王偉偉，歐志學(xué)，章曉云，李統(tǒng)

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011；2.桂林市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 桂林 541002)

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種常見的關(guān)節(jié)退行性疾病[1]，尋求安全有效的治療方案具有重要意義。中醫(yī)藥治療KOA具有較好的臨床療效，而且不良反應(yīng)較少。補腎壯筋湯出自《傷科補要》，是臨床治療KOA肝腎虧虛證的常用方劑。但由于該方成分較為復(fù)雜，具體的作用機制尚未完全明確。為此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了補腎壯筋湯治療KOA的作用機制，現(xiàn)總結(jié)報告如下。

1 材料與方法

1.1 補腎壯筋湯活性成分篩選及靶點預(yù)測利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)檢索并篩選補腎壯筋湯組成藥物“熟地黃”“青皮”“白芍”“茯苓”“山茱萸”“續(xù)斷”“杜仲”“當(dāng)歸”“牛膝”的活性成分(篩選條件：口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18)；在中藥分子機制的生物信息學(xué)分析工具(bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM)中檢索補腎壯筋湯組成藥物“五加皮”的活性成分，并按照Lipinski類藥五原則進行篩選，即分子量<500、氫鍵供體數(shù)<5、氫鍵受體數(shù)<10、脂水分配系數(shù)<5、旋轉(zhuǎn)鍵<10[2]。在PubChem中檢索補腎壯筋湯活性成分的結(jié)構(gòu)式，將結(jié)果導(dǎo)入Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫檢索活性成分對應(yīng)的靶點，按照Probability≥0.7進行篩選，匯總篩選結(jié)果并去除重復(fù)項。

1.2 補腎壯筋湯治療KOA靶點預(yù)測以“knee osteoarthritis”為關(guān)鍵詞，在GeneCard數(shù)據(jù)庫中檢索KOA的靶點。將檢索結(jié)果和篩選出的補腎壯筋湯靶點導(dǎo)入Bioinformatics & Evolutionary Genomics網(wǎng)站，將二者取交集，預(yù)測補腎壯筋湯治療KOA的靶點。

1.3 補腎壯筋湯治療KOA關(guān)鍵靶點篩選將篩選到的補腎壯筋湯治療KOA的靶點基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫，分析各靶點蛋白之間的相互作用情況，設(shè)置置信度>0.9，隱藏游離蛋白。將String數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建補腎壯筋湯治療KOA靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并利用該軟件Network Analyzer工具中的MCODE插件篩選關(guān)鍵蛋白模塊，設(shè)置度值=2、節(jié)點得分=0.2、最大深度=100。

1.4 補腎壯筋湯治療KOA主要活性成分篩選先篩選出與補腎壯筋湯治療KOA的作用靶點有關(guān)的活性成分，再將其與補腎壯筋湯治療KOA的作用靶點、補腎壯筋湯組成中藥一同輸入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建補腎壯筋湯治療KOA“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，分析補腎壯筋湯治療KOA的主要活性成分。

1.5 補腎壯筋湯治療KOA靶點基因功能及信號通路分析將1.3中String數(shù)據(jù)庫的靶點分析結(jié)果導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，進行補腎壯筋湯治療KOA靶點基因GO富集分析和KEGG富集分析。利用R3.6.2軟件將富集分析結(jié)果可視化。

1.6 補腎壯筋湯治療KOA主要活性成分與關(guān)鍵靶點分子對接取1.3和1.4篩選出的關(guān)鍵靶點和主要活性成分，運用Autodock vina1.1.2軟件進行分子對接。通過PDB數(shù)據(jù)庫搜索關(guān)鍵靶點的3D結(jié)構(gòu)，并使用Pymol1.7.2.1軟件對其進行預(yù)處理，即使用盒子對蛋白進行定位，并對蛋白結(jié)構(gòu)進行殘基修補、去除水分子、添加氫原子和電荷，以PDBQT格式保存。通過PubChem數(shù)據(jù)庫下載主要活性成分的結(jié)構(gòu)，并基于MMFF94力場對其進行優(yōu)化。以原配體所在位點作為關(guān)鍵靶點的活性口袋，進行主要活性成分和關(guān)鍵靶點的分子對接。選取結(jié)合能較好的分子對接結(jié)果，通過Protein-Ligand Interaction網(wǎng)站和Pymol1.7.2.1軟件進行可視化。

2 結(jié) 果

2.1 補腎壯筋湯活性成分篩選及靶點預(yù)測結(jié)果在TCMSP和BATMAN-TCM共篩選到補腎壯筋湯的活性成分99個，預(yù)測到對應(yīng)的靶點768個(表1)。

表1 補腎壯筋湯的活性成分及靶點數(shù)量

2.2 補腎壯筋湯治療KOA靶點預(yù)測結(jié)果共篩選到KOA的靶點989個，將其與768個補腎壯筋湯靶點取交集后得到172個共同靶點，即補腎壯筋湯治療KOA的靶點。

