諾明達來，甘 露，才思蓋來，鄭會珍，劉 燕，吐熱古麗，呼爾查，3，巴音查汗

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.和靜縣巴倫臺鎮(zhèn)烏拉斯臺村，新疆和靜 831412；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)博士后流動站，新疆烏魯木齊 830052）

焉耆馬是新疆地區(qū)優(yōu)良馬品種之一，是眾多馬品種中的佼佼者。焉耆馬主要分布在新疆的博湖縣、和靜縣、和碩縣和焉耆縣等地，其中在和靜縣數(shù)量最多[1]。焉耆馬善于爬山、涉水，耐高寒、高熱，抗病性強，能夠在各種草場覓食，具有持久耐勞的特性，素有海馬龍駒之稱。

蜱是動物體表吸血的節(jié)肢動物，其傳播病原的危害僅次蚊類，是多種動物和人類疾病的貯藏宿主和傳播媒介。蜱隸屬節(jié)肢動物門蛛形綱蜱螨亞綱寄螨總目蜱目。目前世界上的蜱類有3 科18 屬899 種，其中在我國有2 科10 屬119 種，而在新疆就有2 科9 屬45 種[2]。革蜱屬（Dermacentor）全世界已記錄的有30 余個種和亞種，其中以古北界種類最多，我國記錄的有13 種，僅新疆地區(qū)就有8 種[3]。據(jù)相關(guān)資料[4]記載，全世界約有10%的蜱攜帶病原體，攜帶的病原體包括83 種病毒、32 種原蟲、20 種立克次體、18 種螺旋體、14 種細菌、2 種線蟲、1 種支原體和1 種巴爾通氏體。蜱在動物體表寄生時，以叮咬方式吸血。蜱將螯肢和口下板一同刺入宿主皮膚，造成宿主皮膚充血、水腫，使其不安、疼痛，且引起過敏性皮炎和傷口蛆病等[5]。當(dāng)動物體表有大量蜱寄生時，由于蜱可分泌毒素和吸取大量血液，引起患畜麻痹、貧血和消瘦等，使毛、皮、奶和肉類產(chǎn)品質(zhì)量嚴(yán)重下降，給畜牧業(yè)帶來了嚴(yán)重危害[6]。

本研究從和靜縣及周邊地區(qū)，隨機采集焉耆馬體表及其飼養(yǎng)環(huán)境中的硬蜱，運用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法進行蜱種鑒定，并通過生物信息學(xué)軟件，對采集蜱的COI基因序列進行分析，以期為后期開展地方性蜱種研究與蜱傳疾病防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1×磷酸緩沖液（PBS）、10%氫氧化鈉、瓊脂糖、溴化已錠、載玻片、蓋玻片，均購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；樹脂型TM 基因組DNA 提取試劑盒、蛋白酶K、2×EcoTaqPCR Super Mix，購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；DNA 凝膠回收試劑盒，購自康為世紀(jì)生物工程有限公司；MoticSMZ-16B 體視顯微鏡，購自麥克奧迪事業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 2022 年3—5 月，采集和靜縣自然放牧馬體表寄生和飼養(yǎng)環(huán)境中的蜱830 只，用70%酒精保存，并做好標(biāo)記，帶回實驗室進行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。

1.2.2 玻片制作及形態(tài)學(xué)鑒定 將蜱蟲體按以下步驟制作標(biāo)本[6]：投入沸水中1～2 min，待肢體伸直后將其放入已經(jīng)加溫的10% NaOH 溶液中煮沸數(shù)分鐘（對較大的蟲體，須用昆蟲針在蟲體上刺些小孔，以利蟲體內(nèi)部組織溶出），直至蟲體內(nèi)部的肌肉和內(nèi)臟被溶解排出；至蟲體軟化透明時，將其取出放入清水中洗去堿液，洗時輕輕壓擠蟲體，使內(nèi)容物排凈（或把蟲體置吸水紙上輕輕壓擠，使內(nèi)容物排出后被吸水紙吸附），再置清水中清洗；洗凈后的蟲體依次經(jīng)過30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精以及體積比1:1 的無水酒精二甲苯和純二甲苯各浸泡0.5～1 h（較大蟲體時間取高限），然后用加拿大樹膠封片。參照《新疆蜱類志》[7]和《蜱類學(xué)》[8]的昆蟲分類標(biāo)準(zhǔn)，利用普通光學(xué)顯微鏡對采集到的蜱進行初步鑒定，利用數(shù)碼體視顯微鏡進一步對比其背面、腹面、假頭、假頭基、軀體、盾板、頸溝、側(cè)溝、肢節(jié)IV、氣門板等。

