林 瑜 ,李見能 ,韋小玲 ,潘真真 ,李芳嬋 ,譚建寧*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,南寧 530200;2.廣西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,南寧 530004;3.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 教學(xué)實驗實訓(xùn)中心,南寧 530200)

硫普羅寧是一種甘氨酸衍生物,化學(xué)名為N-(2-巰基丙?；?甘氨酸,其側(cè)鏈的活性巰基在人體內(nèi)能發(fā)揮多種藥理效應(yīng),具有良好的解毒作用,可顯著修復(fù)乙醇性肝損傷,被廣泛用于臨床肝臟疾病的治療[1]。目前測定硫普羅寧含量的方法主要有高效液相色譜法[2-4]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-6]、紫外-可見分光光度法(UV-Vis)[7-11]、近紅外光譜法[12]、拉曼光譜法[13]、熒光分光光度法[14-15]、電化學(xué)法[16-17]等,這些方法中,除了UV-Vis以外,其他方法具有操作復(fù)雜、儀器成本高、需使用有毒試劑等缺點。文獻(xiàn)報道的UV-Vis主要是利用硫普羅寧分子中巰基的還原性,先把一些高價態(tài)金屬離子(如Cu2＋、Fe3＋)還原成低價態(tài),再加入顯色劑,使其與被還原的金屬離子結(jié)合后對硫普羅寧進(jìn)行間接測定,但該方法在測定過程中容易受空氣中氧氣的影響,穩(wěn)定性欠佳。硫普羅寧分子中含有孤對電子的仲胺、羥基以及巰基,能與金屬離子進(jìn)行配位,并且研究發(fā)現(xiàn),在弱酸性環(huán)境中,硫普羅寧與Pd2＋可形成穩(wěn)定的絡(luò)合物,該絡(luò)合物在波長345 nm處有靈敏的特征吸收,且吸光度隨硫普羅寧濃度的增大而增強(qiáng),據(jù)此提出了一種間接測定硫普羅寧含量的新方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

UV-2100型紫外可見分光光度計;KQ-700TDE型高頻數(shù)控超聲波清洗器;HH-8型恒溫水浴鍋;1 cm石英比色皿。

硫普羅寧標(biāo)準(zhǔn)溶液:196.0 mg·L-1,稱取0.196 0 g硫普羅寧標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯中,加水溶解,常溫超聲3 min,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,用水定容,搖勻,配制成1 960 mg·L-1硫普羅寧標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,再用水稀釋10倍,得到196.0 mg·L-1硫普羅寧標(biāo)準(zhǔn)溶液。

Pd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液:166.7 mg·L-1,稱取0.833 3 g二氯化鈀,加入5 mol·L-1鹽酸溶液10.00 mL,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,用水定容,搖勻,配制成Pd2＋質(zhì)量濃度為8 333 mg·L-1的Pd2＋標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,再用水稀釋50倍,得到166.7 mg·L-1Pd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液。

乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH 5.0):稱取26.7 g乙酸鈉,加水溶解后,加入10.30 mL冰乙酸,將混合溶液轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中,再用水定容。

所用試劑均為分析純;試驗用水為蒸餾水。

市售的3個不同品牌的硫普羅寧片劑,硫普羅寧標(biāo)示量均為0.1 g·片-1。

1.2 儀器工作條件

檢測波長345 nm;掃描范圍200～500 nm;光譜帶寬度0.2 nm。

1.3 試驗方法

取20片硫普羅寧片劑樣品,準(zhǔn)確稱量、研碎,再稱取相當(dāng)于0.1 g硫普羅寧的粉末于燒杯中,加水溶解后轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中,用水定容,搖勻,過濾,配制成樣品儲備溶液。使用時,用水稀釋,得到待測樣品溶液。

于10 mL比色管中依次加入2.00 mL Pd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液、4.00 mL待測樣品溶液和1.00 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH 5.0),用水定容,搖勻,靜置5～10 min。以硫普羅寧標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比,于345 nm處測定體系的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

在檢測波長200～500 nm內(nèi),以水為參比,對硫普羅寧標(biāo)準(zhǔn)溶液、Pd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液和兩者反應(yīng)后的混合溶液進(jìn)行測定,結(jié)果見圖1。

