李 晗，高云航，宋 玲，施偉東，李玲芝，陳騰飛，侯紅平，張廣平，葉祖光*

（1.中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700；2.廣西中恒創(chuàng)新醫(yī)藥研究有限公司，廣西 南寧 530000）

龜苓膏是我國歷史悠久的傳統(tǒng)藥膳，是經(jīng)典的藥食同源代表方劑。龜苓膏主要以龜甲和茯苓為原料，再配以金銀花、蒲公英、甘草等藥物精制而成。其性溫和，不涼不燥，具有清熱祛濕、旺血生肌、止瘙癢、去暗瘡、潤腸通便、滋陰補腎等功效。龜甲具有良好的滋陰效果，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》并被列為上品，《本草綱目》記載其“補心、補腎、補血，皆以養(yǎng)陰也……觀龜甲所主諸病，皆屬陰虛血弱”［1］。研究表明，龜甲治療陰虛火旺證不僅可改善臨床癥狀，能減輕化學藥物引發(fā)的不適反應，提高機體免疫力，改善陰虛證患者的內(nèi)分泌與血液系統(tǒng)［2］。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，陰虛火旺患者血清中的環(huán)磷酸腺苷/環(huán)磷酸鳥苷（cAMP/cGMP）比值及皮質醇（Cor）含量上升［3］，超氧化物歧化酶（SOD）與丙二醛（MDA）也呈現(xiàn)一定的變化趨勢［4］，并伴隨Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶含量上升［5-6］。因此，本實驗采用灌胃甲狀腺素致陰虛火旺病理模型，對龜苓膏是否通過調節(jié)機體的第二信使、能量代謝及氧化應激等途徑改善陰虛火旺證進行了初步探討。

1 實驗材料

1.1 動物SPF級健康SD大鼠，雄性，鼠齡8～10周，體質量180～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006。動物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院中藥研究所SPF級動物房，動物使用許可證號：SYXK（京）2015-0041。飼養(yǎng)條件為12 h明暗交替，溫度（23±1）℃，濕度（50±15）%，自主飲水及進食。

1.2 藥物與試劑 龜苓膏干膏粉（廣西梧州雙錢實業(yè)有限公司，1 g龜苓膏干膏粉相當于5.13 g生藥）；左甲狀腺素鈉片（商品名：優(yōu)甲樂，每片50 μg，美國默克公司）；cAMP、cGMP ELISA檢測試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司）；Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；SOD、MDA與Cor ELISA檢測試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 儀器 電子分析天平（德國Sartorius公司）；電子天平（瑞士METTLER公司）；高速離心機（美國Beckman公司）；VICTOR X型多標記酶標儀（美國Perkin Elmer公司）。

2 方 法

2.1 動物分組SD大鼠適應性喂養(yǎng)5 d后，按照體質量隨機分為空白組、模型組及龜苓膏低、中、高劑量組，每組10只。

2.2 給藥量計算 龜苓膏干膏粉1.4 g能制成200 g的龜苓膏，人每日食用龜苓膏的用量為400 g，則人每日服用劑量為0.047 g干膏粉/kg。本實驗設計3個劑量，其中中劑量為人的等效劑量的4倍，換算后大鼠低、中、高劑量分別為：0.66 g干膏粉/kg、1.32 g干膏粉/kg、2.64 g干膏粉/kg，即3.4 g生藥/kg、6.8 g生藥/kg、13.6 g生藥/kg。

2.3 造模與給藥 空白組、模型組每天正常飼喂，早上灌胃給予飲用水，給藥體積為10 ml/kg；龜苓膏低、中、高劑量組分別按3.4 g生藥/kg、6.8 g生藥/kg、13.6 g生藥/kg的劑量預給藥，給藥體積為10 ml/kg，連續(xù)7 d；第8 d起，模型組和龜苓膏低、中、高劑量組每天上午灌胃150 mg/kg優(yōu)甲樂混懸液（給藥質量濃度為15 mg/ml，給藥體積為10 ml/kg），約90 min后龜苓膏低、中、高劑量組再灌胃相應劑量的藥物，給藥體積為10 ml/kg，連續(xù)14 d。末次給藥（第21 d）后60 min，以10%的水合氯醛腹腔注射麻醉（用量為3.5 ml/kg），麻醉后腹主動脈取血置于離心管中備用，并剪取大鼠肝臟。

2.4 一般狀態(tài)觀察 每天觀察實驗期間各組大鼠的精神狀態(tài)、攝食、活動情況與皮毛色澤，并于第1 d、第7 d、14 d和第21 d稱量大鼠體質量，觀察大鼠的體質量變化情況。

