劉梅芬，馬震原，閆若潛，趙雪麗，謝彩華，王 翠，柴 茂，趙美雪，宋 丹，王東方，劉 影，靳 冬，王淑娟

（河南省動物疫病預防控制中心，河南省重大動物疫病監(jiān)測預警及防控重點實驗室，河南鄭州 450008）

我國每年因動物疫病導致禽畜死亡的數(shù)量巨大，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來的經(jīng)濟損失每年超過200 億元[1]。若病死動物未經(jīng)無害化處理而流入市場或污染環(huán)境，將直接威脅養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展和人類身體健康[2]。對病死及病害動物及其相關動物產(chǎn)品進行無害化處理是避免病原擴散及傳播的有效途徑。

無害化處理是用物理、化學等方法處理病死、病害動物及其相關動物產(chǎn)品，消滅其所攜帶的病原體，消除危害的過程[3]。無害化處理方法有焚燒法、化制法、深埋法、高溫法和硫酸分解法等。焚燒法雖能通過氧化反應或熱解反應殺死病原，但存在空氣污染隱患；深埋法如果填埋不當，容易造成水源及土壤污染，且操作成本高，還存在病原溢出及掩埋的病死動物尸體被動物扒出撕咬或人為挖出流入市場的風險[4]；硫酸分解法存在過量硫酸污染水源和土壤的風險；高溫法處理時間較長、成本高，且存在受熱不均、病原體殺滅不徹底的風險。上述方法都存在二次污染環(huán)境的風險和生物安全風險[5]?；品ㄊ侵冈诿荛]的高壓容器內(nèi)，向容器夾層或容器內(nèi)通入高溫飽和蒸汽，在干熱、壓力或蒸汽、壓力的作用下，處理病死、病害動物和相關動物產(chǎn)品的方法。化制法和高溫法均指在封閉容器內(nèi)高溫處理，高溫法為常壓條件下殺滅病原微生物，而化制法為高溫高壓法，具有殺滅效果好、處理效率高、處理能力強等優(yōu)點，處理效果優(yōu)于高溫法。化制法是目前國內(nèi)無害化處理廠使用最為廣泛的無害化處理工藝[6]。

本研究自3 個應用化制法工藝處理病死豬尸體的規(guī)模化豬場，采集無害化處理前及經(jīng)化制法無害化處理后的病死豬尸體樣品，利用實時熒光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）方法，檢測每份樣品中的常見豬病病原核酸，包括非洲豬瘟病毒（ASFV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV2）、豬偽狂犬病毒（PRV）、口蹄疫病毒（FMDV）、豬細小病毒（PPV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）與豬流行性腹瀉病毒（PEDV）等。將病原核酸檢測陽性的樣品分別在BHK21、Vero、PK15 和Marc145 等4 種細胞上進行病毒分離培養(yǎng)并盲傳3 代，利用相應PCR 方法對細胞培養(yǎng)物進行上述病原的核酸檢測，通過病毒分離培養(yǎng)物中病原核酸檢出情況，評估該工藝在實際生產(chǎn)應用中無害化處理病死豬尸體的病毒殺滅效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 選取3 個應用化制法工藝處理病死豬尸體的規(guī)模化豬場（編號A、B、C），其中A、C 場采用干化法，B 場采用濕化法。病死豬尸體處理之前，在每個豬場各采集3 個批次的包含淋巴結(jié)、脾臟、肝臟、腎臟、肺臟、小腸、胎衣等的混合樣品各1 份（分別編號A1～3、B1～3、C1～3），無害化處理后采集對應批次的固體樣品。無害化處理前后各采集樣品9 份。

