韓敏敏 ，高程海，米順利，陳顯強(qiáng)，薛命雄，梁振秀，唐振洲 ，張 玲，*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院，廣西 南寧 530200；3.廣西北海生巴達(dá)生物科技有限公司，廣西 北海 536000）

鈍頂螺旋藻（spirulina platensis）是一種多細(xì)胞絲狀螺旋形海洋藻類生物，富含藻藍(lán)蛋白（C-phycocyanin，C-PC）、多糖、β-胡蘿卜素等生物活性成分。其中，藻藍(lán)蛋白是螺旋藻中一種主要功能性蛋白質(zhì)，占螺旋藻（干基）的20%［1］，是一種在光激發(fā)下能產(chǎn)生活性氧從而進(jìn)行光動(dòng)力治療的光敏劑［2］，具有提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗氧化、清除自由基、抗炎、保護(hù)肝臟等藥理活性，有極大開(kāi)發(fā)成藥物的潛力［3-5］。

光動(dòng)力療法（photodynamic therapy，PDT）是治療腫瘤的有效手段之一，PDT 治療可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡和凋亡，并損傷腫瘤相關(guān)血管。近年來(lái)，PDT 的作用機(jī)制越來(lái)越受到關(guān)注。腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素［6-7］。目前，已有多項(xiàng)相關(guān)研究證實(shí)藻藍(lán)蛋白聯(lián)合光動(dòng)力療法治療實(shí)體瘤取得了不錯(cuò)的治療效果［8-10］。本研究從機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能的角度探討藻藍(lán)蛋白聯(lián)合光動(dòng)力療法對(duì)人胰腺癌細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤作用，為開(kāi)發(fā)研制抗腫瘤藥物以及將藻藍(lán)蛋白作為光敏劑開(kāi)發(fā)應(yīng)用于臨床癌癥疾病治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)BALBC/C裸鼠，40只，雌雄各半，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004；質(zhì)量合格證號(hào)：430727201101851386。無(wú)菌環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞株 人胰腺癌細(xì)胞SW1990 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所。

1.3 試藥與試劑 鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白凍干粉，純度為A620/A280≥3.5，購(gòu)自寧波賓美生物科技公司，密封陰涼干燥避光處保存，使用前用滅菌蒸餾水配制成所需濃度；注射用環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide for Injection，CY，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品）購(gòu)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，每瓶0.2 g，儲(chǔ)藏溫度不超過(guò)25 ℃，使用前用滅菌生理鹽水配制成所需濃度；不完全Leibovitz’s L-15 培養(yǎng)基（貨號(hào)：KGM41300N，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；0.25 % Trypsin-EDTA（1×）（貨號(hào)：2120734，Gibco 公司）；青鏈霉素混合液（貨號(hào)：2257222，Gibco 公司）；胎牛血清（貨號(hào)：2068801CP，Gibco 公司）；小鼠白介素6（IL-6）酶聯(lián)免疫試劑盒（貨號(hào)：CSB-E04741m，武漢華美生物工程有限公司）；小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫試劑盒（貨號(hào)：CSB-E04639m，武漢華美生物工程有限公司）。

1.4 儀器 萬(wàn)分之一電子分析天平（型號(hào)：ML204T，廣州梅特勒托利多公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)：CT15RE，日本日立有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱［型號(hào)：PHCbi MCO-170AICDL-PC，普和希健康醫(yī)療器械（上海）有限公司］；生物安全柜（型號(hào)：HR1500-IIB2，青島海爾特種電器有限公司）；倒置生物顯微鏡（型號(hào)：CKX41，OLYMPUS）；超低溫冰箱（型號(hào)：DW-86L728J，青島海爾特種電器有限公司）；超純水儀（型號(hào)：德國(guó)MERCKMILLIP ORE IQ7000，廣西南寧市博美生物科技有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（型號(hào)：HHS4，常州金壇良友儀器有限公司）；組織研磨器（型號(hào)：2 ml，成都蜀?？萍加邢薰荆痪植抗鈩?dòng)力治療儀（型號(hào)：CG-2，廣州市祥光中醫(yī)癌癥防治研究所研制）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型的建立 實(shí)驗(yàn)分為6 組：正常組、模型組、激光照射組、C-PC 組、C-PC+激光照射組、CY 組。正常組10 只，其他每組6 只。除正常組外，余組參考文獻(xiàn)［11］的方法進(jìn)行造模。取SW1990細(xì)胞用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）稀釋至5×107/ml 的細(xì)胞懸液后，接種到裸鼠右前肢腋窩處，每只裸鼠接種0.2 ml，制成人胰腺癌裸鼠移植瘤模型，整個(gè)操作在30 min 內(nèi)完成。無(wú)菌環(huán)境飼養(yǎng)，從第1 天開(kāi)始每隔一天用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量一次腫瘤的長(zhǎng)徑（a）與橫徑（b），測(cè)量腫瘤直徑長(zhǎng)約0.5 cm左右時(shí)則造模成功。