1.2.3 蜱樣處理及DNA 提取 從經(jīng)初步形態(tài)學(xué)鑒定的蜱中隨機挑選3 只，用1×PBS 洗3 次，清洗干凈后蜱放入一次性采血器中，倒入液氮用研缽磨碎，加入200 μL 1×PBS 吹打混勻后加入到EP 管內(nèi)，再加入200 μL GA 液和20 μL 蛋白酶K（proteinese K），放至水浴鍋內(nèi)2～3 h，使其完全溶解，以提高蜱DNA 濃度；隨后，按照樹脂型基因組DNA 提取試劑盒說明書提取其DNA，-20 ℃保存。

1.2.4COI基因引物設(shè)計 參考文獻[9]設(shè)計COI基因引物序列（表1），對5 個采樣點的蜱DNA 進行COI基因PCR 擴增。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)體系：2×EcoTaqPCR Super Mix 6.5 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA 模板1.0 μL，ddH2O 補足至13.0 μL。

表1 引物序列

1.2.5COI基因擴增及克隆 以提取的蜱DNA為模板，對COI基因進行PCR 擴增。PCR 擴增體系 為25.0 μL：TaqMix 12.5 μL、ddH2O 7.5 μL、上游引物2.0 μL、下游引 物2.0 μL、DNA 模板1.0 μL。COI基因 PCR 擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)[10]。PCR 擴增結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳，按照Axy GEN DNA 凝膠回收試劑盒說明書回收目的片段，膠回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接。連接體系為10 μL：pMD19-T 1 μL、PCR 產(chǎn)物4 μL、solution I 5 μL。冰浴30 min 后，加入感受態(tài)細胞50 μL，熱激42 ℃、45 s，冰浴2 min；加入無抗性液體培養(yǎng)基900 μL，搖菌培養(yǎng)1 h；出現(xiàn)絮狀物后，10 000 r/min 離心4 min，棄掉850 μL 上清，將剩余的150 μL 吹打混勻，然后加入到含氨芐青霉素的普通固體培養(yǎng)基上涂布均勻，放入37 ℃恒溫箱，前30 min 正面放置，后倒置過夜；待普通固體培養(yǎng)基上長出單菌落時進行菌液PCR 檢測，將出現(xiàn)陽性條帶的進行保菌，保存至-80 ℃，送上海生工生物科技有限公司測序。

1.3 同源性比較及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

利用Meagalign 與Mega11.0 生物學(xué)軟件中的鄰接法（NJ）進行同源性比較及遺傳進化樹構(gòu)建。分析模型為Tamura 3-parameter，進行1 000 次自主復(fù)制，以確定模型的穩(wěn)定性，最終獲得系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

在采集的830 只蜱中，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，鑒定出421 只邊緣革蜱、306 只草原革蜱、103 只森林革蜱，均屬于革蜱屬，具體見表2。

表2 焉耆馬體表及環(huán)境中采集到的蜱種及數(shù)量 單位：個

2.1.1 初步形態(tài)學(xué)鑒定 邊緣革蜱雄蜱背面（圖1-A）和腹面（圖1-D）：體呈卵圓形，前部漸窄，后部寬圓，假頭基呈卵圓形，寬稍大于長；側(cè)緣幾乎平行，后緣向內(nèi)微彎；基突粗短，長小于基部之寬；須肢粗短，外緣呈弧形凸出，第2 節(jié)略長于第3 節(jié)，后緣有很短的背側(cè)，末端圓鈍。草原革蜱雄蜱背面（圖1-B）和腹面（圖1-E）：體呈卵圓形，假頭基呈矩形，寬略大于長，基突寬短；須肢寬短，外緣呈圓弧形，第2 節(jié)背后緣有細小的短刺。森林革蜱雄蜱背面（圖1-C）和腹面（圖1-F）：假頭基呈矩形，寬稍大于長，兩側(cè)幾乎平行；盾板呈卵圓形，盾窩之后的水平最寬，向前漸窄，向后寬圓；表面琺瑯彩較淡，前半部及中間較多，后半部較少。

圖1 雄蜱外部形態(tài)（20×）

2.1.2 細微形態(tài)學(xué)鑒定 在光學(xué)顯微鏡下，邊緣革蜱、草原革蜱、森林革蜱的假頭基形狀，軀體形狀，盾板表面琺瑯彩的分布頸溝和側(cè)溝，以及肢節(jié)IV、氣門板，都具有一定的區(qū)別，具體見表3。