2.3 補腎壯筋湯治療KOA關(guān)鍵靶點篩選結(jié)果將172個靶點基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫分析后得到148個節(jié)點(即148個靶點基因)、490對蛋白互作關(guān)系，構(gòu)建的補腎壯筋湯治療KOA靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)見圖1。通過MCODE插件篩選到1個包含15個靶點的關(guān)鍵蛋白模塊(圖2)，這些靶點即為補腎壯筋湯治療KOA的關(guān)鍵靶點，分別為促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase ，MAPK)1、Akt激酶(akt kinase，AKT)1、淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)、Harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(harvey rat sarcoma virus oncogene homolog，HRAS)、MAPK8、白細胞介素(interleukin，IL)-6、激肽原1(kininogen 1，KNG1)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、熱激蛋白90AA1(heat shock protein 90AA1，HSP90AA1)、JUN原癌基因(JUN proto-oncogene，JUN)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、MAPK14、IL-2、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、凝血因子Ⅱ(blood coagulation factorⅡ，F(xiàn)2)。

圖1 補腎壯筋湯治療膝骨關(guān)節(jié)炎的靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖2 補腎壯筋湯治療膝骨關(guān)節(jié)炎的靶點蛋白

2.4 補腎壯筋湯治療KOA主要活性成分篩選結(jié)果補腎壯筋湯99個活性成分中與補腎壯筋湯治療KOA的靶點有關(guān)的活性成分共64個(表2)。構(gòu)建的補腎壯筋湯治療KOA“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)(圖3)顯示，度值前5位的活性成分，即補腎壯筋湯治療KOA的主要活性成分分別為漢黃芩素(wogonin)、啤酒甾醇(cerevisterol)、槲皮素(quercetin)、黃芩素(baicalein)、山奈酚(kaempferol)。

表2 補腎壯筋湯的部分活性成分

續(xù)表2

圖3 補腎壯筋湯治療膝骨關(guān)節(jié)炎“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 補腎壯筋湯治療KOA靶點基因功能及信號通路分析結(jié)果將String數(shù)據(jù)庫分析后得到的148個靶點上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫。GO富集分析(圖4)共得到684個條目，其中細胞組分64個、生物過程516個、分子功能104個，生物過程主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、凋亡過程的負調(diào)控、信號傳導(dǎo)、調(diào)控細胞增殖、轉(zhuǎn)錄等，分子功能主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、鋅離子結(jié)合、相同蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合等，細胞組分主要涉及細胞內(nèi)質(zhì)膜、細胞質(zhì)、細胞核、胞質(zhì)溶膠、核質(zhì)等。KEGG富集分析(圖5)共得到111條通路，排除與KOA聯(lián)系不夠密切的通路，共篩選出磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-AKT、MAPK、TNF等3條主要信號通路。

圖4 補腎壯筋湯治療膝骨關(guān)節(jié)炎靶點基因GO富集分析柱狀圖(前10位)

圖5 補腎壯筋湯治療膝骨關(guān)節(jié)炎靶點基因KEGG富集分析氣泡圖(前20位)

2.6 補腎壯筋湯治療KOA主要活性成分與關(guān)鍵靶點分子對接結(jié)果分子對接結(jié)果顯示，5個主要活性成分與15個關(guān)鍵靶點均有良好的結(jié)合能力，結(jié)合能均≤-5.0 kJ·mol-1(表3)。取每個主要活性成分與關(guān)鍵靶點結(jié)合能最好的組合進行可視化，分子對接圖顯示活性成分大多嵌入靶點活性口袋的疏水區(qū)，結(jié)合模式多以π-π作用和氫鍵為主，提示其具有較好的結(jié)合活性，結(jié)合后構(gòu)象穩(wěn)定(圖6)。