2.2 治療干預(yù) 正常組：不進(jìn)行激光照射、不給藥，予等體積飲用水；模型組：不進(jìn)行激光照射、不給藥，予等體積飲用水；激光照射組：采用局部光動(dòng)力治療儀照射種瘤區(qū)，光源距離鼠體瘤區(qū)30 cm，光源直徑2 cm，每 次 15 min，連 續(xù) 照 射 2 周 ；C-PC 組 ：予500 mg（/kg·d）藻藍(lán)蛋白液灌胃給藥，容積為20 ml/kg，連續(xù)給藥2 周；C-PC+激光照射組：予500 mg（/kg·d）藻藍(lán)蛋白液灌胃給藥2 h 后，用局部光動(dòng)力治療儀照射種瘤區(qū)，每次照射 15 min，連續(xù) 2 周；CY 組：予40 mg（/kg·d）環(huán)磷酰胺腹腔注射給藥，每隔一天腹腔注射給藥1次，連續(xù)給藥2周。

2.3 指標(biāo)測(cè)定 從第1 天開(kāi)始每隔一天用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量一次腫瘤的長(zhǎng)徑（a）與橫徑（b），同時(shí)稱量小鼠體重。于末次給藥24 h 后將全部小鼠稱重，眼球采血后處死，置于75%消毒酒精溶液中浸泡5 min，無(wú)菌條件下解剖小鼠，取出脾臟，分離皮內(nèi)與完整瘤塊，將上述組織剝離、除去包膜，準(zhǔn)確稱量，計(jì)算脾指數(shù)、腫瘤體積及抑瘤率。公式如下：脾指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量（脾臟質(zhì)量單位為mg，體質(zhì)量單位為g）；腫瘤體積=1/2×a×b（2a為長(zhǎng)徑，b為橫徑）；抑瘤率（%）=（模型組平均瘤重-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%。

2.4 細(xì)胞因子的測(cè)定

2.4.1 小鼠血清中TNF-α 水平的測(cè)定 全血標(biāo)本置于4 ℃冰箱中過(guò)夜后，于4 ℃低溫離心機(jī)1 000 g 離心15 min，取上清液，置于-20 ℃保存，避免反復(fù)凍融。檢測(cè)前血清標(biāo)本需再次離心，取上清液，按照小鼠TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定TNF-α的含量。

2.4.2 小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α水平的測(cè)定 用PBS 洗去脾臟組織上的結(jié)締組織或脂肪，在60 mm2無(wú)菌培養(yǎng)皿中加入5 ml L15 完全培養(yǎng)基，用無(wú)菌注射器的扁平末端以溫和畫(huà)圓的方式研磨脾臟5 次，200 目篩網(wǎng)過(guò)濾至離心管中，300 g離心10 min，去上清液，用L15 完全培養(yǎng)液洗 3 次，細(xì)胞懸液濃度為 5×106/ml，置于二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞上清液，1 000 g離心10 min 去除顆粒和聚合物，取上清液，按照小鼠TNF-α 酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)TNF-α活性。

2.4.3 小鼠血清中IL-6 水平的測(cè)定 全血標(biāo)本置于4 ℃冰箱中過(guò)夜后，于4 ℃低溫離心機(jī)1 000 g 離心15 min，取上清液，按照小鼠IL-6 酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中IL-6水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel工作表進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用IBM SPSS Statistics 21 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 一般情況觀察 正常組小鼠精神狀態(tài)良好，皮膚光滑無(wú)粗糙皺縮現(xiàn)象；模型組小鼠成瘤后，活動(dòng)減少，精神萎靡倦怠，體重減輕，皮膚表面粗糙有褶皺；CY組小鼠受化療藥物環(huán)磷酰胺的影響，精神倦怠，活動(dòng)少，不活動(dòng)時(shí)大多數(shù)背部呈“弓”字樣蜷縮；C-PC 組、激光照射組和C-PC+激光照射組的小鼠精神狀態(tài)及活動(dòng)較為活潑。動(dòng)物成瘤率為100%，整個(gè)動(dòng)物飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未出現(xiàn)小鼠死亡現(xiàn)象。