表3 焉耆馬體表3 種革蜱光學(xué)顯微鏡下的主要鑒定特征

2.2 分子生物學(xué)鑒定

2.2.1COI基因PCR 擴增 PCR 擴增蜱線粒體COI基因片段，經(jīng)12 g/L 瓊脂糖凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)在709 bp 處有目的條帶，條帶大小與預(yù)期片段大小一致（圖2）。

圖2 COI 基因PCR 擴增結(jié)果

2.2.2 同源性比較及遺傳進化樹構(gòu)建 同源性比對結(jié)果（圖3）顯示；測序獲得的邊緣革蜱COI基因序列與選取的參考株同源性為99.2%～99.8%，其中與新疆株（HM193889、HM193890）同源性達99.8%；草原革蜱COI基因序列與選取的參考株同源性為99.8%～100%，其中與新疆株（KF583573）同源性為100%；森林革蜱COI基因序列與選取的參考株同源性為99.3%～99.6%，其中與新疆株（MH079424））同源性為99.6%，與山西株（MK213073）同源性為99.3%。

圖3 同源性比較結(jié)果

構(gòu)建的遺傳進化樹（圖4）顯示：邊緣革蜱COI基因與新疆株（HM193889）位于同一分支上，進化關(guān)系較近，與另一新疆株（HM193890）關(guān)系稍遠；草原革蜱COI基因與新疆株（KF583573）位于同一分支，進化關(guān)系較近；森林革蜱COI基因與新疆株（MH079424）和山西株（MK213073）分屬兩個分支，進化關(guān)系稍遠。以上3 種鑒定的革蜱COI基因與璃眼蜱屬小亞璃眼蜱株的進化關(guān)系較遠。

圖4 COI 基因系統(tǒng)進化樹

3 討論

蜱類研究主要包括：探索蜱類自身功能（生物學(xué)特征、生理學(xué)特征、媒介潛能等），掌握“蜱類-宿主-疾病”關(guān)系（分子生物學(xué)等），以及防治蜱及蜱傳疾?。ɑ瘜W(xué)、免疫學(xué)、物理學(xué)或其他）三個方面，但無論在哪個方面，準(zhǔn)確鑒定蜱種是蜱類研究的先決條件和基礎(chǔ)[11]。

形態(tài)學(xué)鑒定的優(yōu)勢在于，可以很清晰地觀察到蜱的細微結(jié)構(gòu)（假頭基、軀體、盾板、頸溝和側(cè)溝、肢節(jié)IV、氣門板等），耗時較短，對實驗設(shè)備及檢測人員能力要求較低，缺點是準(zhǔn)確性較低，容易混淆。分子生物學(xué)檢測與形態(tài)學(xué)鑒定相比，靈敏度和特異性均顯著提高，缺點是耗時較長，對實驗設(shè)備及檢測人員能力要求較高。硬蜱屬特征明顯，易于區(qū)分，而硬蜱種間存在遺傳變異。隨著人們對生物大分子的深入理解，分子生物學(xué)方法在準(zhǔn)確鑒定物種方面發(fā)揮了重要作用，甚至是推動醫(yī)學(xué)檢驗發(fā)展的重要力量[12]。本研究從和靜縣5 個馬場采集了830 只蜱，通過體式顯微鏡和數(shù)碼光學(xué)顯微鏡初步鑒定出邊緣革蜱、草原革蜱、森林革蜱等3 種硬蜱；通過分子生物學(xué)（PCR 技術(shù)）鑒定，經(jīng)同源性比較發(fā)現(xiàn)，這3 種硬蜱與同種蜱基因序列同源性達99.0%以上。進化分析發(fā)現(xiàn)，本次鑒定的邊緣革蜱、草原革蜱分別與新疆境內(nèi)的同種革蜱聚類為同一分支，但均與國內(nèi)其他地區(qū)的蜱種分處于不同的遺傳進化分支；森林革蜱與新疆境內(nèi)及國內(nèi)其他地區(qū)的森林革蜱處于不同的進化分支。這說明以上3 種蜱中，邊緣革蜱、草原革蜱具有較完整的遺傳進化特征，而森林革蜱遺傳進化特征不夠完整。此數(shù)據(jù)可為地方蜱及蜱媒病防治奠定基礎(chǔ)。