圖1 紫外-可見吸收光譜圖Fig.1 UV-Vis spectra

由圖1可知:硫普羅寧在238 nm處有吸收峰;Pd2＋在220 nm和278 nm處有吸收峰;硫普羅寧標(biāo)準(zhǔn)溶液與Pd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)后,在274,345,395 nm處有吸收峰,其中274 nm附近存在Pd2＋吸收干擾,345 nm附近吸收較靈敏,但仍存在硫普羅寧和Pd2＋的微量吸收干擾。因此,試驗以硫普羅寧標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比,于345 nm處進(jìn)行測定。

2.2 體系酸度及緩沖溶液用量的選擇

用0.1 mol·L-1鹽酸溶液和0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系酸度,考察了不同酸度(pH 3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0)對體系吸光度的影響。結(jié)果表明:當(dāng)pH小于5.0時,體系的吸光度隨pH增大而增大;當(dāng)pH為5.0時,體系的吸光度較大且穩(wěn)定;當(dāng)pH大于5.0時,由于Pd2＋發(fā)生部分水解,與硫普羅寧配位的Pd2＋減少,體系的吸光度隨pH增大而減小。選用pH 5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液,考察了不同用量(0.20,0.40,0.60,0.80,1.00,1.20,1.40,1.60 mL)的該溶液對體系吸光度的影響。結(jié)果顯示:當(dāng)乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH 5.0)用量小于1.00 mL時,體系的吸光度隨緩沖溶液用量的增加而增大;當(dāng)加入乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH 5.0)1.00 mL時,體系的吸光度較大;當(dāng)乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH 5.0)用量大于1.00 mL時,體系的吸光度隨緩沖溶液用量的增加而減小,可能是乙酸-乙酸鈉和硫普羅寧競爭與Pd2＋配位,導(dǎo)致生成的硫普羅寧-Pd2＋絡(luò)合物減少。因此,試驗選用1.00 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH 5.0)來調(diào)節(jié)體系酸度。

2.3 Pd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液用量的選擇

試驗分別考察了不同用量(0.50,1.00,1.50,2.00,2.50,3.00 mL)的166.7 mg·L-1Pd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液對體系吸光度的影響。結(jié)果顯示:當(dāng)Pd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液用量小于2.00 mL時,隨用量的增加,體系的吸光度逐漸增強(qiáng);當(dāng)Pd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液用量不小于2.00 mL時,體系的吸光度較大且基本保持不變。因此,試驗選擇Pd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量為2.00 mL。

2.4 反應(yīng)溫度的選擇

試驗考察了不同反應(yīng)溫度(10,20,30,40,50,60,70,80℃)對體系吸光度的影響。結(jié)果顯示:當(dāng)反應(yīng)溫度小于30℃時,吸光度隨反應(yīng)溫度的增大而增大;當(dāng)反應(yīng)溫度為30℃時,吸光度較大且穩(wěn)定;當(dāng)反應(yīng)溫度大于30℃時,由于絡(luò)合物在高溫下發(fā)生部分解離,吸光度隨反應(yīng)溫度的增大而減小。因此,試驗選擇反應(yīng)溫度為30℃,即在室溫下進(jìn)行反應(yīng)。

2.5 放置時間的選擇

按照試驗方法配制溶液,考察了放置5,10,20,40,60,80,100,120 min時體系吸光度的變化。結(jié)果顯示:120 min內(nèi)體系的吸光度基本保持不變,因此配制好溶液后,靜置5～10 min即可進(jìn)行測定。

2.6 試劑加入順序的選擇

試驗考察了Pd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液、硫普羅寧標(biāo)準(zhǔn)溶液、乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH 5.0)等3個試劑的加入順序?qū)w系吸光度的影響。結(jié)果顯示:試劑加入順序?qū)ξ舛扔休^大影響,當(dāng)加入順序為Pd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液、硫普羅寧標(biāo)準(zhǔn)溶液、乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH 5.0)時,體系的吸光度較大,Pd2＋與硫普羅寧絡(luò)合后,加入的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH 5.0)進(jìn)一步促進(jìn)絡(luò)合物的穩(wěn)定;當(dāng)加入順序為硫普羅寧標(biāo)準(zhǔn)溶液、Pd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液、乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH 5.0),或者是乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH 5.0)、硫普羅寧標(biāo)準(zhǔn)溶液、Pd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液時,體系的吸光度較小且絡(luò)合物的穩(wěn)定性較差;當(dāng)加入順序為乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH 5.0)、Pd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液、硫普羅寧標(biāo)準(zhǔn)溶液時,由于Pd2＋優(yōu)先與乙酸-乙酸鈉絡(luò)合,消耗了大量的Pd2＋,未形成硫普羅寧-Pd2＋絡(luò)合物,幾乎未檢測到吸光度。因此,試驗選擇試劑的加入順序為Pd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液、硫普羅寧標(biāo)準(zhǔn)溶液(或待測樣品溶液)、乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH 5.0)。