1.1.2 主要試劑 磁珠法核酸提取試劑盒，購自西安天隆科技有限公司；ASFV（GB/T 18648—2020）、CSFV（GB/T 16551—2020）、PCV2（GB/T 35901—2018）、PRV（GB/T 35911—2018）、FMDV（GB/T 18935—2018）、PRRSV（GB/T 35912—2018）等病原的FQ-PCR 檢測方法所用引物探針，均由上海英駿生物技術有限公司合成，并依據(jù)各自的國家標準自行配制；TGEV、PEDV、PPV 實時熒光PCR檢測試劑盒，購自洛陽萊普生生物科技有限公司；以上病原的陽性對照質(zhì)粒，由河南省動物疫病預防控制中心實驗室提供；DMEM 培養(yǎng)基，購自武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清，購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司；PrimeScript RT Master Mix、ExTaqDNA 聚合酶、dNTPs、酶抑制劑等，均購自寶生物工程（大連）有限公司；M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶等，購自Promega 公司。

1.1.3 主要儀器設備 二級生物安全柜，美國Baker 公司產(chǎn)品；全自動核酸提取儀，西安天隆科技有限公司產(chǎn)品；熒光PCR 儀，美國ABI 公司產(chǎn)品；臺式離心機、CO2培養(yǎng)箱，美國Thermos 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 處理前后樣品病原核酸檢測 利用上述檢測方法和試劑盒檢測無害化處理前后樣品中的ASFV、CSFV、PCV2、PRV、FMDV、PPV、PRRSV、TGEV 和PEDV 等病原核酸。

1.2.2 陽性樣品病毒分離培養(yǎng) 將1.2.1 中病原核酸檢測陽性的樣品，按照常規(guī)病毒分離方法[7]，分別在BHK21、Vero、PK15 和Marc145 等4 種細胞上進行病毒分離培養(yǎng)并盲傳3 代。

1.2.3 病毒分離培養(yǎng)物病原核酸檢測 對每一代病毒分離培養(yǎng)物進行ASFV、CSFV、PCV2、PRV、FMDV、PPV、PRRSV、TGEV 和PEDV 等病原核酸檢測。

2 結(jié)果

2.1 處理前后樣品病原核酸檢測

化制法無害化處理前，A1 和A3 檢出PCV2和PRV 核酸陽性，A2 檢出PCV2 核酸陽性，B1、B2、B3 均檢出PCV2 和PEDV 核酸陽性，C1、C2 均檢出PRV 核酸陽性。化制法無害化處理后，A1 檢出PCV2 和PRV 核酸陽性，A2 和A3 檢出PCV2 核酸陽性，B3 檢出PCV2 核酸陽性，其余均為核酸陰性。

2.2 陽性樣品病毒分離培養(yǎng)

根據(jù)2.1 的結(jié)果，將處理前后的A1、A2、A3、B3 樣品和處理前的B1、B2、C1、C2 共12份樣品分別在BHK21、Vero、PK15 和Marc145 等4 種細胞上進行病毒分離培養(yǎng)并盲傳3 代。結(jié)果顯示，只有處理前的A1、A3、B1、C1 和C2 共5 份樣品可以引起細胞病變，其中處理前A1、A3、C1和C2 引起PK15 細胞病變，B1 引起Vero 細胞病變（圖1、2）。

圖1 樣品在PK15 細胞上的培養(yǎng)結(jié)果

圖2 樣品在Vero 細胞上的培養(yǎng)結(jié)果

2.3 病毒分離培養(yǎng)物病原核酸檢測

將12 份樣品在各細胞上的每一代病毒分離培養(yǎng)物進行病原檢測。結(jié)果（表1）顯示：15 份處理前樣品培養(yǎng)物中檢出病原核酸陽性，其中A1、A3、C1 等3 份樣品的1～3 代培養(yǎng)物均檢出核酸陽性，說明存在活病毒；而經(jīng)化制法無害化處理后樣品的培養(yǎng)物均未檢出核酸陽性，說明未有活病毒。

表1 培養(yǎng)物中病原核酸檢測結(jié)果

3 討論

病死動物存在大量的病原微生物，是多種動物疫病發(fā)生與傳播的重要傳染源之一[8]?？茖W有效處理病死動物，可阻止病原微生物在環(huán)境中的生存、傳播和擴散，避免對環(huán)境的污染和對人的危害，從而維護生態(tài)環(huán)境安全和公共衛(wèi)生安全，對維護國家公共衛(wèi)生和生物安全具有重要意義。