2.5 大鼠血漿cAMP、cGMP的含量測定 取大鼠全血置于肝素處理過的離心管中，4 000 r/min離心10 min后分離血漿，于-20℃凍存待測。采用酶聯(lián)免疫法檢測cAMP、cGMP的含量，具體操作按照試劑盒說明方法進行。并計算cAMP/cGMP比值。

2.6 大鼠肝臟Na+-K+-ATP酶與Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的測定 稱取50～100 mg大鼠肝臟組織，用預冷的PBS沖洗去血漬，濾紙吸干剪碎，隨后放入加有鋼珠的研磨管內(nèi)，向研磨管中加入1 ml預冷并含有1% protein K蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，勻漿機進行4 000 r/min勻漿處理后，冰上裂解30 min，以4℃12 000 r/min離心10 min，提取上清后，采用BCA法進行蛋白質含量測定，按照酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒說明書檢測Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性。

2.7 大鼠血清SOD活性及MDA、Cor含量的測定 取大鼠血于離心管中，室溫下靜置30 min，3 000 r/min離心5 min后取上清液，-20℃保存，按照酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒說明書檢測大鼠血清SOD活性與MDA、Cor含量。

2.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS Statistics 20統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）的形式表示，組間差異采用單因素方差分析（One-Way-Anova），P＜0.05為有顯著性差異。

3 結果

3.1 龜苓膏對陰虛火旺證模型大鼠一般狀態(tài)及體質量的影響 在龜苓膏低、中、高劑量組預給藥期間，大鼠精神狀態(tài)良好，活潑好動，毛色有光澤，飲水、進食及二便均正常。大鼠灌胃給予優(yōu)甲樂進行造模后，模型組大鼠前期出現(xiàn)煩躁、拱背扎堆、排泄物增多，后期出現(xiàn)明顯消瘦、毛發(fā)光澤度差、大便干結等癥狀。龜苓膏低、中、高劑量組大鼠部分出現(xiàn)煩躁、拱背扎堆情況，整體狀態(tài)優(yōu)于模型組。在體質量方面，預給藥期間（第1～7 d）各組大鼠體質量均呈現(xiàn)增長趨勢，模型組大鼠體質量在造模7 d后（第14 d）時開始出現(xiàn)體質量增長緩慢，在造模14 d后（第21 d），體質量顯著低于空白組（P＜0.01）；與模型組比較，龜苓膏高劑量組的大鼠體質量顯著增加（P＜0.01），結果見表1。

表1 各組大鼠體質量比較 （g，）

表1 各組大鼠體質量比較 （g，）

注：與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01

組 別空白組模型組龜苓膏低劑量組龜苓膏中劑量組龜苓膏高劑量組n 10 10 10 10 10劑量（g生藥/kg）- -3.4 6.8 13.6第1 d 249.0±8.0 248.4±8.8 249.6±9.4 249.0±9.2 249.1±9.2第7 d 298.1±10.9 294.0±16.5 294.7±13.1 294.9±10.3 298.3±12.5第14 d 339.8±12.8 322.9±29.9 333.6±20.8 325.8±11.9 335.5±16.5第21 d 385.6±23.0 348.3±30.1①342.6±15.1 354.5±13.0 379.1±23.8②

3.2 龜苓膏對陰虛火旺模型大鼠血漿cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值的影響 見表2。與空白組比較，模型組大鼠血漿cAMP含量及cAMP/cGMP比值顯著升高（P＜0.01），cGMP含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，龜苓膏低、中、高劑量組大鼠血漿中cAMP的含量顯著降低（均P＜0.01）；龜苓膏中、高劑量組大鼠血漿中cGMP水平顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），cAMP/cGMP比值顯著降低（P＜0.01）。

表2 龜苓膏對陰虛火旺模型大鼠cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值的影響 （）

表2 龜苓膏對陰虛火旺模型大鼠cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值的影響 （）

注：與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01

組 別空白組模型組龜苓膏低劑量組龜苓膏中劑量組龜苓膏高劑量組n 10 10 10 10 10劑量（g生藥/kg）- -3.4 6.8 13.6 cAMP（pmol/ml）24.5±2.3 75.2±4.4①65.2±5.8③56.4±2.6③49.3±5.4③cGMP（pmol/ml）12.4±0.8 9.7±1.1①10.1±1.2 11.0±1.4②11.9±1.4③cAMP/cGMP 2.0±0.2 7.9±1.0①6.6±1.0 5.2±0.7③3.4±0.7③

3.3 龜苓膏對陰虛火旺模型大鼠肝臟中Na+-K+-ATP酶與Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響 見表3。與空白組比較，模型組大鼠肝臟中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，龜苓膏低、中、高劑量組大鼠肝臟中Na+-K+-ATP酶活性顯著降低（P＜0.01），Ca2+-Mg2+-ATP酶活性呈降低趨勢，但無顯著性差異。

