可以使雞群產生較好的免疫保護力。但是也有文獻[10]報道，疫苗毒引發(fā)埃及養(yǎng)殖場疫情，這也提示存在疫苗毒株毒力返強的風險，因此在未發(fā)生疫情地區(qū)應慎重使用弱毒疫苗免疫，即使是在疫情發(fā)生區(qū)，在接種ILTV 弱毒疫苗后也應采取相應的生物安全防護措施，防止疫苗病毒感染周圍健康雞群。

為了預防ILTV 感染，一定要加強禽群的飼養(yǎng)管理，采用全進全出的養(yǎng)殖模式，禽舍要定期通風換氣，降低飼養(yǎng)密度，降低舍內粉塵和氨氣濃度[4]。早期診斷對于防控ILT 十分重要，應定期觀察禽群的臨床表現，對出現呼吸困難的病禽要立即隔離，并采集病禽的喉頭氣管分泌物送實驗室進行PCR 檢測[11]。由于病禽和康復禽體內可能帶毒，從而成為本病的主要傳染源[12]，所以易感禽群應與康復禽群分開飼養(yǎng)，及時淘汰康復禽群，以減少ILT 發(fā)生和流行所帶來的損失。