章勝權(quán)，王煦程，葉福生，袁文華

(1.杭州市富陽中醫(yī)骨傷醫(yī)院，浙江 杭州 311400；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053；3.浙江蕭山醫(yī)院，浙江 杭州 311200；4.浙江省中醫(yī)院，浙江 杭州 310006)

絕經(jīng)后女性人群中骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生率較高，并且很多絕經(jīng)后女性有明顯的骨量減少[1]，而絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松性骨折會給患者和家庭造成嚴重負擔。骨質(zhì)疏松癥與中醫(yī)學(xué)中的“骨痿”最為相似[2]。中醫(yī)學(xué)理論認為，該病是由腎精虧虛、骨骼失養(yǎng)、脈絡(luò)不暢、瘀血阻絡(luò)所致，治療當以補腎填精活血為主。依據(jù)上述病機和治則，臨床常選用補腎活血方治療該病[3]。補腎活血方的藥物組成復(fù)雜，目前該方治療PMOP的作用機制尚不完全明確。研究表明，骨質(zhì)疏松癥和脂代謝之間的關(guān)系密切[4-5]。為此，我們進行了此次實驗，擬從脂代謝角度探討補腎活血方治療PMOP的作用機制，現(xiàn)總結(jié)報告如下。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物9周齡SPF級健康雌性C57BL/6J小鼠15只，體質(zhì)量18～20 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2013-0016。實驗方案通過浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準。

1.2 主要試劑補腎活血方藥物組成包括熟地黃9 g、杜仲4 g、炮附片6 g、枸杞子9 g、山萸肉6 g、紅花3 g、山藥6 g、肉桂6 g、桃仁6 g、炙甘草3 g，所有藥物均購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，委托浙江省中醫(yī)院制劑中心提取濃縮；熟地黃、杜仲、炮附片、枸杞子、山萸肉、紅花、山藥、炙甘草以12倍量純凈水回流提取3次，肉桂、桃仁以10倍量60%乙醇浸泡提取3次，將水提物、醇提物充分混合后，濃縮至每毫升含生藥3 g，小鼠用藥量按體表面積折算為等效劑量。4%組織細胞固定液、檸檬酸鈉緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)，蘇木素、硫酸鋁銨、碘酸鈉、甘油、阿利新藍(美國Sigma公司)，PBS磷酸鹽緩沖液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.3 主要設(shè)備VIP 5jr脫水機(日本櫻花公司)，AP280-2包埋機、HM355S石蠟切片機(德國Microm公司)，Zeiss Axio ScopeA1顯微鏡及顯微拍攝系統(tǒng)(德國蔡司公司)，Skyscan117 Micro-CT(比利時布魯克林公司)。

2 方 法

2.1 動物分組及造模將15只小鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和補腎活血方組，每組5只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行造模。按0.009 mg·g-1給小鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉進行麻醉，剔除術(shù)區(qū)毛發(fā)。模型組和補腎活血方組小鼠結(jié)扎兩側(cè)輸卵管后，剪去卵巢；假手術(shù)組小鼠結(jié)扎兩側(cè)輸卵管后剪除卵巢旁部分脂肪組織。術(shù)后將小鼠置于37 ℃環(huán)境中約20 min進行復(fù)溫，具體時間以小鼠恢復(fù)排便或行動為準。

2.2 藥物干預(yù)從造模術(shù)后第2天開始，補腎活血方組使用折合生藥濃度為1.5 g·mL-1的補腎活血方濃縮劑灌胃，每次0.4 mL；假手術(shù)組和模型組小鼠以等量生理鹽水灌胃。3組小鼠均每天灌胃1次，連續(xù)灌胃8周。

2.3 實驗指標檢測藥物干預(yù)結(jié)束后第2天，將所有小鼠腹腔過量注射0.3%戊巴比妥鈉麻醉后脫頸處死，取股骨遠端進行觀察分析。

2.3.1骨組織微結(jié)構(gòu)觀察 采用Micro-CT對小鼠的股骨遠端進行掃描，設(shè)置參數(shù)：管電壓90 kV，管電流450 mA，分辨率9 μm。以股骨遠端骺線距近端50層為起點，計量100層，使用N-Recon軟件進行三維圖像重建，觀察骨組織的微結(jié)構(gòu)變化情況，并通過CT-AN軟件分析股骨骨密度。

2.3.2髓腔中脂肪空泡數(shù)量觀察 將股骨遠端組織置于14%EDTA溶液中脫鈣15 d，脫水后石蠟包埋切片，切片厚度0.5 μm。選取部分切片進行阿爾新藍-蘇木素染色后，在光鏡下觀察各組小鼠股骨髓腔中脂肪空泡數(shù)量。