表3 龜苓膏對陰虛火旺模型大鼠肝臟中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響 （）

表3 龜苓膏對陰虛火旺模型大鼠肝臟中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響 （）

注：與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01

組 別空白組模型組龜苓膏低劑量組龜苓膏中劑量組龜苓膏高劑量組n 10 10 10 10 10劑量（g生藥/kg）- -3.4 6.8 13.6 Na+-K+-ATP［μmol Pi/（mg·h）］0.94±0.20 1.65±0.11①1.44±0.09②1.34±0.20②1.32±0.18②Ca2+-Mg2+-ATP［μmol Pi/（mg·h）］1.12±0.09 1.69±0.14①1.59±0.15 1.54±0.13 1.50±0.20

3.4 龜苓膏對陰虛火旺模型大鼠血清SOD活性及MDA、Cor含量的影響 見表4。與空白組比較，模型組大鼠血清中SOD活性顯著下降，Cor和MDA含量顯著升高（均P＜0.01）。與模型組比較，龜苓膏低、中、高劑量組大鼠血清中SOD活性顯著上升（P＜0.05或P＜0.01），龜苓膏中、高劑量組大鼠血清中MDA含量顯著下降（P＜0.05或P＜0.01），龜苓膏低、中、高劑量組的大鼠血清中Cor含量有降低趨勢，但無顯著性差異。

表4 龜苓膏對陰虛火旺模型大鼠SOD活性及MDA、Cor含量的影響 （）

表4 龜苓膏對陰虛火旺模型大鼠SOD活性及MDA、Cor含量的影響 （）

注：與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01

組 別空白組模型組龜苓膏低劑量組龜苓膏中劑量組龜苓膏高劑量組n 10 10 10 10 10劑量（g生藥/kg）- -3.4 6.8 13.6 SOD（U/ml）196.8±4.6 121.2±6.0①135.3±10.6②150.5±11.4③163.2±9.7③MDA（ng/ml）116.9±16.2 203.6±26.9①188.0±24.9 180.2±23.6②163.1±22.0③Cor（ng/ml）16.1±2.4 23.2±3.3①19.5±4.7 19.8±6.1 18.8±3.8

4 討論

陰虛火旺證是臨床常見的中醫(yī)證型，多因機體陰精或津液虧虛而不能制陽，致使陽氣亢盛，機體代謝加快，產(chǎn)熱增加，從而導致虛熱內(nèi)生的病理狀態(tài)。

甲狀腺素作為能量代謝的重要調節(jié)物質，可以增加機體的基礎代謝，增加產(chǎn)熱，長時間使用甲狀腺素可引發(fā)形體消瘦、暴躁易怒等現(xiàn)象，這與陰虛火旺體質表現(xiàn)相一致［7-8］。因此，采用甲狀腺素建立陰虛火旺模型的方法具有操作簡便、成模時間短、重復性好、動物死亡率及成本低等優(yōu)點，是研究陰虛火旺證的傳統(tǒng)造模方法［9］。本實驗發(fā)現(xiàn)，連續(xù)灌胃150 mg/kg優(yōu)甲樂混懸液14 d后，前期大鼠出現(xiàn)煩躁易怒、拱背扎堆、排泄物增多等現(xiàn)象，后期大鼠出現(xiàn)明顯消瘦、毛發(fā)光澤度差、大便干結等癥狀表現(xiàn)，均與陰虛火旺證的臨床癥狀相符，以上結果表明本研究陰虛火旺模型大鼠復制成功。

龜苓膏具有清熱解毒、滋陰補腎等功效［10］，其主要有效成分為皂苷、多糖、生物堿、胡蘿卜烴類、葉綠素、黃酮、傘花內(nèi)酯、揮發(fā)油、鈣、鐵、維生素C、維生素B1、β-谷甾醇等［11］。古人認為“龜乃陰中至陰之物”，龜甲性平，不溫不涼，是滋陰效果最佳的藥物。現(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn)，龜甲可降低甲亢陰虛大鼠整體的耗氧量、減緩心率、增加飲水量及尿量。與此同時，龜甲還能提高陰虛證大鼠的抗氧化能力，并調節(jié)Bax與Bcl-2等衰老相關因子的蛋白表達［1］。

本研究重點關注與陰虛火旺證密切相關的生理指標，其中包括第二信使cAMP、cGMP的含量及cAMP/cGMP比值的變化，與能量代謝相關的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性以及以SOD活性、MDA含量為代表的氧化應激指標。