化制法分為干化法和濕化法。干化法主要是將病死畜禽尸體進行破碎后送入高溫高壓的容器中，溫度高于140 ℃，壓力大于0.5 MPa，處理時間大于4 h，經(jīng)加熱烘干后產(chǎn)生的熱蒸汽經(jīng)廢氣處理系統(tǒng)排出，尸體殘渣經(jīng)壓榨系統(tǒng)進行處理；濕化法則需要利用蒸汽進行高溫、高壓處理后對處理物進行初次固液分離，固體物經(jīng)破碎后送入烘干系統(tǒng)，液體則送入油水分離系統(tǒng)進行處理[9]。化制法是現(xiàn)行《病死及病害動物無害化處理技術規(guī)范》中明確的病死及病害動物和相關動物產(chǎn)品的處理方法之一，也是目前國內(nèi)無害化處理廠使用最為廣泛的無害化處理工藝，但其在實際生產(chǎn)環(huán)節(jié)的落實情況未見公開報道，本研究就是針對這一問題開展的。本研究所采集的樣品既有干化法也有濕化法處理前后的病死豬尸體樣品。A 場和C 場采用的是干化法無害化處理，工作條件為140 ℃、0.5 MPa，工作時間5 h；B 場采用的是濕化法無害化處理，工作條件為135 ℃、0.3 MPa，工作時間5 h。

本研究之所以選擇BHK21、Vero、PK15 和Marc145 這4 種細胞，是因為這4 種細胞可以增殖出涵蓋ASFV、CSFV、PCV2、PRV、FMDV、PPV、PRRSV、TGEV 和PEDV 等的常見豬病病原。PRV、FMDV 可在BHK21 細胞上增殖[10-11]，CSFV、PCV2、PPV、TGEV 可在PK15 細胞上增殖[12]，PEDV 可在Vero 細胞上增殖[13]，PRRSV可在Marc145 細胞上增殖[14]。在無害化處理前后樣品的病原核酸檢測結(jié)果中，出現(xiàn)處理前樣品為病原核酸檢測陽性而處理后核酸檢測陰性的情況，是因為在化制法處理前，樣品中存在大量具有生物學活性且能在細胞中傳代的病原，而無害化處理過程中病原被殺死且其核酸被破壞，所以處理后樣品為病原核酸檢測陰性。培養(yǎng)物病原核酸檢測結(jié)果中，一些樣品出現(xiàn)第1 代培養(yǎng)物為核酸檢測陽性，而第2 代和第3 代培養(yǎng)物為核酸檢測陰性，是因為樣品中存在的病原核酸殘留在第1 代培養(yǎng)物中，但其病原已經(jīng)被殺死，不能在細胞上穩(wěn)定增殖，而第2 代和第3 代培養(yǎng)物中的病原核酸被大量稀釋，致使檢測結(jié)果為陰性。

本研究利用FQ-PCR 方法，對化制法處理前后的樣品進行常見豬病病原核酸檢測，將篩選出的病原核酸檢測陽性樣品進行病毒分離培養(yǎng)并盲傳3代后，再對增殖的每一代培養(yǎng)物進行病原核酸檢測，結(jié)果顯示化制法處理前病死豬尸體樣品中存在活病毒可增殖傳代，而化制處理后樣品的細胞培養(yǎng)物中均未發(fā)現(xiàn)活病毒，說明化制法在實際生產(chǎn)應用中能有效殺死病死豬尸體樣品中的活病毒，達到了無害化處理目標。

本研究只進行了常見病毒的無害化處理效果對比，但選取的病毒，既有DNA 病毒也有RNA病毒，因此研究結(jié)果具有一定代表性。本研究未對細菌殺滅效果進行試驗，是因為在樣品采集過程中，樣品會受很多雜菌影響，試驗設計中尚難以排除。