2.3.3骨組織中脂肪酸結(jié)合蛋白4表達情況檢測 取部分骨組織切片脫蠟復(fù)水后，使用0.01 mol·L-1檸檬酸鈉在60 ℃下浸泡4 h進行抗原修復(fù)。以內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育30 min后，使用10%山羊血清進行封閉。滴加以PBS緩沖液稀釋的脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid-binding protein 4，F(xiàn)ABP4)抗體(FABP4抗體∶PBS緩沖液=1∶300)后于4 ℃過夜。次日復(fù)溫后滴加酶標山羊抗兔IgG聚合物，二氨基聯(lián)苯胺顯色5 min，蘇木素復(fù)染，然后依次經(jīng)過1%鹽酸酒精分化、脫水、透明處理后以中性樹脂封片。顯微鏡下觀察骨組織中FABP4的表達情況，采集圖像后使用Image-Pro Plus 6.0軟件對圖像中FABP4的表達比例進行分析。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS26.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。3組小鼠股骨骨密度、股骨組織中FABP4含量的組間總體比較均采用方差分析，組間兩兩比較均采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結(jié) 果

3.1 一般情況實驗期間小鼠飲食、精神狀況正常，活動規(guī)律，至處死前無小鼠死亡。

3.2 骨組織微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果Micro-CT圖像顯示，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠股骨骨密度明顯降低，骨小梁減少；補腎活血方組小鼠的股骨骨密度和骨小梁數(shù)量與假手術(shù)組相當(圖1)。假手術(shù)組、模型組、補腎活血方組小鼠的股骨骨密度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[(0.033±0.009)g·cm-3，(0.003±0.001)g·cm-3，(0.022±0.009)g·cm-3，F(xiàn)=14.240，P=0.005]；模型組的股骨骨密度低于假手術(shù)組和補腎活血方組(P=0.046，P=0.050)；補腎活血方組和假手術(shù)組的股骨骨密度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.203)。

圖1 3組小鼠股骨遠端Micro-CT圖像

3.3 髓腔中脂肪空泡數(shù)量觀察結(jié)果阿爾新藍-蘇木素染色結(jié)果顯示，模型組髓腔內(nèi)脂肪空泡數(shù)量較假手術(shù)組增加；補腎活血方組髓腔內(nèi)脂肪空泡數(shù)量少于模型組，與假手術(shù)組接近(圖2)。

圖2 3組小鼠股骨遠端組織阿爾新藍-蘇木素染色結(jié)果(×10)

3.4 骨組織中FABP4表達情況檢測結(jié)果假手術(shù)組、模型組、補腎活血方組股骨組織中的FABP4含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[(1.287±0.015)%，(11.897±0.703)%，(0.990±0.162)%，F(xiàn)=800.200，P=0.000]。模型組的FABP4含量高于假手術(shù)組和補腎活血方組(P=0.001；P=0.001)，假手術(shù)組的FABP4含量高于補腎活血方組(P=0.034)。見圖3。

圖3 3組小鼠股骨遠端組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×20)

4 討 論

骨髓脂肪細胞被認為是骨髓微環(huán)境的重要組成部分，由骨髓間充質(zhì)干細胞分化而來[6]。脂質(zhì)是一種與骨質(zhì)疏松關(guān)系密切的生物大分子[7]，骨質(zhì)疏松癥患者的骨髓脂肪組織較健康人群明顯增加[8]。Fazeli等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后女性骨小梁周圍脂肪空泡數(shù)量明顯上升。Muruganandan等[10-11]的研究證實，脂肪細胞與骨細胞的發(fā)育和功能關(guān)系密切，能夠影響骨重塑過程；脂肪細胞分泌的可溶性細胞因子會影響成骨細胞分化以及骨吸收功能。

FABP4作為一種脂肪酸結(jié)合蛋白，是調(diào)節(jié)脂肪酸運輸和脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵因子[12]，能夠調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞向脂肪細胞分化與脂滴形成[13]，在動脈粥樣硬化、乳腺癌、糖尿病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[14-16]。而且，F(xiàn)ABP4也被認為與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生密切相關(guān)[17]。Song等[18]的研究表明，抑制FABP4的表達能夠減少去卵巢小鼠的骨量丟失。

補腎活血方是由經(jīng)典古方右歸飲加減而成，其中熟地黃、枸杞子、山茱萸、山藥可補腎陰，杜仲、附子、肉桂善補腎陽，桃仁、紅花是活血化瘀的經(jīng)典藥物，甘草調(diào)和諸藥。相關(guān)研究表明，補腎活血方能夠通過干預(yù)Wnt/β-catenin信號通路影響成骨細胞分化[19]。Wnt/β-catenin信號通路作為骨質(zhì)疏松癥的經(jīng)典通路，能夠調(diào)節(jié)內(nèi)源性骨形成[20]，而且對Wnt/β-catenin信號通路的干預(yù)也能影響FABP4表達[21]。

本研究的結(jié)果提示，通過調(diào)控FABP4表達，抑制骨髓間充質(zhì)干細胞向脂肪細胞分化，可能是補腎活血方治療PMOP的作用機制之一。