有文獻報道，機體代謝調節(jié)因子cAMP與cGMP是細胞功能的重要調節(jié)物質，是生命信息傳遞的“第二信使”［12］，且機體神經(jīng)內(nèi)分泌功能與血中cAMP和cGMP的水平密切相關［13-14］。近年來，國內(nèi)外學者對中醫(yī)陰陽理論的物質基礎進行了大量的研究與臨床觀察，發(fā)現(xiàn)陰虛火旺證患者神經(jīng)-腎上腺系統(tǒng)功能偏高，交感神經(jīng)異常興奮，cAMP水平升高，cGMP水平降低或維持不變，因此認為選用cAMP/cGMP比值變化進行評價更為準確［15-16］。本實驗通過觀察大鼠血漿cAMP、cGMP含量與cAMP/cGMP比值，發(fā)現(xiàn)陰虛火旺模型組大鼠的血漿cAMP含量及cAMP/cGMP比值顯著升高，cGMP含量較空白組顯著降低，這與相關文獻報道相一致［17-18］。而與模型組比較，龜苓膏低、中、高劑量組大鼠血漿中cAMP的含量顯著降低，中、高劑量組龜苓膏組大鼠血漿cGMP水平顯著增加，cAMP/cGMP比值顯著降低，提示龜苓膏可以通過調節(jié)大鼠血漿cAMP、cGMP的含量及cAMP/cGMP比值起到滋陰瀉火的作用。

“陰虛則陽亢”，因此陰虛患者臨床癥狀多表現(xiàn)心悸脈數(shù)、五心煩熱、易于激動，研究發(fā)現(xiàn)以上現(xiàn)象的發(fā)生可能與能量代謝的增高有關［19-20］。甲狀腺素不但能使大鼠產(chǎn)生煩躁易怒等陰虛火旺癥狀，在細胞水平還可以結合特異性受體，使細胞核RNA聚合酶被激活，增加細胞膜ATP酶的含量，進而使細胞能量代謝速率增加，能量消耗加快，產(chǎn)熱增加，體溫升高［21-22］。因此，ATP酶活性的檢測也成為判斷大鼠是否具有陰虛火旺證的代表性指標之一。同時肝臟作為體內(nèi)最大的實質性臟器，肝臟細胞內(nèi)Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的改變也會直接影響機體的“熱”。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肝臟中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均顯著升高，與模型組比較，龜苓膏低、中、高劑量組的大鼠肝臟中Na+-K+-ATP酶活性顯著降低，Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性呈降低趨勢。提示龜苓膏可以通過調節(jié)大鼠肝臟Na+-K+-ATP酶的活性減輕機體“火旺”的狀態(tài)。

文獻報道顯示，陰虛火旺證的病理生理學基礎也與體內(nèi)自由基代謝異常相關，其中“火旺”可能是機體氧化代謝過程增強、自由基生成增多的表現(xiàn)［23］。若不能及時清除，過量的自由基會攻擊機體內(nèi)各種細胞器以及生命大分子物質，進而引發(fā)機體在分子水平、細胞水平及組織器官水平的損傷［24-25］。SOD作為清除氧自由基氧化的重要保護酶，能夠清除在生理過程中產(chǎn)生的有害物質，有效防止有害物質對組織細胞造成的損傷。MDA為脂質過氧化反應中最具代表性的代謝產(chǎn)物，現(xiàn)代研究多用于對機體自由基代謝水平的衡量［26-27］。本實驗結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠的血清中SOD活性顯著下降，MDA含量顯著上升，符合陰虛火旺致氧化損傷表現(xiàn)。與模型組比較，龜苓膏低、中、高劑量組的大鼠血清中SOD活性顯著上升，龜苓膏中、高劑量組的大鼠血清中MDA含量顯著下降。提示龜苓膏可以通過調節(jié)SOD活性與MDA含量改善陰虛火旺證。

陰虛火旺證除以煩躁易怒、身形消瘦為主要表現(xiàn)外，還常表現(xiàn)為腎上腺皮質功能亢進［28］。作為一種類固醇類激素，皮質醇主要由腎上腺皮質合成并分泌，其在大鼠體內(nèi)主要以Cor的形式存在，因此本實驗檢測大鼠血清中Cor的含量來進一步評價龜苓膏對陰虛火旺模型大鼠的滋陰瀉火作用。結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠的血清中Cor含量顯著升高。與模型組比較，龜苓膏低、中、高劑量組的大鼠血清中Cor含量有所降低，但無顯著性差異。

綜上所述，龜苓膏作為“藥食同源”的代表方劑，能下調cAMP/cGMP比值，降低能量代謝Na+-K+-ATP酶的活性，減慢能量消耗速率，同時通過上調SOD活性、降低MDA含量，進而起到滋陰瀉火的作用。本研究為探討龜苓膏的滋陰瀉火作用提供了實驗數(shù)據(jù)，也為在中醫(yī)藥理論指導下“藥食同源”食品的合理應用提供科學研究思路。