2.7 干擾試驗

以40.00 mg·L-1硫普羅寧標(biāo)準(zhǔn)溶液為分析對象,考察了藥片賦形劑及一些常見離子的干擾情況。結(jié)果表明:在±5%的相對誤差范圍內(nèi),800倍的葡萄糖,300倍的乳糖,150倍的硬脂酸、Ca2＋,100倍的淀粉,50倍的糊精、Mg2＋對硫普羅寧的測定無干擾。

2.8 反應(yīng)機(jī)理的探討

采用摩爾比法確定硫普羅寧和Pd2＋的配位比。按照試驗方法測定不同物質(zhì)的量比(n硫普羅寧∶nPd2＋)下體系的吸光度,結(jié)果見圖2。根據(jù)公式(1)、(2)計算絡(luò)合物穩(wěn)定常數(shù)K穩(wěn)和解離度α。

式中:M為Pd2＋;L為硫普羅寧;cM為Pd2＋濃度,1.88×10-4mol·L-1;A為硫普羅寧與Pd2＋物質(zhì)的量比為2∶1時絡(luò)合物的吸光度,0.998;Amax為圖2曲線中兩切線交點處的吸光度,1.000。由于絡(luò)合物發(fā)生部分分解,故A＜Amax。

計算得α＝0.002,K穩(wěn)＝8.82×1014。由圖2可知,在pH 5.0溶液中,硫普羅寧與Pd2＋形成了物質(zhì)的量比為2∶1的絡(luò)合物。

圖2 硫普羅寧與Pd2＋在不同物質(zhì)的量比下體系的吸光度Fig.2 Absorbance of system with tiopronin and Pd2＋at different molar ratios

2.9 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

移取適量的硫普羅寧標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,配制成質(zhì)量濃度分別為0.20,9.80,19.60,29.40,39.20,49.00,60.00 mg·L-1的硫普羅寧標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。按照儀器工作條件進(jìn)行測定,以硫普羅寧的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示:硫普羅寧的質(zhì)量濃度在0.20～60.00 mg·L-1內(nèi)與其對應(yīng)的吸光度呈線性關(guān)系,線性回歸方程為A＝2.250×10-2ρ＋0.107 3,相關(guān)系數(shù)為0.999 1,摩爾吸光系數(shù)為5.27×103L·mol-1·cm-1。

測定11次空白溶液的吸光度,計算測定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(s),以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差與線性回歸方程斜率(k)的比值計算檢出限(3s/k),結(jié)果為0.003 5 mg·L-1。

2.10 精密度和回收試驗

分別移取0.80 mL 3個不同品牌的樣品儲備溶液,用水稀釋10倍后進(jìn)行加標(biāo)回收試驗,計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表1。

表1 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝5)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

結(jié)果顯示,回收率為98.0%～103%,RSD為0.83%～3.5%。

2.11 樣品分析

按照試驗方法移取1.60 mL樣品儲備溶液,用水稀釋10倍后進(jìn)行測定,結(jié)果見表2。

表2 樣品分析結(jié)果(n＝5)Tab.2 Analytical results of the samples(n＝5)

結(jié)果顯示,3個樣品的測定值與其標(biāo)示量基本一致。

2.12 方法比對

將本法與其他UV-Vis測定硫普羅寧所得結(jié)果進(jìn)行比對,結(jié)果見表3。

表3 方法比對結(jié)果Tab.3 Method comparison results

由表3可知,本法具有更寬的線性范圍和較低的檢出限。

在弱酸性環(huán)境中,硫普羅寧可與Pd2＋以2∶1的物質(zhì)的量比形成穩(wěn)定的絡(luò)合物,該絡(luò)合物在345 nm處有特征吸收,且吸光度與硫普羅寧的質(zhì)量濃度成正比。據(jù)此,本工作提出了UV-Vis間接測定硫普羅寧含量的方法,與其他方法比對,該方法簡單、快速、毒性小、成本低、易推廣,具有一定的實用性。