表3 補腎壯筋湯治療膝骨關(guān)節(jié)炎主要活性成分與關(guān)鍵靶點的結(jié)合能 單位：kJ·mol-1

圖6 補腎壯筋湯治療膝骨關(guān)節(jié)炎的主要活性成分與關(guān)鍵靶點分子對接圖

3 討 論

從本研究的結(jié)果來看，漢黃芩素、啤酒甾醇、槲皮素、黃芩素、山奈酚為補腎壯筋湯治療KOA的主要活性成分。相關(guān)研究表明，漢黃芩素能抑制人軟骨細胞中NO、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)等炎癥因子的表達，同時誘導(dǎo)核因子E2相關(guān)因子2轉(zhuǎn)位至細胞核，與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，發(fā)揮抗氧化作用[3]。啤酒甾醇是從內(nèi)生真菌乙酸乙酯提取物中分離出的一種活性化合物[4]，能阻斷脂多糖誘導(dǎo)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和環(huán)氧合酶2表達上調(diào)，抑制其發(fā)揮免疫抑制作用，以及抑制NO、PGE2等炎癥因子的釋放[5]。槲皮素則具有抗氧化應(yīng)激、抗炎等作用[6]，可降低基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13，MMP-13)以及IL-1β等細胞因子的表達，從而抑制細胞外基質(zhì)的降解來保護關(guān)節(jié)軟骨[7]。作為黃芩主要活性成分之一的黃芪素，目前已被相關(guān)研究證實具有抗病毒、抗氧化、抗炎以及鎮(zhèn)痛等作用[8-9]。楊波等[10]通過實驗發(fā)現(xiàn)，黃芩素可通過調(diào)節(jié)miR-29a-3p來抑制MAPK6磷酸化，從而抑制軟骨細胞退化。山奈酚是一種存在于綠茶、漿果及一些中草藥中的膳食類黃酮[11]，能抑制TNF、IL-1、IL-6基因表達和對應(yīng)炎癥因子分泌[12]。

對于靶點的分析表明，MAPK1、AKT1、APP、HRAS、MAPK8、IL-6、KNG1、VEGFA、HSP90AA1、JUN、TNF、MAPK14、IL-2、EGFR、F2等15個靶點為補腎壯筋湯治療KOA的關(guān)鍵靶點。而靶點基因富集分析結(jié)果表明，MAPK1、AKT1、HRAS都與PI3K-AKT和MAPK這2條關(guān)鍵信號通路有關(guān)。MAPK1參與多種細胞過程，如增殖、分化和凋亡等。相關(guān)研究顯示，增加MAPK1的表達，可減弱IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞炎癥損傷[13]。AKT在轉(zhuǎn)化生長因子β的調(diào)控下可發(fā)生磷酸化，誘導(dǎo)組織金屬蛋白酶抑制因子3表達，增強細胞外基質(zhì)強度[14]。HRAS是RAS基因家族成員之一，負責(zé)調(diào)控細胞的生長與分裂[15]。HRAS多見于癌癥研究當(dāng)中[16]，其在KOA中作用的報道較少。Lü等[17]在輕度的OA組織中觀察到HRAS表達下調(diào)，以及Ⅱ型膠原蛋白和MMP-13表達下調(diào)。Jiang等[18]的研究結(jié)果顯示，HRAS敲減可減弱miR-218-5p抑制對TNF誘導(dǎo)的軟骨細胞功能障礙的保護作用。因此，后續(xù)的相關(guān)研究可基于MAPK1、AKT1等核心靶點進行實驗設(shè)計，也可將HRAS作為研究補腎壯筋湯治療KOA細胞機制的新方向。

本次研究中對靶點基因的富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補腎壯筋湯治療KOA的大部分關(guān)鍵靶點與PI3K-AKT信號通路和MAPK信號通路有關(guān)。PI3K-AKT信號通路主要參與細胞增殖、凋亡以及分化，目前也被認為是調(diào)控軟骨細胞凋亡的最重要的信號通路之一。PI3K被激活后產(chǎn)生磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸，后者與細胞內(nèi)AKT結(jié)合后促使下游因子磷酸化，調(diào)節(jié)細胞功能[19]。顏春魯?shù)萚20]研究發(fā)現(xiàn)，右歸丸能有效抑制KOA模型大鼠軟骨組織中PI3K、pAKT等相關(guān)蛋白表達，促進細胞自噬以阻止軟骨細胞進一步退化；同時還發(fā)現(xiàn)，右歸丸能通過調(diào)控PI3K-AKT信號通路來抑制KOA患者的炎癥反應(yīng)及軟骨細胞外基質(zhì)的過度降解，從而延緩關(guān)節(jié)軟骨退變。MAPK廣泛存在于真核細胞當(dāng)中[21]，作為MAPK信號通路三大亞類之一的p38MAPK信號通路，與KOA的病情進展關(guān)系密切。謝文鵬等[22]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，存在炎癥的軟骨基質(zhì)中，p38MAPK通路中的TNF、IL-1β等炎癥因子的分泌可被蒼膝通痹膠囊抑制，同時該藥還抑制了MMP-3、MMP-13的表達，進而抑制Ⅱ型膠原蛋白的降解以保護關(guān)節(jié)軟骨。

本研究的結(jié)果提示，補腎壯筋湯治療KOA的作用機制可能是通過漢黃芩素、啤酒甾醇、槲皮素、黃芩素、山奈酚等活性成分，參與調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄、凋亡過程、信號傳導(dǎo)、細胞增殖、轉(zhuǎn)錄，影響PI3K-AKT、MAPK、TNF等信號通路。受條件限制，本研究未能將分析結(jié)果與方劑配伍、藥物配比及藥物劑量等具體問題相聯(lián)系。本研究得出的補腎壯筋湯的主要活性成分槲皮素和山奈酚，也見于其他骨科方藥的活性成分研究結(jié)果中，這可能與數(shù)據(jù)庫信息收集的局限性有關(guān)。