3.2 各組小鼠瘤重、瘤體積和抑瘤率比較 見(jiàn)表1、圖1。結(jié)果顯示，與模型組比較，C-PC 組瘤重顯著減少（P＜0.05）；CY組及C-PC+激光照射組瘤重和瘤體積均顯著減少（P＜0.05 或P＜0.01）；激光照射組對(duì)瘤重和瘤體積無(wú)顯著影響。激光照射組、C-PC 組、C-PC+激光照射組的抑瘤率分別為（39.42±8.47）%、（42.85±12.15）%、（74.80±11.85）%，而C-PC+激光照射組的抑瘤率與CY組（78.58±8.87%）相當(dāng)（P＞0.05）。

表1 各組小鼠瘤重、瘤體積和抑瘤率比較 （）

表1 各組小鼠瘤重、瘤體積和抑瘤率比較 （）

注：與模型組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與CY組比較，③P＜0.05

n抑瘤率（%）組 別正常組模型組CY組激光照射組C-PC組C-PC+激光照射組10— —78.58±8.87 39.42±8.47③42.85±12.15③74.80±11.85 6 6 6 6 6瘤重（g）—0.539±0.129 0.108±0.037②0.324±0.074 0.296±0.027①0.132±0.055②瘤體積（cm3）—0.703±0.286 0.138±0.057①0.412±0.094 0.383±0.086 0.158±0.090①

圖1 各組小鼠腫瘤直觀圖

3.3 各組小鼠脾重、脾指數(shù)比較 見(jiàn)表2。與正常組比較，模型組的脾重和脾臟指數(shù)顯著減少（P＜0.05）；與模型組比較，激光照射組、C-PC 組和C-PC+激光照射組均能顯著增加脾重和脾指數(shù)（P＜0.05 或P＜0.01），而CY 組小鼠脾重和脾指數(shù)顯著下降（P＜0.05）。表明單獨(dú)激光照射或藻藍(lán)蛋白處理均有免疫增強(qiáng)的作用，二者聯(lián)用效果更顯著。

表2 各組小鼠脾重、脾指數(shù)比較 （）

表2 各組小鼠脾重、脾指數(shù)比較 （）

注：與正常組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01

脾指數(shù)（%）10.280±1.229 9.818±0.363①7.373±1.031②12.68±0.538②13.56±1.192③15.59±1.038③組 別正常組模型組CY組激光照射組C-PC組C-PC+激光照射組n 10 6 6 6 6 6脾重（g）0.207±0.020 0.188±0.020①0.132±0.052②0.256±0.033③0.297±0.041③0.361±0.055③

3.4 各組小鼠TNF-α 及IL-6 水平比較 見(jiàn)表3。與正常組比較，模型組TNF-α 及IL-6 水平無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與模型組比較，C-PC 組和C-PC+激光照射組均能顯著增加小鼠TNF-α及IL-6的水平（P＜0.05或P＜0.01）；而 CY 組 TNF-α 及 IL-6 的水平顯著下降（P＜0.05 或P＜0.01）；激光照射組可促進(jìn)IL-6 含量（P＜0.05），而對(duì)TNF-α水平無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

表3 各組小鼠TNF-α及IL-6水平比較 （）

表3 各組小鼠TNF-α及IL-6水平比較 （）

注：與模型組比較，①P＜0.05，②P＜0.01

組 別n IL-6（pg/ml）21.79±6.20 14.27±3.21 5.15±2.92①39.17±9.38①34.73±9.76①51.43±14.34②正常組模型組CY組激光照射組C-PC組C-PC+激光照射組10 6 6 6 6 6 TNF-α（pg/ml）血清24.42±3.23 30.07±4.04 10.68±3.77②46.56±11.00 72.73±9.31②89.00±8.43②脾臟38.89±12.87 49.44±16.47 22.99±7.82①68.01±8.37 85.01±10.83②118.39±18.00②

4 討 論

胰腺癌（PDA）是一種惡性程度很高的消化系統(tǒng)腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，且早期診斷率不高，是目前手術(shù)預(yù)后效果差的癌種之一［12-13］。

正常情況下，機(jī)體的免疫系統(tǒng)處于相互平衡的狀態(tài)，當(dāng)發(fā)生腫瘤時(shí)，機(jī)體免疫功能就會(huì)降低，平衡狀態(tài)被破壞。因此，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與免疫系統(tǒng)有著密不可分的關(guān)系［14］。經(jīng)證實(shí)，光動(dòng)力療法可以誘導(dǎo)特異性和非特異性免疫反應(yīng)，從而提高光動(dòng)力介導(dǎo)的抗腫瘤效果［15］，光動(dòng)力治療與抗腫瘤免疫治療的聯(lián)合應(yīng)用具有顯著的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)［16-18］。

本實(shí)驗(yàn)采用裸鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在裸鼠的右前肢腋窩處皮下接種人胰腺癌SW1990 細(xì)胞，由于是人源腫瘤細(xì)胞異源接種在動(dòng)物皮下部位，所以腫瘤潛伏生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，一般在7～14 d 左右才可以達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需腫瘤體積，但成瘤率較好，高達(dá)100%。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，激光照射、藻藍(lán)蛋白處理以及藻藍(lán)蛋白聯(lián)合激光照射作用后均能減輕瘤重和瘤體積，抑瘤率分別為（39.42±8.47）%、（42.85±12.15）%及（74.80±11.85）%，而藻藍(lán)蛋白聯(lián)合激光照射作用的抑瘤率與CY 組抑瘤率（78.58±8.87）%相近，表明藻藍(lán)蛋白聯(lián)合光動(dòng)力療法對(duì)于抑制腫瘤的生長(zhǎng)具有良好的效果。激光照射組的抑瘤率達(dá)到30%，亦認(rèn)為具有一定的抑瘤作用［19］。

本實(shí)驗(yàn)的小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組小鼠的免疫器官脾重和脾指數(shù)明顯降低。經(jīng)過(guò)激光照射、藻藍(lán)蛋白作用后小鼠的脾重和脾指數(shù)均顯著增加，表明激光照射、藻藍(lán)蛋白處理均能夠促進(jìn)小鼠脾臟的生長(zhǎng)發(fā)育，且藻藍(lán)蛋白聯(lián)合激光照射的小鼠脾重和脾指數(shù)升高更顯著，其機(jī)制可能是通過(guò)引起免疫器官活性細(xì)胞的增生反應(yīng)［20］，增強(qiáng)小鼠機(jī)體免疫活性。

腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）是至今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞因子［21］，具有抗腫瘤、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)活性［22］。有研究表明，TNF-α 在體內(nèi)可以直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，可以通過(guò)多途徑綜合機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用和調(diào)節(jié)免疫效應(yīng)［23］。白介素-6（IL-6）是活化的T 細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子，能使B 細(xì)胞前體成為產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，與炎癥性疾病和感染程度直接相關(guān)。早期研究表明，IL-6 能夠通過(guò)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)來(lái)直接或間接地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)而發(fā)揮抗腫瘤作用［24］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：藻藍(lán)蛋白處理及藻藍(lán)蛋白聯(lián)合激光照射作用后TNF-α 和IL-6 表達(dá)量均高于模型組，其中二者聯(lián)合作用效果更顯著。惡性腫瘤患者隨著病程延長(zhǎng)和疾病的惡化，往往會(huì)伴隨著機(jī)體免疫系統(tǒng)功能下降，并且免疫功能下降隨著放療、化療次數(shù)增加更為明顯。藻藍(lán)蛋白和激光照射能使患癌小鼠TNF-α和IL-6水平顯著提高，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫效應(yīng)，這可能是其抗腫瘤的作用機(jī)制之一。

綜上所述，藻藍(lán)蛋白能有效抑制體內(nèi)腫瘤組織的生長(zhǎng)，其介導(dǎo)的光動(dòng)力療法聯(lián)合治療小鼠SW1990 腫瘤的效果更加顯著，能提高患癌小鼠免疫器官的脾指數(shù)，促進(jìn)患癌小鼠TNF-α 和IL-6 的表達(dá)水平。提示藻藍(lán)蛋白聯(lián)合光動(dòng)力療法有可能通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能來(lái)達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。